Pembuatan Apusan Darah Filariasis

Befani Adhitya Febriana S.Tr.Kes

VIDEO 1
Tujuan
Untuk mengetahui cara pemulasan apusan
darah dengan pewarnaan giemsa
Prinsip
Sewaktu pemulasan apusan darah,
hemoglobin dalam eritrosit melarut
(dehemoglobinisasi) dan tertarik oleh air
dalam larutan pewarna. Komponen yang
tertinggal adalah parasit dan leukosit, dapat
diamati di bawah mikroskop.
Diagnosis Parasitologi
Ditemukan mikrofilaria dan cacing
dewasa
Mikrofilaria dapat ditemukan di dalam
darah, urin dan cairan hidrokel
Cacing dewasa dapat ditemukan di dalam
kelenjar/saluran limfe inang definitnya
Sampel
Waktu pengambilan spesimen darah harus disesuaikan dengan gejala klinis dan riwayat perjalanan pasien.

 Periodik nokturna : bila kepadatan mf ditemukan tinggi pada malam hari dan hampir tidak ada pada
siang hari
 Subperiodik nokturna : mf ditemukan sepanjang hari yg kepadatan mfnya lebih banyak pada malam hari
dibandingkan siang hari
 Nonperiodik : Mf ditemukan sepanjang hari, baik pada siang hari maupun pada malam hari dg volume
yg hampir sama
 Pemeriksaan mikrofilaria darah mutlak dilakukan, sedikitnya, terhadap satu spesimen "darah siang"
(diambil sekitar jam 13.00) dan satu spesimen "darah malam" (diambil sekitar jam 24.00). Spesimen-
spesimen tersebut umumnya·cukup untuk mendeteksi infeksi campur dan infeksi galur subperiodik.
 Idealnya harus diperiksa segera, kalau sampel “darah malam” tdk akan diperiksa hingga pagi berikutnya,
simpan sampel pada suhu kamar.
 Masukkan 5-10 ml darah dalam lar trinatrium sitrat 2% dalam saline atau antikoagulan heparin
 Didaerah endemik filariasis, sampel darah kapiler saja sudah memenuhi syarat utk pemeriksaan Mf
Meskipun Mf tdk meyebabkan infeksi secara langsung thd manusia, semua spesimen patologis harus
diperlakukan sbg bahan infeksius.
Metode ini akan dapat mengindentifikasi adanya Mf Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Brugia timori
Alat dan bahan
 Alat

Mikroskop

 Bahan
 Slide/Kaca sediaan (Object Glass)
1. Slide yang sudah tergores tidak boleh dipakai. Yang terbaik adalah
menggunakan object glass yang baru, dan tidak boleh menggunakan
slide bekas pakai. Semua object glass direndam dalam air sabun selama 30
menit – 1 jam kemudian dibilas dengan air mengalir.
2. Membersihkan object glass : Dilap dengan kasa atau kain bersih.
Setelah kaca sediaan dibersihkan, tidak boleh memegang pada bagian
permukaan kaca sediaan, dan langsung dipakai atau disimpan pada slide
box.
3. Menyimpan object glass : Slide box yang dianjurkan adalah terbuat dari
bahan plastik/fiber yang tahan pecah. Slide box sebaiknya tidak terbuat
dari bahan kayu karena dapat berpengaruh pada SD yang disimpan.
Ketebalan object gelas 1,1 – 1,3 mm, ukurannya 25 x 75 x 1 – 1,5 mm.
Alat dan bahan
 Lancet steril, digunakan hanya untuk 1x pakai.
 Kapas, jika tidak tersedia kapas, dapat digunakan bahan halus.
 Alkohol 70 %, lebih baik lagi jika menggunakan swab alkohol siap
pakai.
 Minyak imersi (immersion oil)

