IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI:

PEWARNAAN GRAM DAN UJI BIOKIMIA

LAPORAN PRAKTIKUM

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Mikrobiologi

Dosen
Vita Meylani, S.Pd., M.Sc
Mufti Ali, S.Pd., M.Pd.

oleh
Dedi Koswara 182154042
Kelas A
Kelompok 5

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SILIWANGI
2020
ACARA IV
 IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI:
PEWARNAAN GRAM DAN UJI BIOKIMIA

A. Tujuan
Melihat bentuk sel, rangkaian sel, sifat gram (graf negatif dan gram positif)
Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat-sifat biokimiawinya

B. Tinjauan Pustaka
Pewarnaan gram
Pewarnaan gram termasuk pewarnaan differensiasi, karena dapat membedakan bakteri
yang bersifat gram positif dan gram negatif. Menurut Bassiri (2020) ”Pengamatan bakteri dengan
mikroskop cahaya konvensional menghasilkan informasi yang relatif sedikit. Ini karena
kurangnya kontras ditambah dengan ukuran sel bakteri yang kecil. Penggunaan noda yang
bereaksi secara kimia dengan bahan sel akan meningkatkan kontras antara sel dan latar belakang.
Noda adalah zat warna yang terdiri dari ion berwarna (kromofor) dan ion counter untuk
menyeimbangkan muatan. Pewarnaan bagian kromofor dari kompleks pewarna ke komponen
seluler merupakan reaksi pewarnaan. Bergantung pada pewarna, kromofor dapat bermuatan
positif (kationik) dan memiliki afinitas untuk ion negatif atau bermuatan negatif (anionik)
dengan afinitas untuk ion positif ”.

Uji Biokimiawi
Pengamatan bakteri dilakukan dengan cara mengamati morfologinya, pertumbuhan pada
berbagai medium dan perlu juga diteliti sifat-sifat biokimiawinya. Menurut Kaiser (2019)“Untuk
mengidentifikasi bakteri, kita harus sangat bergantung pada pengujian biokimia. Jenis-jenis
reaksi biokimia yang dialami setiap organisme bertindak sebagai "cap jempol" untuk
identifikasi”.

Tes Oksidasi
Menurut Tankeswhar (2013)”Untuk membantu mengidentifikasi Neisseria, Pasteurella,
Vibrio, dan Pseudomonas. Tes ini digunakan untuk menentukan keberadaan sitokrom oksidase
bakteri”.

Tes Katalase
Menurut Tankeswhar (2013)”Untuk membedakan Staphylococci (katalase positif) dari
Streptococci (uji katalase negatif)”.

Tes O-F (Oksidasi-Fermentasi)

Menurut Tankeswhar (2013)”Bakteri gram negatif nonfermenting tertentu
memetabolisme glukosa menggunakan respirasi aerobik dan karenanya hanya menghasilkan
sejumlah kecil asam lemah selama siklus glikolisis dan Krebs”.

Tes Penggunaan Sitrat

Menurut Tankeswhar (2013)” Untuk membedakan anggota keluarga Enterobacteriaceae”.

Tes Dexarboksilase Lisin

Menurut Tankeswhar (2013)” Untuk membantu dalam identifikasi Salmonella dan
Shigella”.

Tes Hidrolisis Gelatin

 Menurut Tankeswhar (2013)”Uji hidrolisis gelatin digunakan untuk mendeteksi
kemampuan suatu organisme untuk menghasilkan gelatinase (enzim proteolitik) yang
mencairkan gelatin. Hidrolisis gelatin menunjukkan adanya gelatinase”.

Tes H₂S dan Fermentasi Gula

Menurut Tankeswhar (2013)”Setiap kali Anda melihat nama tes ini yaitu ‘Triple Sugar
Iron Agar‘, Anda harus ingat bahwa ini adalah tes yang memiliki tiga gula (laktosa, sukrosa, dan
glukosa) dan juga zat besi; dan mengandung agar sebagai zat pemadat (TSI adalah media semi-
padat yang memiliki kemiringan dan endapan)”.

Tes Indol
Menurut Tankeswhar (2013)”Tes ini digunakan untuk menentukan kemampuan suatu
organisme untuk memecah tryptophan untuk membentuk senyawa indole. Digunakan
membedakan batang gram negatif terutama E. coli di laboratorium mikrobiologi”.

Tes MR (Methyl red)

Menurut Tankeswhar (2013)”Tes Methyl Red (MR) menentukan apakah mikroba
melakukan fermentasi asam campuran ketika dipasok glukosa. Jenis dan proporsi produk
fermentasi yang dihasilkan oleh fermentasi glukosa anaerob adalah salah satu karakteristik
taksonomi utama yang membantu membedakan berbagai genus bakteri enterik”.

