MediBlock

Capturing with Letters

Praktikum Mikrobiologi #2: Pewarnaan Ziehl Neelsen

Pewarnaan Ziehl Neelsen, termasuk pewarnaan tahan asam. Biasanya dipakai untuk mewarnai
golongan Mycobacterium (M. tuberculosis dan M. leprae) dan Actinomyces.
Bakteri genus Mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding selnya mengandung
banyak zat lipid (lemak) sehingga bersifat permeable dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut
bersifat tahan asam (+) terhadap pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan
untuk membantu menegakkan diagnosa tuberculosis.
Pewarnaan ini merupakan prosedur untuk membedakan bakteri menjadi 2 kelompok tahan asam
dan tidak tahan asam.
Bila zat warna yang telah terpenetrasi tidak dapat dilarutkan dengan alkohol asam, maka bakteri
tersebut disebut tahan asam sedangkan sebaliknya disebut tidak tahan asam.

Bahan pemeriksaan TB biasanya berupa sputum yang diambil dari pasien tersangka KP (Koch
pulmonum), tetapi dapat pula diambil dari lokasi lain seperti cairan otak (Liquor Cerebro
Spinalis), getah lambung, urine, ulkus, dll.

Prinsip Pewarnaan

Bakteri tahan asam (BTA) akan memberikan warna merah, sedangkan yang tidak tahan asam
akan berwarna biru.

Cara Pewarnaan Ziehl Neelsen

A. Alat dan Bahan:

1. Object glass
2. Carbol fuchsin 0,3%
3. Alkohol asam 3% (Alkohol + konsentrasi HCl 3%)
4. Methylen-blue 0,3%
5. Air
6. Ose
7. Lampu bunsen/spiritus

B. Cara Membuat Sediaan:

1. Bersihkan objek gelas, beri label
2. Sterilkan ose, dinginkan
3. Ambil 1 ose sputum yang kental (hijau kuning) letakkan diatas objek gelas, ratakan.
4. Sediaan biarkan kering pada suhu kamar.
5. Setelah kering fiksasi denga melewatkkan diatas nyala api sebanyak 3 x, sediaan siap untuk
diwarnai.
C. Cara Pewarnaan ZN:
1. Sediaan dituangi Carbol Fuchsin sampai penuh
2. Panaskan selama 3-5 menit, jangan sampai mendidih
3. Biarkan dingin selama 5 menit, cuci dengan air
4. Dekolorisasi dengan alkohol asam 10-30 detik, cuci dengan air
5. Tuangi dengan methylen blue selama 20-30 detik, cuci dengan air

Tambahan:
Cara pemeriksaan BTA dari sputum dengan oil imersi

1. Teteskan oil imersi pada sediaan sputum lihat pada pembesaran lensa objektif 100x carilah
BTA yang berbentuk batang warna merah.
2. Periksa dengan cara mengeser dan membentuk zig zag dari atas kebawah kemudian ulangi
dengan berlawanan arah.

Pembacaan BTA sputum menggunakan skala IUATLD (International Union Against

Tuberculosis and Lung Diseases)

Tidak ditemukan BTA dalam 100 lp, disebut negatif

Ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lp, ditulis jumlah kuman yang ditemukan
Ditemukan 10-99 BTA dalam 100 lp, disebut + atau (1+)
Ditemukan 1-10 BTA dalam 1 lp, disebut ++ atau (2+)
Ditemukan >10 BTA dlam 1 lp, disebut +++ atau (3+)

Pembiakan M. tuberculosis

 Inkubasi 6-8 minggu

 Pembiakan M. tuberculosis dengan media Lowenstein-Jenses atau Ogawa, lebih sering
Ogawa.
 Tes sensitivitas dengan obat rifampisin, isoniazida, pira zinamida, etambutol,
streptomisin, dll.
 Bisa juga dilakukan tes biokimiawi