1. Uji kekentalan : dapat dilakukan dengan memasukkan batang

pengaduk kedalam wadah berisi minyak imersi. Angkat batang
pengaduk, dan amati. Jika minyak imersi masih menempel pada batang
pengaduk dan menetes lambat maka kualitas minyak imersi masih baik.
2. Uji kekeruhan : Amati ada tidaknya kekeruhan minyak imersi
pada
wadah transparan. Bila terlihat keruh maka kualitas minyak imersi
sudah berkurang.
3. Perubahan warna : Amati ada tidaknya perubahan minyak imersi
pada wadah transparan. Bila terjadi perubahan warna (kekuningan)
maka kualitas minyak imersi sudah berkurang.
Alat dan bahan
- Larutan buffer (pH 7.2)
Larutan buffer dapat dibuat dengan cara mencampurkan
satu tablet buffer (pH 7,2) dalam 1 liter aquades atau air
mineral (air kemasan dalam botol) yang jernih, tidak
berbau dan tidak berasa. Larutan ini dapat dipakai untuk
mengencerkan larutan giemsa stock.

- Uji pH Larutan buffer

1. Dengan kertas lakmus
2. Dengan pH indikator
3. Dengan pH meter, larutan buffer yang digunakan
memiliki pH 7,2
Alat dan bahan
- Larutan Giemsa
Beberapa hal yang harus diperhatikan :
1. Giemsa stok harus disimpan dalam botol kaca berwarna gelap dan
hindari dari sinar matahari langsung.
2. Sebaiknya giemsa stok disimpan dalam botol berwarna gelap
berukuran 100 ml. Hal ini untuk menghindari rusaknya giemsa stok
karena oksidasi dan penguapan akibat seringnya membuka tutup botol.
3. Botol giemsa stok yang akan digunakan tidak boleh dikocok atau
diaduk karena endapan/kristal giemsa akan naik ke permukaan
larutan dan dapat menjadi artefak dalam SD yang diwarnai.
4. Pengambilan giemsa stok harus menggunakan pipet yang kering,
agar giemsa stok di botol tidak tercemar dengan air.
5. Sisa larutan giemsa yang telah dicampur dengan larutan buffer bila
tidak digunakan lagi harus dibuang.
6. Larutan giemsa dibuat segera sebelum digunakan dan tidak
boleh disimpan/digunakan setelah 1 jam.
Alat dan bahan
 Uji Kualitas Giemsa
Ada dua cara menguji mutu giemsa untuk mengetahui apakah giemsa stok yang akan
digunakan masih baik :
1) Melakukan pewarnaan pada 1-2 SD, kemudian diperiksa di bawah mikroskop.
Kalau hasilnya sesuai dengan kriteria standar pewarnaan yang baik, berarti giemsa
pengencernya masih bagus dan dapat digunakan. Pengujian seperti ini perlu dilakukan
setiap kali akan melakukan pewarnaan masal.
2) Melakukan test menggunakan kertas Whatman no.2 dan metanol (metil alkohol) :
• Letakkan kertas saring diatas gelas atau petridisk/cawan petri supaya bagian tengah kertas
tidak menyentuh sesuatu.
• Teteskan 1-2 tetes giemsa stok pada kertas saring. Tunggu sampai meresap dan
menyebar.
• Kemudian teteskan 3-4 tetes metanol absolut di tengah bulatan giemsa perlahan dengan
jarak waktu beberapa detik sampai garis tengah giemsa menjadi 5-7 cm, maka akan
terbentuk :
- Lingkaran biru (methilen blue) ditengah
- Lingkaran cincin ungu (methilen azur) diluarnya, serta
- Lingkaran tipis warna merah (eosin) pada bagian tepi.

Giemsa sudah rusak dan tidak boleh dipakai lagi, bila warna ungu atau merah tidak
terbentuk.
Uji Kualitas Giemsa
Alat dan bahan
Metanol
Digunakan untuk Fiksasi sediaan darah tipis.

