PENENTUAN COLIFORM

METODE MPN

1. TEKNIK PENGAMBILAN SAMPEL

A. Hal-hal yang harus diperhatikan :
Hasil analisis laboratorium tidak hanya ditentukan oleh faktor ketelitian dalam
melakukan prosedur analisis di laboratorium, melainkan juga sangat ditentukan oleh
prosedur pengambilan dan penanganan sampel. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam
pengambilan sampel adalah :
Harus ditentukan lokasi sampling yang tepat, agar sampel cukup representatif. Yang
dimaksudkan dengan sampel representatif adalah: benar-benar mempunyai
karakteristik yang mewakili kualitas air dari lokasi di mana sampel tersebut diperoleh.
Botol sampel harus bersih dan steril
Cara pengambilan sampel harus se-aseptik mungkin.
Selama pengambilan sampel tidak perlu dilakukan pembilasan
Sebaiknya botol tidak dipenuhi oleh sampel (biarkan 2,5 cm kosong) agar memudahkan
homogenisasi.

B. Teknik pengambilan sampel

Dari saluran distribusi air minum, bukalah kran semaksimum mungkin dan biarkan
air mengalir selama 2-3 menit. Setelah itu kurangi kecepatan aliran air, sehingga
memungkinkan air tertampung dalambotol sampel tanpa memercik ke luar atau tumpah.
Hindarkan pengambilan sampel darikran bocor atau tidak dapat berfungsi dengan baik.
Dari air sumur, pompalah air dari sumur dan biarkan air mengalir selama 5 menit.
Lalu tampung sampel air seperti prosedur di atas. Apabila tidak tersedia pompa air,
ambillah sampel langsung dari dalam sumur dengan memberikan pemberat pada botol
sampel.
Dari air permukaan, usahakan memilih lokasi sampling di mana terjadi
pencampuran air yang sempurna. Jangan memilih lokasi yang terlalu dekat dengan
tepian sungai. Hindarkan lokasi sampling di mana air tidak mengalir dengan konstan.
Arahkan mulut botol pada posisimelawan arus.

C. Penanganan sampel
Apabila sampel air tidak dapat segera dianalisis dalam waktu 1 jam setelah waktu
pengambilannya, gunakan fasilitas pendingin untuk menyimpan sampel tersebut.
Usahakan agar waktu pengangkutan sampel dalam kotak pendingin ke laboratorium
tidak lebih dari 6 jam. Setiba di laboratorium, masukkan semua sampel ke lemari
pendingin, dan usahakan agar kegiatan analisis dapat selesai dalam waktu 2 jam.

2. PENENTUAN COLIFORM PADA SAMPEL AIR

Metoda penentuan tingkat pencemaran miktoorganisme pada air minum dan air permukaan
yang umum dilakukan pada saat ini adalah teknik membran filter untuk penentuan bakteri
coliform dan coli tinja. Karena sifatnya yang lebih cepat dan lebih reprodusibel, metoda ini lebih
unggul bila dibandingkan dengan metoda Most ProbableNumber, atau MPN. Kelemahan pada
membran filter terletak pada kepekaannya terhadap gangguan yang disebabkan oleh kekeruhan
air. Kekeruhan air yang disebabkan oleh partikel-partikel zat organik yang tinggi dapat
mengganggupertumbuhan koloni mikroorganisme. Selain itu hasil analisis dapat pula terganggu
apabila dalam sampel terdapat zat beracun atau bakteri jenis lain dalam jumlah besar.

A. Metoda membran filter

Metoda ini menggunakan prinsip filtrasi dengan menggunakan membran filter dengan
ukuran porositas 0,45 um. Untuk pengujian air minum diperlukan 100-150 ml, sampelyang
dilewatkan pada membran filter steril (Sampel yang ideal adalah sampel yang dapat
menghasilkan 50 - 200 koloni). Filter yang telah mengandung bakteri selanjutnyaditaruh secara
aseptik pada media steril yang sesuai di dalam cawan petri. Untuk penentuan coliform total
digunakan media M-Endo, sedangkan untuk penentuan baktericoli tinja digunakan media M-
FC. Untuk penentuan coliform total diperlukan suhu inkubasi 35± 0,5o C selama 22-24 jam,
adapun untuk penentuan coli tinja diperlukan waktu inkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu
44,5 ± 0,5 oC.