Tes VP (Voges Proskauer)

Menurut Tankeswhar (2013)”Voges-Proskauer adalah eponim ganda, dinamai dari dua
ahli mikrobiologi yang bekerja pada awal abad ke-20. Mereka pertama mengamati reaksi warna
merah yang dihasilkan oleh media kultur yang tepat setelah perawatan dengan kalium
hidroksida. Belakangan diketahui bahwa produk aktif dalam medium yang dibentuk oleh
metabolisme bakteri adalah asetil metil karbinol, produk jalur butilena glikol”.

Tes Urease
Menurut Tankeswhar (2013)”Tes Urease digunakan untuk menentukan kemampuan
suatu organisme untuk menghasilkan urease (enzim) yang menghidrolisis urea. Tes ini dilakukan
untuk membantu mengidentifikasi Proteus, Morganella, Yersinia enterocolitica, dan Helicobacter
pylori”.

C. Skema Kerja
1. Pewarnaan Gram
a. Alat
1) Mikroskop cahaya
2) Gelas benda
3) Jarum ose
b. Bahan
1) Crystal violet (Gram A)
2) Larutan iodine (Gram B)
3) Alkohol 96% (Gram C)
4) Safranin (Gram D)
5) Minyak immerse
6) Isolat murni bakteri tanah
c. Skema
Pulasan bakteri dibuat diatas objek gelas, dikeringkan dan difiksasi dengan api. Cat
crystal violet (Gram A) diteteskan dan di diamkan 30-60 detik. Sisa cat dibuang dan dicuci
dengan air mengalir. Larutan iodine (Gram B) diteteskan dan di diamkan selama 1-2 menit.
Dicuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (diberi larutan peluntur) dengan alkohol
(Gram C) (kira-kira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan
hasil). Dicuci dengan air mengalir, ditambahkan larutan safranin (Gram D) selama 10-20 detik.
Dicuci kembali dengan air mengalir, diangin-anginkan dan diamati di bawah mikroskop dengan
perbearan kuat (1000x) menggunakan minyak immersi.

2. Pewarnaan Gram
a. Alat
1) Buku panduan determinasi bakteri : Bergey” Manual of Determinative Bavteriology (Holt
et al., 2000)
2) Jarum ose
3) Pipet volume steril
b. Bahan
1) Isolasi murni bakteri tanah dalam NA miring dan NB (nutrien cair)
2) Reagen untuk tet oksidase: tetramethyl-paraphenyldiamine
3) Reagen untuk test katalase: 10% atau 30% H₂O₂
4) Bahan untuk test O-F: media O-F yang mengandung 0,15% karbohidrat, paraffin cair.
5) Bahan untuk test sitrat: Simmons Citrate Agar yang mengandung indikator Brom Thymol
Blue- BTB
6) Bahan untuk test dekarboksilase lisin: media Lysin Iron Agar (LIA) yang mengandung
Lisin dan indikator Brown Cresol Purple-BCP, media tanpa Lisin
7) Media Nutrien Agar (NA)
8) Gelatin
9) Media TSIA
10) Bahan untuk test pembentukan indol: media Tryptone Water, reagen Kovacs
11) Bahan untuk tes MR-VP: media MR-VP, larutan 40& KOH, larutan 5% alpha naphtol
12) Bahan untuk tes Urease: media Urea Broth, indikator Phenol Red.

c. Skema
1) Tes Oksidase
Diletakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada keras saring. Ambillah
suspensi isolat murni bakteri dalam nutrien cair dan inokulasikan pada kertas saring yng
telah ditetes reagen. Amati dan laporkan hasil pengujian, reaksi positif terjadi jika timbul
warna ungu tua atau hitam setelah didiamkan selama beberapa menit. Kadangkala perubahan
warna memakan waktu lebih lama sampai 1030 menit. Bandingkan dengan kontrol (tanpa
inokulasi bakteri).

