PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Blok 21 Kedokteran Tropis – PSPD

Pemeriksaan Bakteri Tahan Asam
 Pemeriksaan Bakteri Tahan Asam
a. Mycobacterium Patogen alam dan Non Patogen sekitar kita
b. Mycobacterium patogen : M. Tbc dan M.non –tbc lepra,
intraseluler HIV AIDS.
c. Cara Pengambilan sampel pemeriksaan
d. Cara pembuatan preparat apus → Pengecatan
e. Pemeriksaan Mikroskopis : Cat ZN
f. Pemeriksaan Kultur M.tbc.
g. Cara persiapan sampel untuk kultur ; Media Selektif
untuk kultur
h. Pemeriksaan Kultur : Ciri-ciri Makroskopis
 Mycobactreria

• Mycobacteria adalah bakteri batang aerob

dan tidak membentuk spora
• Acid fast Bacilli (AFB) → Bakteri yang
tahan terhadap
decolorization oleh asam & alkohol
• Mycobacteium tuberculosis penyebab Tuberculosis
dan merupakan patogen yang penting pada
manusia
Mycobacteria Infect Human
Cara Pengambilan sampel pemeriksaan
Sampel Pemeriksaan :
Sputum, LCS, Cairan sendi, jaringan/biopsi, bilas lambung dll

Cara Pengambilan sampel pemeriksaan

SPUTUM SAMPLING
Tuberculosis Suspect Patient
 THE AIM

• Obtain eligible sputum specimen to determine

the etiology of lower respiratory tract infection
• The microorganism will be identified by microscopic
examination

• Dapatkan spesimen dahak yang memenuhi syarat

untuk menentukan etiologi infeksi saluran pernapasan
bawah
• Mikroorganisme akan diidentifikasi dengan
pemeriksaan mikroskopis
 REQUIREMENT

• Sputum should really come from lungs and must be

collected correctly
• Equipment :
Pot with wide opening and the lid/cover can be
tightly closed, with minimal volume 25 ml
• Sputum harus benar-benar berasal dari paru-paru dan harus dikumpulkan
dengan benar
• Peralatan :
Panci dengan bukaan lebar dan tutup/penutup dapat ditutup rapat, dengan
volume minimal 25 ml
 Ideal
Sputum
Pot
 Procedure of Sputum Sampling
• 3-time sampling :SPS ( random on the 1st day, morning 2nd
day & random on the 2nd day)
• Collect the specimen in outdoor so that an infectious droplet can
be diluted good ventilation
• Ask the patient to close her/his mouth when coughing
• Don’t stand in front of the patient when collecting the
specimen, duduk,
• Tarik napas 123, dahak dikeluarkan , ditaruh dipot

• Sampling 3 kali : SPS ( random di hari pertama, pagi hari ke-2 & random di hari ke-2)
• Kumpulkan spesimen di luar ruangan sehingga droplet infeksius dapat diencerkan
dengan ventilasi yang baik
• Minta pasien menutup mulutnya saat batuk
• Jangan berdiri di depan pasien saat mengambil spesimen
 Procedure of Sputum Sampling
Don’t Collect the sputum at these places :
• Laboratory room
• Toilet/ Rest room
• Waiting room
• Registration room
• Rooms with bad ventilation
• Ruang laboratorium
• Toilet/Ruang istirahat
• Ruang tunggu
• Ruang pendaftaran
• Kamar dengan ventilasi yang buruk

POJOK SPUTUM
 Procedure Sputum Sampling
• Complete the identity form

• Give label of the patient’s name and date of

sampling: on the side of pot; not the lid.

• The patient must be explained that a good specimen is the sputum coming
from the lungs, not a secrete from nose/mouth
• If the patient uses prosthetic teeth, it must be put off and then gargle with water

• Lengkapi formulir identitas

• Beri label nama pasien dan tanggal
pengambilan sampel: di sisi pot; bukan tutupnya.
• Pasien harus dijelaskan bahwa spesimen yang baik adalah sputum yang berasal dari
paru-paru, bukan sekret dari hidung/mulut
• Jika pasien menggunakan gigi palsu, harus dicabut dan kemudian berkumur dengan
air
SPUTUM SAMPLING TECHNIQUE
SPUTUM SAMPLING TECHNIQUE
 Sampling Instruction
• Patient stand up or sit down upright
• Take a breath deeply 2 -3 times and every blow the breath strongly
• Cough strongly from the inside of chest
• Put the opened pot near the mouth and then put the sputum to the pot
• Close the pot tightly

• Pasien berdiri atau duduk tegak

• Tarik nafas dalam-dalam 2 -3 kali dan setiap hembuskan nafas dengan kuat
• Batuk kuat dari dalam dada
• Letakkan pot yang sudah terbuka di dekat mulut kemudian masukkan dahak
ke dalam pot
• Tutup panci dengan rapat
 Sampling Result
Good specimen, If :
• Mucous
• Purulent
• Mixed with blood
Bad specimen If :
• Watery
• Bubbling

Spesimen yang baik, Jika :