Uji Kualitas Methanol :

 Salah satu cara uji kualitas adalah dengan
mengukur berat jenis metanol dengan
densitometer (BJ = 0,792 – 0,793).
 Penyimpanan metanol dilakukan dalam
wadah tertutup pada suhu dibawah titik didih
(60˚ C).
Cara Kerja
Video 2
Kesalahan pada pembuatan sediaan darah
Kesalahan pada pembuatan sediaan darah
Pemeriksaan Mikrofilaria
di Dalam Darah
A. Sediaan darah langsung
 Kenakan sarung tangan sebelum memulai proses
 Siapkan kaca slide berlabel yg bersih & bebas lemak, beri label/kode
 Bersihkan ujung jari yg akan diambil darahnya (jari tengah atau jari manis) dg
kapas alkohol & keringkan dg kapas/tissu yg bersih
 Tusuk sisi bagian ujung jari dg menggunakan jarum penusuk yg steril (lancet)
 Tekan jari tersebut dengan lembut dan kumpulkan darah lalu letakkan pada kaca
gelas
 Bersihkan sisa darah pada ujung jari dg kapas dan pasien diminta memegang kapas
tersebut sampai darah berhenti mengalir
 Tambahkan setetes larutan natrium klorida, yang sama banyaknya dengan tetesan
darah tadi, pada kaca objek.
 Campurkan darah dan larutan natrium klorida menggunakan bagian sudut sebuah
kaca objek. Tutup apusan tersebut dengan penutup kaca objek.
 Periksa apusan secara sistematis dengan objektif l0x dan bukaan kondensator
dikecilkan. Kalau memang terdapat mikrofilaria, pertama-tama akan tampak
pergerakan cepat di antara eritrosit.
 Untuk mengidentifikasi spesies mikrofilaria, buat dua apusan pada sebuah
kaca objek lainnya dan warnai apusan
Sediaan darah langsung

Pewarnaan biasanya diperlukan untuk

mengidentifikasi mikrofilaria dalam apusan
darah. Namun, beberapa gambaran pada
apusan darah segar mungkin dapat
memberikan petunjuk mengenai prakiraan
spesies dan patogenisitasnya.
 Sediaan darah langsung

Metode pemeriksaan sangat sederhana,

mudah dan pelaksanaannya cepat
Hasilnya kurang dapat dipercaya karena
memberikan kesalahan hitung jumlah
mikrofilaria
Banyak mikrofilaria yang bergerak ke tepi
deck glass atau beberapa mikrofilaria tidak
terlihat jelas karena adanya penggumpalan
darah
 B. Sediaan darah tebal
 Setiap orang yang akan melakukan pemeriksaan perlu mengisi Formulir Survei Darah Jari,
yaitu dicatat Nomor Urut, Nama, Umur dan Jenis Kelamin, dan Kode Sediaan.
 Obyek glass yang sudah bersih dari lemak dan kotoran, diberi nomor dengan spidol
waterproof sesuai dengan Kode Sediaan yang telah ditetapkan dalam Formulir Survei Darah
Jari.
 Pilih salah satu ujung jari tangan kedua, ketiga atau keempat, bersihkan dengan kapas
alkohol 70 %, dan ditunggu sampai kering.
 Setelah kering, ujung jari tangan orang tersebut ditusuk dengan lanset, tegak lurus alur garis
jari tangan, sehingga darah menetes keluar (dengan penekanan ringan)
 Tetesan darah pertama yang keluar dihapus dengan kapas kering, kemudian tetesan darah
selanjutnya diteteskan sebanyak tiga tetes (diperkirakan 60 μL) pada kaca benda yang sudah
disiapkan.
 Selanjutnya tetesan darah tersebut dilebarkan, dengan menggunakan salah satu ujung kaca
benda lain, sehingga membentuk Spesimen Darah Jari tebal, yg berbentuk tiga garis
paralel (masing masing-masing berukuran 0,5 x 4 cm atau 20μl) atau satu oval berukuran 1
x 2 cm (60 μl).
 Kaca benda dipegang pada tepi atau pada sudutnya, sehingga permukaan kaca benda tetap
bersih.
 Spesimen Darah Jari tersebut dikeringkan selama 24 – 72 jam pada suhu kamar
dengan menyimpannya di slide box dan diletakkan pada tempat yang aman dari semut,
kecoa dan lain-lain.
SDJ

 Darah yang keluar diambil dengan menggunakan pipet

kapiler volume 60 μL dan diteteskan pada kaca benda
menjadi tiga tetesan dan dilebarkan dengan
menggunakan ujung kaca benda yang lain sehingga
membentuk spesimen darah tebal yang berbentuk tiga
garis paralel (masing-masing berukuran 0,5x4 cm/20μl).