B. Metoda MPN
Dalam metoda ini terdapat 3 tahap pengujian yaitu :

C. Uji Presumtif (presumptive test)

Tahap ini merupakan uji spesifik terhadap bakteri coliform. Setiap sampel air membutuhkan
15 tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 ml kaldu laktosa dan sebuah tabung Durham
yang terbalik disterilisasi terlebih dahulu. Selanjutnya 5 buah tabung berisi kaldu laktosa diisi
dengan sampel 10 ml air sampel, 5 buat lainnya diisi dengan 1 ml sampel air dan selebihnya
diisi dengan 0,1 ml sampel air
Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 35 ± 0,5oC selama 24 ± 2 jam. Apabila tertdapat
bakteri coliform, maka akan terbentuk gas yang terlihat di dalam tabung Durham.
D. Uji konfirmasi (confirmative test)
Uji ini perlu dilakukan untuk memastikan bahwa pembentukan gas pada tabung
Durham benar-benar dihasilkan oleh aktifitas bakteri coliform. Untuk itu biakan pada
media kaldu laktosa yang memberikan hasil positif diinokulasikan dengan jarum ose ke
dalam tabung reaksi yang berisi media selektif cair Brilliant Green Lactosa Bile Broth
(BGLBB) yang dilengkapi dengan tabung Durham. Kemudian biakan diinkubasipada
suhu dan waktu inkubasi yang sesuai untuk tujuan analisis (penentuan coliform atau coli
tinja) Terbentuknya gas pada tabung Durham menunjukkan uji konfirmasi inipositif.

E. Uji pelengkap (completed test)

Uji ini dilakukan terhadap biakan pada uji konfirmasi yang memberikan hasil positif.
Dengan menggunakan jarum ose, biakan dengan hasil positif tersebut diinokulasikan
pada media Eosine Methylene Blue (EMB) di cawan petri.
Bakteri Escherichia Coli membentuk koloni berwarna gelap dengan kilauan
metalik kehijauan. Sedangkan bakteri coliform lainnya misalnya Enterobacter
aerogenes koloni yang membentuk warna gelap dengan kilau metal diisolasi dan
ditumbuhkan pada media agar miring nutrient broth. Selanjutnya dilakukan uji
pewarnaan gram pada biakan yang berumur 24-48 jam. Apabila diperoleh bakteri
berbentuk batang, gram negatif, maka hasil pengujinan dengan metoda MPN ini positif.
Jumlah biakan pada media BGLBB yang memberikan hasil positif pada uji
pelengkap untuk setiap seri tabung (dengan sampel pada media kaldu laktosa 10 ml, 1
ml, dan 0,1ml) dicatat. Dengan data tersebut, jumlah bakteri coliform atau coli tinja pada
setiap 100 ml sampel air dapat ditentukan dengan menggunakan Tabel Hopkins.

Kelemahan metoda MPN adalah :

- Sampel air yang digunakan hanya sedikit.
- Waktu yang dibutuhkan untuk analisis
cukup lama.
- Jumlah bakteri diperoleh hanya
berdasarkan perkiraan.
- Membutuhkan banyak media dan
peralatan.
- Tidak dapat dilakukan dilapangan.
F. Daftar Pustaka :
Cappuccino, J.G.,N. Sherman. 1983. Microbiology : a. laboratoriuy manual.
Addison-Wesley Publishing Company. 466 halaman.
 LAMPIRAN
PERCOBAAN PENENTUAN COLIFORM METODE MPN
TABEL MPN INDEX