2) Tes Katalase
Diletakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan tambahkan 1 ose atau 2-3
tetes suspensi isolat murni bakteri. Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih
seketi'ka. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

3) Tes O-F (Oksidasi-Fermentasi)

Diinokulasikan secara hati-hati isolat murni bakteri ke dalam 4 tabung berisi media O-F
yang mengandung 0,5-1% karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa atau sukrosa)
secara tusukan. Tabung I ditutup dengan parafin lunak, tabung II tidak ditutup parafin,
tabung III dan IV sebagai kontrol (ditutup paraffin dan tidak ditutup paraffin tanpa inokulasi
bakteri). Amati setelah 24 jam pada suhu kamar. Bandingkan perlakuan dengan kontrol.
Oksidasi (terbentuk warna kuning pada media O-F yang tidak ditutup paraffin) terjadi pada
mikroba aerobik dan fermentasi (terbentuk warna kuning pada media O-F yang ditutup
paraffin) terjadi pada mikroba anaerob. Bandingkan dengan kontrol. Perhatikan perubahan
warna media yang terjadi dan indikator yang terkandung dalam media O-F.
4) Test Penggunaan Sitrat
Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose dan secara
tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring, kemudian
diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Perhatikan perubahan warna dengan melihat
perubahan warna dari hijau menjadi biru. Bandingkan dengan kontrol.

5) Test Dekarboksilase Lisin

Pada medium yang mengandung lisin dan kontrol (media tanpa lisin) diinokulasi secara
tusukan dengan isolat murni bakteri,inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam. Positif
jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning dan kembali ke ungu, sementara
pada kontrol (media tanpa lisin) terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning.

6) Tes Hidrolisis Gelatin

Dengan cara tusukan, inokulasikan isolat murni bakteri pada media yang mengandung
gelatin sedalam 3/4 bagian dari lapisan permukaan. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu
kamar. Pada saat memeriksa, masukkan tabung kontrol dan kontrol (media tanpa inokulasi
bakteri) dalam almari selama 30 menit. Positif berarti terjadi pencairan.

7) Tes H₂S dan Fermentasi Gula-gula

Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolat murni bakteri menggunakan goresan
jarum ose dan menggunakan jarum inokulasi. Inkubasikan selama 24 jam Pembentukan
H2Selakukan dengan membentuknya endapan warna hitam. Perubahan warna media TSIA
dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula (pengaruh, sukrosa,
laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya media atau
terangkatnya media ke atas. Kompatibel dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).

8) Tes Indol
Diinokulasikan 1 tabung media Air Tryptone dengan 2 tetes isolat murni bakteri dan 1
tabung media untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri). Inkubasikan pada suhu kamar selama
24 jam. Setelah inkubasi, Setiap-tabung ditambah 10 tetes reagen Kovacs. Terbentuknya
warna merah / merah muda pada lapisan larutan reagen yang menentukan pembentukannya
indol. Bandingkan dengan kontrol.

9) Test MR (Methyl Red)

Diinokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP (media Methyl Red-Voges
Proskauer) dan inkubasikan selama 24 jam padasuhu kamar. Tambahkan 5 tetes reagen
Methyl Red ke dalam tabung berisi media MR-VP. Kocoklah hati-hati, Hasil tes positif jika
terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah disetujui reagen. Bandingkan dengan
kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

10) Tes VP (Voges Proskauer)

Diinokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP dan inkubasikan selama 24 jam
pada suhu kamar. Tambahkan 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5% dapatkan 0,2 ml KOH 40%.
Kocoklah hati-hati, longgarkan tutupnya, kocok kembali, ulangi setiap 5 menit, bacalah
perubahan warnanya setelah 30 menit. Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam
waktu 30 menit setelah disetujui reagen. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi
bakteri).

11) Tes Urease

 Diinokulasikan media Urea Broth yang mengandung indikator fenol merah dengan 1 tetes
kultur muni bakteri. Amatilah perubahan warna menjadi merah (fenol merah) setelah 24 jam
pada suhu kamar. Bandingkan dengan kontrol.

D. Hasil Pengamatan

PEWARNAAAN GRAM
No Gambar Keterangan
1 Proses fiksasi bakteri dengan cara
melewatkannya pada api bunsen.

2 Proses pewarnaan primer dengan

menggunakan pewarna Kristal Violet.
Lalu didiamkan selam 30-60 detik.

3 Setelah 30-60 detik pewarna dibersihkan

menggunakan aquades.

4 Proses penguatan warna dengan

menggunakan mordant selama 30-60
detik
5 Setelah 30-60 detik mordan dibersihkan
menggunakan aquades.

6 Proses dekolorisasi menggunakan alkohol

95% selama 5 detik

7 Setelah 5 detik alkohol 95% dibersihkan

menggunakan aquades

8 Proses pewarnaan menggunakan safranin

selama 30-60 detik sebagai pewarna
tanding.