Keterangan Gambar:
1A : tetesan darah untuk pembuatan sediaan bentuk
parallel memanjang
1B : sediaan darah bentuk parallel (volume @ 20μL)
Sediaan darah tebal
 Yang perlu diperhatikan dalam pelaksanaan SDJ:
 satu lanset hanya dipakai untuk satu orang
 selama proses pengambilan darah, pemeriksa harus
memakai sarung tangan.
 Pemeriksaan ini murah, dapat dipakai untuk mengidentifikasi
mikrofilaria dan paling sering dipakai dilapangan.
 Kelemahan pemeriksaan ini yaitu kadang- kadang ada
mikrofilaria yang hilang pada proses hemolisis dan
pewarnaan. Namun kelemahan tersebut dapat diatasi dengan
menggunakan object glass yang bersih dan mengeringkan
darah pada object glass selama lebih dari 12 jam.
Teknik Pembuatan Larutan Giemsa
Untuk membuat larutan Giemsa dibutuhkan
cairan buffer pH 7,2.
Cairan buffer dengan pH 7,2 dibuat melalui
cara yaitu melarutkan 1 tablet buffer forte ke
dalam 1000 ml air jernih dan bersih. Cairan
buffer ini bisa juga diganti dengan air mineral
yang mempunyai pH 7,2.
Selanjutnya larutan Giemsa dibuat dengan
melarutkan cairan Giemsa dengan cairan
buffer Ph 7,2 dengan perbandingan 1 : 20
Teknik pewarnaan sediaan darah
Sediaan darah diwarnai setelah
dikeringkan selama 24-48 jam (± 30 jam)
3 tahap pewarnaan :
1. Dehemoglobinasi (hemolisa)
2. Fiksasi dg metanol ½-1 menit
3. Pewarnaan dg Giemsa 5% selama 30
menit
Pewarnaan sediaan darah
1. Dehemoglobinasi (hemolisa)
• Sediaan dihemolisa dengan merendam dalam
aquades
• Susun sediaan di rak pewarnaan rendam
dalam baskom yang berisi aquades sampai
sediaan darah berwarna putih susu (5-10’)
• Angkat rak pewarnaan dari baskom, tunggu
kering (30’)
Pewarnaan sediaan darah
2. Fiksasi
 Fiksasi dg mencelupkan (2-3”) satu demi satu sediaan dg metanol
 Susun kembali dalam rak pewarnaan, tunggu kering (10’)

Fiksasi tersebut harus dilakukan setelah sediaan kering supaya

tidak menimbulkan latar belakang warna biru
Fiksasi dg metanol untuk merekatkan apusan darah tepi sehingga
tidak terkelupas, serta menghentikan proses metabolisme tanpa
mengubah keadaan (struktur) sel
Fiksasi juga berfungsi supaya apusan darah dapat menyerap warna
dengan sempurna
Lar fiksasi yg tidak baik akan menyebabkan perubahan morfologi
sel dan perlekatan yg tidak baik.
Teknik pewarnaan sediaan darah
Sediaan Darah Jari diletakkan berjajar di tempat
yang datar (meja, lantai, papan, atau
pelepah/batang pisang)
Spesimen Darah Jari tersebut diwarnai dengan cara
ditetesi larutan Giemsa sampai semua permukaan
sediaan tergenang larutan Giemsa (kurang lebih 20
tetes) dan didiamkan selama 30 menit.
Kemudian Spesimen Darah Jari dibilas dengan air
bersih dan dikeringkan dalam suhu kamar selama
30 menit (24-72 jam).
Setelah kering, Sediaan Darah Jari disusun dan
disimpan dalam slide box.
Harus selalu pakai larutan Giemsa yang
baru diencerkan
Pewarnaan Giemsa