• Lendir , lengket seperti lem
• Purulen, lem kekuningan
• Bercampur dengan darah

Spesimen buruk Jika :

• Berair
• Gelembung
 CONTOH SPUTUM SAMPLE
Be not disgusted with the sputum sample!
SAMPLE SPECIMEN
 Rejected Sampling

• Broken Pot
• Watery Specimen
• Data on the pot isn’t match with the formulir
• Specimen with preservatives
• Specimen is collected in the tissue paper
• Pot Rusak
• Spesimen Berair
• Data pot tidak sesuai dengan formulir
• Spesimen dengan pengawet
• Spesimen dikumpulkan di kertas tisu
 Cara pembuatan preparat apus →
Pengecatan

Sampel sputum dioleskan pada obyek glass dan

diratakan membentuk bulat ellips dengan ukuran
diameter 3 – 4 cm
Terkait hasil mikroskopik, Tarik ujung 100 lapang pandang mikroskopik, untuk
mngidentifikasi kepositifan
 Komposisi Cat ZN
• Cat ZN A ( Merah)
Basic fuschin 0,3 gr, Alkohol 95% 10 ml, fenol
5ml, akuades 95ml
• Cat ZN B ( tidak berwarna)
Asam klorida pekat 3ml, etil alkohol 95% 97
ml
• Cat ZN C ( Biru)
Metilen biru 0,6ml, akuades 100ml
 Pengecatan Ziehl Neelsen (ZN)
• Pengecatan Acid fast atau Tahan Asam (BTA)
• Terdapat : Bakteri Tahan Asam ( BTA positif)) dan Bakteri tidak tahan asam
( BTA negatif)
• BTA (+) : setelah diberi cat utama ( ZN A) akan tahan terhadap pencucian
dengan asam dan alkohol ( ZNB), sehingga tidak mengikat cat penutup
(ZN
C) → bakteri berwarna merah
• BTA (-) : Cat utama akan dilunturkan oleh asam dan alkohol , selanjutnya
akan mengikat cat penutup → Bakteri biru
• Sifat tahan asam oleh karena adanya asam mikolat yang terikat pada
dinding sel bakteri
• Dinding bakteri BTA (+) : Peptidofglikan, arabinogalaktan dan lipid. 50%
lipid adalah asam mikolat
METODE PEWARNAAN ZIEHL-
NEELSEN

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 23

 Prinsip pewarnaan ZN

• M. tuberculosis mempunyai lapisan dinding lipid

(Mycolic acid) yang tahan terhadap asam.
• Proses pemanasan mempermudah masuknya Carbol Fuchsin
ke dalam dinding sel.
• Dinding sel tetap mengikat zat warna Carbol
Fuchsin walaupun didekolorisasi dengan asam
alkohol.
Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 24
 Peralatan Pewarnaan Ziehl Neelsen

• Rak pewarnaan
• Pinset/ Penjepit kayu
• Air mengalir/ botol semprot air
• Lambu spritus/ sulut api / LPG
• Rak pengering
• Pengatur waktu
• Reagensia ZN
Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 25
 Pewarnaan
• Atur sediaan diatas rak
jangan terlalu rapat,
buat jarak

Tuangkan Carbol Fuchsin 0,3%

hingga menutupi sel
uruh permukaan sediaan

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 26

 Pemanasan
•Panaskan sediaan
dengan api sampai
keluar uap (jangan
sampai mendidih),
dinginkan selama
minimal lima
menit

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 27

 Pencucian

• Buang CF perlahan-
lahan satu per satu

 Bilas dengan air

mengalir mulai dari
frosted

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 28

 Dekolorisasi
• Tuangkan Asam alkohol
3% sampai tidak tampak
warna merah

 Bilas dengan air

mengalir

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 29

 Pewarnaan Latar

• Tuangkan 0.3% methylene

blue hingga menutupi
seluruh sediaan dan
biarkan 10-20 detik

 Buang MB satu per

satu sediaan

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 30

 Pencucian

• Bilas dengan air

mengalir

Keringkan sediaan
pada rak pengering

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 31

Kualitas Pewarnaan Ziehl Neelsen
Pewarnaan yang baik

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 32

Kualitas Pewarnaan Ziehl Neelsen
Pewarnaan yang jelek

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 33

PEMBACAAN SEDIAAN DAHAK

Penggunaan mikroskop

•Gunakan lensa objektif 10X

untuk menentukan fokus

•Teteskan minyak imersi 1 tetes

- Putar lensa objektif 100X

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 34

 Interpretasi

• Sel Tahan Asam akan berwarna merah

muda, karena menyerap carbol fuschion
dengan bantuan pemanasan
• Sel Non Tahan Asam (bakteri yang tidak memiliki
dinding sel lilin) akan berwarna biru.
Karakteristik BTA

Pusat Pelatihan Mikroskopis TB Nasional 36

BTA
 Pemeriksaan mikroskopis
Rekomendasi WHO : Skala IUATLD
• Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang
→ Negatif
• Ditemukan 1 – 9 BTA : tulis jumlah kuman (dalam
100 lp)
• Ditemukan 10–99 BTA : 1 +( dalam 100 lp)
• Ditemukan 1 – 10 BTA dalam 1 lapang pandangan
pd pemeriksaan 50 LP : 2 + ( dalam 50 lp)
• Ditemukan >10 BTA dalam 1 lapang pandang pd
pemeriksaan 20 LP: 3+ ( dalam 20 lp )
 Pemeriksaan Kultur M.tbc.