9 Setelah 30-60 detik pewarna safranin

dibersihkan menggunakan aquades.
10 Proses pengeringan hasil pewarnaan gram
di atas slide dryer

11 Proses pengamatan dibawah mikroskop

dengan ditetesi terlebih dahulu
menggunakan imerse karena
menggunakan pembesaran kuat (1000x)

UJI OKSIDASE
No Gambar Keterangan
1 Penyiapan stick oksidase

2 Jarum ose dibakar sampai membara

menggunakan api bunsen, kemudian
dibiarkan dingin.
3 Koloni bakteri yang akan diuji diambil
menggunakan jarum ose.

4 Jarum ose yang telah mengandung

koloni bakteri dioleskan pada stick
oksidase.

5 Jarum ose dibakar kembali

menggunakan api bunsen.

6 Amati hasil pengujian, reaksi positif

apabila timbul warna ungu atau hitam
setelah beberapa menit.
 TEST KATALASE
No Gambar Keterangan
1 Jarum ose dibakar sampai membara
menggunakan api bunsen, kemudian
dibiarkan dingin.

2 Koloni bakteri yang akan diuji diambil

menggunakan jarum ose.

3 Koloni bakteri yang telah diambil,

kemudian diletakan pada objek glass.

4 Jarum ose dibakar kembali

menggunakan api bunsen.

5 H2O2 3% diteteskan secukupnya pada

objek glass yang terdapat koloni
bakteri.
6 Pengamatan gelembung, jika terbentuk
gelembung maka reaksinya +, jika tidak
terdapat gelembung reaksinya -

TEST PENGGUNAAN SITRAT

No Gambar Keterangan
1 Isolat murni bakteri diambil
menggunakan ose yang telah dibakar
terlebih dahulu menggunakan api
bunsen

2 Masukan isolat murni bakteri ke dalam

media Simmons Citrat Agar miring.

3 Inkubasi selama 24 jam pada suhu

kamar (35˚C)
4 Pengamatan hasil praktikum, jika reaksi
positif makan akan berwarna biru, jika
negatif warnanya tetap hijau.

TEST HIDROLISI GELATIN

No Gambar Keterangan
1 Isolat bakteri diambil menggunakan
jarum ose yang telah dibakar
menggunakan api bunsen.

2 Diinokulasikan isolat bakteri pada

media yang mengandung gelatin. Lalu
jarum ose dibakar kembali.

3 Diinkubasi selama 24 jam pada suhu

kamar.
4 Proses pengamatan hasil praktikum,
jika terjadi pencairan maka reaksinya
positif.

TES H2S DAN FERMENTASI GULA-GULA

No Gambar Keterangan
1 Jarum ose dibakar menggunakan api
bunsen.

2 Isolat bakteri diinokulasikan pada

media TSIA.

3 Diinkubasi selama 24 jam pada suhu

kamar.
4 Pengamatan hasil praktikum,
perubahan warna media TSIA dari
merah menjadi kuning menunjukan
adanya fermentasi gula (glukosa,
sukrosa, laktosa). Amati juga
pembentukan gas yang ditandai
pecahnya media atau terangkatnya
media ke atas

TEST IDOL
No Gambar Keterangan
1 1 tabung media tryptone water yang
telah ditetesi 2 tetes isolat murni
diinkubasikan selama 24 jam pada
suhu kamar.

2 Tiap-tiap tabung yang telah diinkubasi

ditambah 10 tetes reagen kovacs. Lalu
ditunggu beberapa menit

3 Pengamatan hasil praktikum,

terbentuknya warna merah/ merah
muda pada lapisan larutan reagen
menunjukkan terbentuknya indol.
 TEST MR (Methyl Red)
No Gambar Keterangan
1 Isolat bakteri yang telah diinokulasikan
pada media MR-VP diinkubasi selama 24
jam pada suhu kamar.

2 Setelah di inkubasi selama 24 jam,

ditambahkan 5 tetes reagen Methyl Red ke
dalam media MR-VP, lalu dikocok dan
tunggu selam 30 menit

3 Pengamatan hasil praktikum, jika berubah

warna menjadi merah maka hasil uji
positif

TEST VP (Voges Proskauer)

No Gambar Keterangan
1 Isolat bakteri diinokulasikan pada media
MR-VP dan diinkubasi selama 24 jam
pada suhu kamar. Lalu ditambahkan 0,6
ml larutan alpha-naptol 5%.
2 Ditambahkan larutan KOH 40% 2ml,
dikocok dengan hati-hati dan diamati
setelah 30 menit jika warna menjadi merah
maka hasil uji positif

TEST UREASE
No Gambar Keterangan
1 Isolat bakteri diambil menggunakan jarum
ose yang telah dibakar terlebih dahulu
menggunakan api bunsen.