 Biasanya menggunakan pengenceran 1:50 dari stok

giemsa dan diwarnai selama 50 menit. Sebagai patokan,
jika inti sel darah putih telah terwarnai dengan benar,
mikrofilaria seharusnya juga demikian.
 Perlu dicatat bahwa pewarnaan giemsa untuk sediaan
yang memeriksa, tidak seperti sediaan pemeriksaan
parasit malaria, pH larutan pewarnaan tidak merupakan
hal yang penting.
 Secara umum warna sediaan dapat berkisar dari merah
muda ke ungu dan biru, tergantung pada pH, tetapi
mikrofilaria akan terwarnai dengan baik tanpa
memandang warna.
Pemeriksaan mikroskopis
 Pertama-tama, cari mikrofilaria dengan objektif 10X.
 Perhatikan obyek yg menyerupai cacing
 Mikrofilaria ditandai dengan

1. Terdapat inti badan yang jelas

2. Terdapat sarung (sheat) berwarna merah jambu pada
B. malayi atau bening pada W. bancrofti dan B. timori
 Selanjutnya, identifikasi spesies filaria dengan objektif
40X
 dan 100X dimulai dengan meneteskan minyak imersi
pada permukaan apusan darah untuk menjernihkan
tampilan pada mikroskop. Pemeriksaan dilakukan pada
20X lapang pandang.
VIDEO 3,4,5
Hasil
 Dengan mikroskop cahaya, mikrofilaria tampak (setelah pewarnaan yang tepat)
menyerupai organisme primitif, berbentuk serpetin (berlekuk seperti ular), sering
kali bersarung, dan terisi oleh banyak sel berinti
 Tidak semua spesies memiliki sarung. Pada spesies-spesies yang bersarung, sarung
tersebut sedikit atau jauh lebih panjang dari badannya. Pada beberapa spesies,
bergantung pada pewarnaan yang dipakai, sarung terwarnai khas; warna khas
sarung ini membantu identifikasi·spesies
 Inti-inti sel yang mengisi badan biasanya terwarnai gelap, mungkin berkelompok
atau lersebar
 Ujung anterior ditandai dengan tidak adanya inti, dan dinamakan ruang sefalik atau
ruang kepala; bagian ini mungkin pendek, mungkin juga panjang.
 Kalau Anda mengamati mulai dari ujung anterior sampai ke ujung posterior badan,
Anda akan menemukan ruang dan sel tambahan, yang berfungsi sebagai patokan
anatomis. Ruang dan sel tambahan ini meliputi cincin sanif, lubang ekskretorik, sel
ekskretorik, dan lubang anus. Pada beberapa spesies, dapat terlihat suatu massa
amorl, dinamakan badan dalam, dan empat sel kecil (dinamakan sel rektal).
Beberapa di antara struktur-struktur ini, beserta letaknya, bermanfaat untuk
pengidentifikasian spesies. Karakteristik lain, yang berguna untuk
pengidentifikasian spesies, meliputi bentuk ekor dan ada-tidaknya inti pada
ekor tersebut.
Hasil
Catatan:
 Kadang-kadang, mikrofilaria'Brugia malayi galur periodik terlepas dari
sarungnya.
 Identifikasi spesies merupakan suatu hal yang cukup sulit dan
kesalahan--kesalahan kerap kali terjadi.
 Petunjuk pengidentifikasian mikrofilaria yang disajikan di atas dan
dalam buku-buku teks membuat identifikasi tampaknya mudah untuk
dilakukan.
 Kadang-kadang, sarung sulit terlihat. Pada kasus lain, inti tidak
menempati posisi khasnya di ujung ekor.
 Pemeriksaan beberapa mikrofilaria dengan teliti sebaiknya dilakukan
sebelum menentukan spesies mikrofilaria tersebut. Kalau pemeriksaan
sistematik sudah dilakukan untuk mengamati semua karakteristik
yang diuraikan di atas, spesies dapat diidentifikasi secara lebih tepat.
Identifikasi tidak boleh berpatokan pada satu karakteristik saja, tetapi
harus memperhatikan semua karakteristik sekaligus.
Teknik pemeriksaan sediaan darah jari