• Penanganan sampel sputum

• Memperhatikan keamanan kerja laboratorium ( infeksius –
aerosol)
• Sampel dilakukan homogenisasi dan dekontaminasi
 Dekontaminasi dan homogenisasi
• Tuang sputum kedalam tabung sentrifus
• Vorteks sampai homogen
• Diamkan 10 menit
• Tambah aqudest sampai batas tertinggi tabung sentrifus
• Taruh dalam adaptor rotor
• Timbang untuk mencapai seimbang
• Sentrifus 15 menit pada 3000g
• Buang supernatan
• Vorteks sediment sampai homogen
• Diamkan 10 menit
• Tambah aquadest sampai batas tertinggi pada tabung sentrifus
 Dekontaminasi dan homogenisasi (2)

• Taruh dalam adaptor rotor

• Timbang untuk mencapai seimbang
• Sentrifus 15 menit pada 3000g
• Buang supernatant
• Tambah 1 ml PBS pada sediment
• Vorteks sampai homogen
• Diamkan 10 menit
• Sedimen siap untuk dibuat preparat ulang untuk
pewarnaan Ziehl Neelsen dan diinokulasikan ke dalam
botol LJ untuk kultur
Dekontaminasi & homogenisasi cara Kubica (3)

Spesimen dengan preservasi CPC

• Proses spesimen segera setelah sampai LMK
• Sentrifus pada 3000 x g (pada suhu kamar
untuk menghindari presipitasi kontaminan)
• Buang supernatant, resuspensi pellet dengan 2% NaCl
• Sentrifus ulang pada 3000 g (pada suhu kamar
untuk menghindari presipitasi kontaminan)
• Inokulasi pada medium LJ
Dekontaminasi & homogenisasi cara Kubica (4)
Spesimen tanpa preservasi CPC
• Langsung dilakukan digesti dan dekontaminasi dengan metode Petrof
(4% NaOH)
• Campur spesimen sama banyak dengan volume 4% NaOH sehingga didapat
konsentrasi akhir 2% NaOH (untuk sputum, volume yang dianjurkan adalah 4
ml)
• Homogenisasi dengan menggoyangkan pada shaker selama 15 menit, 37°
(bila mungkin)
• Encerkan homogenat dengan aquadest steril untuk mengurangi viskositas
sebelum disentrifus
• Sentrifus 3000 x g selama 15 menit
• Buang supernatan pada tempat pembuangan limbah yang sudah diberi
disinfektan
• Tambahkan 1 N HCl dengan indicator phenol red untuk netralisasi reaksi basa
atau Resuspensi sediment dengan aquadest steril , ulang sentrifus 15 menit
pada 3000 x g
• Inokulasi pada LJ .
 Kultur M.tuberculosis
• Nonselective medium & selective medium
• Selective media : Antibiotics (prevent contamination)
3 general formulation
• Semisynthetic agar media(Middlebrook 7H10 & 7H11)
Large inocula growth for several weeks, observe
colony morphology for succeptibility testing
• Inspissated egg media ( Louwenstein Jenseen)
Small inocula in 3-6 weeks, Malacyt green (inhibit
other bacteria)
• Broth Media (Middlebrook 7H9 dan 7H12)
Support proliferation small inocula, Tweens (water soluble
esters of fatty acids) , permit dispersed growth in liquid
media, more rapid than complex media
• Media nonselektif & media selektif
• Media selektif : Antibiotik (mencegah kontaminasi)
3 formulasi umum
• Media agar semisintetik (Middlebrook 7H10 & 7H11)
Pertumbuhan inokula yang besar selama beberapa minggu,
amati morfologi koloni untuk uji kepekaan
• Media telur inspissated ( Louwenstein Jenseen)
Inokula kecil dalam 3-6 minggu, Malacyt green (menghambat
bakteri lain)
• Media Kaldu (Middlebrook 7H9 dan 7H12)
Mendukung proliferasi inokula kecil, Tweens (ester asam
lemak yang larut dalam air), memungkinkan pertumbuhan
terdispersi dalam media cair, lebih cepat daripada media
kompleks
Koloni M.tuberculosis

Ciri-ciri Koloni :
Kering, berwarna
kuning gading,
seperti remahan
roti
 TUGAS MAHASISWA

1. Mengamati prosedur pembuatan preparat

apus sampel sputum
2. Mengamati prosedur pengecatan ZN
3. Membaca hasil pengecatan dan Interpretasi
hasil
4. Menulis laporan pada lembar kerja
5. Diskusi dengan assisten dosen tentang
follow up pemeriksaan mikroskopis
BTA