koloni M. tuberkulosis
Pemeriksaan BTA Ziehl Neelsen a. Tahap Pra analisis 1) Prosedur tetap cara pengumpulan
dahak. 2) Persiapan pasien Memberikan bimbingan kepada pasien tentang cara pengumpulan
dahak, waktu pengumpulan dahak dan lokasi pengumpulan dahak. 3) Persiapan alat dan bahan.
a) Pot dahak sesuai standar : · bersih dan kering, bermulut lebar (diameter 4-5 cm) · transparan, ·
bening, · bahan kuat, tidak mudah bocor, · bertutup ulir minimal 3 dan dapat menutup rapat b)
Spidol dan label untuk pemberian identitas sesuai dengan nomor identitas yang tertera pada form
dan kaca sediaan. 4) Uji kualitas contoh uji dahak Dahak yang diperiksa harus mukopurulen
yaitu dahak yang mukoid berwarna kuning kehijauan. Petugas harus dapat memotivasi pasien
agar dapat mengeluarkan dahak yang baik. Bila dahak yang diperoleh tetap tidak memenuhi
syarat, petugas lab tetap harus melakukan pemeriksaan dengan memilih bagian yang paling
kental dan beri catatan bahwa ”spesimen tidak memenuhi syarat / air liur” Uji kualitas dahak
dilakukan dengan cara melihat warna dan kekentalan dahak tanpa membuka tutup pot dahak,
karena itu pot dahak harus terbuat dari bahan yang transparan dan bening. 5) Uji fungsi reagen
Ziehl Neelsen · Uji ini diperlukan untuk memastikan reagen Ziehl Neelsen yang tersedia dapat
mewarnaiM.tuberculosisdengan baik. ƒ · Petugas harus membuat sediaan dahak kontrol yaitu
beberapa sediaan dahak dari dahak BTA negatif dan dahak BTA 1 + yang telah difiksasi. Ketika
akan menggunakan reagen Ziehl Neelsen kemasan baru maka dilakukan pewarnaan terhadap
satu sediaan dahak BTA negatif dan satu sediaan dahak BTA 1+. Pewarnaan yang baik BTA
tampak berwarna merah cerah dengan latar belakang biru yang terang, inti lekosit tampak jelas
dan tidak ada endapan merah atau biru. · Hasil uji fungsi harus dicatat dalam buku khusus yang
menuliskan tanggal pelaksanaan uji fungsi, nomor batch botol reagen dan hasil pewarnaan (lihat
formulir hasil PMI) · Bila hasil pewarnaan dinilai baik maka reagen dapat dipakai sebaliknya
bila memberikan hasil pewarnaan yang tidak baik : a) Endapan metilen biru atau kristal carbol
fuchsin maka reagen harus disaring langsung pada saat melakukan pewarnaan. b) Dekolorisasi
yang tidak sempurna maka mengganti larutan asam alkohol dengan larutan yang baik ·
ƒKumpulan sediaan dahak kontrol yang belum diwarnai harus disimpan dalam kotak khusus. b.
Analisis 1) Pembuatan Preparat a) Ambil contoh uji dahak pada bagian yang purulen dengan lidi
b) Apuskan dahak di atas kaca sediaan pada permukaan yang sama dengan nomor identitas.
Apusan bentuk oval 2x3 cm kemudian ratakan dengan gerakan spiral kecil-kecil. Jangan
membuat gerakan spiral bila sediaan dahak sudah kering karena akan menyebabkan aerosol.
Keringkan di dalam suhu kamar c) lidi langsung dibuang ke dalam botol berisi disinfektan d)
Lakukan fiksasi. Gunakan pinset atau penjepit kayu untuk memegang kaca . Pastikan apusan
menghadap ke atas Lewatkan 3 x melalui api dari lampu spiritus. e) Pemanasan yang berlebihan
akan merusak hasil. 2) Pewarnaan ziehl Neelsen a) Letakkan sediaan dengan bagian apusan
menghadap ke atas pada rak yang ditempatkan di atas bak cuci atau baskom, antara satu sediaan
dengan sediaan lainnya masing-masingberjarak kurang lebih 1 jari b) Genangi seluruh
permukaan sediaan dengan carbol fuchsin. Saring zat warna setiap kali akan melakukan
pewarnaan sediaan c) Panasi dari bawah dengan menggunakan sulut api setiap sediaan sampai
keluar uap, jangan sampai mendidih d) Dinginkan selama minimal 5 menit. e) Bilas sediaan
dengan air mengalir secara hati-hati dari ujung kaca sediaan. Jangan ada percikan ke sediaan lain
f) Miringkan sediaan menggunakan penjepit kayu atau pinset untuk membuang air g) Genangi
dengan asam alcohol sampai tidak tampak warna merah carbol fuchsin. Jangan sampai ada
percikan ke sediaan lain h) Genangi permukaan sediaan dengan methylene blue selama 20-30
detik i) Bilas sediaan dengan air mengalir. Jangan ada percikan ke sediaan lain j) Miringkan
sediaan untuk mengalirkan sisa methylene blue k) Keringkan sediaan pada rak pengering. Jangan
keringkan dengan kertas tissue 3) Pemeriksaan mikroskopis a) Letakkan sediaan di atas meja
mikroskop, permukaan sediaan menghadap ke atas. Gunakan lensa objektif 10 x untuk
menetapkan fokus dan menemukan lapang pandang. Periksa sediaan untuk menentukan kualitas
sediaan. Pada sediaan dahak umumnya ditemukan lebih banyak sel lekosit atau sel radang b)
Teteskan satu tetes minyak emersi, aplikator minyak emersi tidak boleh menyentuh kaca objek.
Tetesan harus jatuh bebas ke permukaan sediaan apus agar aplikator minyak emersi tidak
terkontaminasi dengan sediaan. c) Putarlah lensa objektif 100x dengan hati-hati ke atas sediaan
apus. Jangan sekali-kali lensa menyentuh kaca sediaan. d) Sesuaikan fokus dengan hati-hati
sampai sel terlihat jelas 4) Pelaporan Hasil a) tidak ditemukan BTA dalam 100 lapang pandang :
NEGATIF b) ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang: SCANTY (tuliskan jml BTA yang
ditemukan) c) ditemukan 10 – 99 BTA dlm 100 lapang pandang : 1+ d) ditemukan 1 – 10 BTA
setiap 1 lapang pandang(periksa minimal 50 lapang pandang : 2+ e) ditemukan •10 BTA dalam 1
lapang pandang(periksa minimal 20 lapang pandang) : 3+

Today Deal $50 Off : https://goo.gl/efW8Ef