(1) Menentukan Kepadatan Mikrofilaria

 Sediaan diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran rendah (10 x 10).
 Jumlah mikrofilaria yang tampak pada seluruh lapanganpandang dihitung dengan cara
menggeser sediaan.
 Dimulai dari tepi paling kiri, digeser ke kanan sampai pinggir sediaan. Kemudian diturunkan pada
lapangan pandang berikutnya dan digeser ke arah sebaliknya sampai ke pinggirnya lagi.
Begitu seterusnya sampai seluruh lapangan sediaan diperiksa kepadatan Rata-Rata Mikrofilaria.
 Kepadatan Rata-Rata Mikrofilaria dari hasil Survei Darah Jari di satu desa adalah angka
rata-rata mikrofilaria per mililiter darah, yaitu dengan menjumlahkan semua mikrofilaria
yang ditemukan pada semua sediaan, dibagi dengan jumlah orang yang sediaannya positif
mikrofilaria dikalikan faktor pengali.

Jumlah dan jenis mikrofilaria yang ditemukan dicatat pada tepi kaca benda dan pada formulir Survei
Darah Jari (Formulir SDJ) sesuai dengan Kode Sediaan yang ditulis pada tepi kaca benda
1+5+8+30+28 = 72
72/5 X 16,7 = 240,48
Menghitung Angka Mikrofilaria Rate
CONTOH SOAL :
Dimana jumlah Sediaan Darah Jari
diperiksa berjumlah 300 slide jumlah
sediaan Darah Jari positif mikrofilaria
berjumlah 15 slide, maka Mf Rate …. ?
15/300 x 100% = 5 %
Menghitung Angka Mikrofilaria Rate

 Angka Mikrofilaria Rate bisa dihitung dengan cara

membagi jumlah penduduk yang sediaan darahnya positif
mikrofilaria dengan jumlah sediaan darah yang diperiksa
dikali 100 %.
 Secara umum, apabila Mf Rate > 1 % di salah satu atau
lebih lokasi survei (desa), maka kabupaten/kota tersebut
ditetapkan sebagai kabupaten/kota endemis Filariasis, yang
harus melaksanakan kegiatan Pemberian Obat Pencegahan
secara Massal (POPM) Filariasis.
 Apabila Mf Rate <1 % pada semua lokasi survei desa, maka
kabupaten/kota tersebut ditetapkan sebagai daerah non
endemis filariasis dan melaksanakan pengobatan selektif,
yaitu pengobatan hanya diberikan pada penderita yang
positif mikrofilaria.
Kemungkinan penyebab kesalahan
idenfifikasi
Ekor yang terpotong atau terlipat. Kalau
ekor Wucheren'a bancrofti terpotong atau
terlipat (Gbr. 4.129), inti-inti tampak
melampaui ujung ekor, seperti ekor Loa loa.
Kemungkinan penyebab kesalahan
idenfifikasi
 Sarung yang sobek atau tidak berwarna. Sarung kadang-kadang sobek atau hampir tidak
berwarna. Pada Loa loa, misalnya, sarung tampak sebagai ruang tidak berwarna di antara
ekor dan sel-sel darah.
 Mikrofilaria yang besar atau kecil seeara tak-Iazim. Beberapa Mansonella perstans
ukurannya sangat panjang (mis., 200 um), dan beberapa Wuchereria bancrofti dan Loa
loa ukurannya pendek (mis., 250 um) .
 Apusan (atau pulasan) yang kualitasnya buruk. Kalau apusan (atau pulasan) rusak
sewaktu dibuat, Wuchereria bancrofti mungkin tampak terlipat dan beberapa lekukan
mungkin tampak pada badan Loa loa.
 Negara asal pasien. Negara asal pasien atau riwayat bepergian ke luar negeri baru-baru
ini har:us selalu ditanyakan.
Kalau pasien berasal dari:
 Kamerun, Nigeria bagian timur atau daerah lembah sungai di Republik Demokrasi
Kongo, parasit tersebut mungkin Loa loa;
 Ghana, India, Senegal, atau Hindia Barat, parasit tersebut mungkin Wuchereria bancrofti;
 Thailand, parasit tersebut mungkin Brugia malayi;
 Guyana, parasit tersebut mungkin Mansonella ozzardi.
 Pemeriksaan memakai pulasan tipis. Identifikasi mikrofilaria pada pulasan tipis tidak
direkomendasikan; mikrofilaria akan menyusut, rusak, sehingga sukar dikenali.
TRiMS