2 Kemudian bakteri diinokulasikan pada

media urea broth yang mengandung
indikator fenol merah.

3 Diinkubasi selama 24 jam dalam suhu

kamar.
 4 Pengamatan hasil praktikum, jika warna
berubah menjadi merah maka hasil uji
positif.

E. Pembahasan
Pewarnaan Gram
Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras
dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan
salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk
mempermudah proses identifikasi bakteri.
Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan
warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore
yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena
kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi
menjadi baik Pada praktikum proses pewarnaan gram olesan bakteri yang terfiksasi dikenai
larutan-larutan berikut dalam urutannya yaitu kristal violet, larutan yodium, alkohol , dan
safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan
metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri gram positif,
mempertahankan zat pewarna ungu kristal. Di gunakan untuk pengecatan differensial,
menggunakan beberapa jenis zat, di gunakan untuk mengelompokkan bakteri, seperti pengecatan
gram atau pengecatan acid-fast, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci
dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak
berwarna merah.

Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia dari bakteri tersebut.
Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka akan diketahuisifat-sifat suatu koloni bakteri.
Sifat-sifat suatu koloni tersebut ialah sifat-sifatyang ada sangkut pautnya dengan bentuk,
susunan, permukaan, pengkilatan, dan sebagainya. Reaksi biokimiawi pada bakteri dapat
dilakukan dengan beberapa uji diantaranya adalah.

Uji Oksidase
Dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat menguraikan enzim oksidase atau
tidak. Uji oksidase bertujuan untukmenentukan bakteri enterik atau non enterik. Enzim sitokrom
oksidase akan berubah menjadi bentuk tidak aktif dengan mereduksi sitokrom c. Enzim ini akan
menjadi bentuk aktifnya kembali jika terjadi transfer elektron ke molekul oksigen. Keberadaan
oksigen pada enzim oksidase akan mereduksi substan-substanorganik diantaranya substan yang
terdapat pada oxidase test strip yang mengandung N, N dimetil1,4 fenilen diammonium diklorida
dan 1 naftol. Reaksi tersebut akan menghasilkan molekul indophenol blue yang mengakibatkan
warna test strip akan berwarna biru violet. Reaksi ini merupakan reaksi positif untuk bakteri non
enterik sedangkan pada bakteri enterik tidak terjadi perubahan warna.
Uji katalase
Dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim katalase pada bakteri. Pengujian ini
menggunakan H2O2 3% karena H2O2 merupakan salah satu hasil respirasi aerobic bakteri,
dimana hasil respirasi tersebut justru dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat
toksik bagi bakteri itu sendiri sehingga komponen ini harus dipecah agar tidak bersifat toksik
lagi. Pada saat melakukan respirasi salah satu komponen yang dihasilkan bakteri adalah H2O2.
Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzim katalase segera membentuk
suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkan sendiri. Dan dalam praktikum jika
timbul gelembung maka reaksinya + dan jika tidak ada gelembung reaksinya-.

Uji O-F
Uji ini bertujuan untuk menentukan kemampuan mikroba untuk memetabolisme
karbohidrat secara oksidatif dan fermentatif. Mikroorganisme yang melakukan metabolisme
karbohidrat ditunjukan oleh perubahan warna media yang awalnya berwarna hijau, akan berubah
menjadi kuning.

Uji sitrat
Digunakan untuk melihat mikrobia menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber
karbon dan energi. Digunakan medium Simmon-sitrat yang berupa medium padat. Perubahan
warna dari hijau menjadi biru menunjukan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat
sebagai satu-satunya umber karbon.

Uji Dexarboksilase Lisin

Uji ini bertujuan menunjukkan kemampuan bakteri dalam mendekarboksilasi berbagai
asam amino. Dekarboksilasi merupakan proses penguraian gugus karboksil dari suatu molekul
organik. Sewaktu proses fermentasi, mikroorganisme seringkali menghasilkan hasil sampingan
yang bersifat asam. Asam yang dihasilkan dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan
pH media biakan dan menycbabkan perubahan warna pH indikator BCP (Bromo Cresol Purple)
dari ungu menjadi kuning. Enzim dekarboksilase memetabolisme gugus asam dari asam amino
dan menghasilkan amin yang kemudian menyebabkan media menjadi bersifat basa. Proses
netralisasi asam ini menyebabkan terjadinya perubahan warna dari kuning menjadi ungu seperti
sedia kala,di mana perubahan warma menjadi ungu ini menunjukkan bahwa lisin mengalami
dekarboksilasi.

Uji Hidrolisis Gelatin

Gelatin adalah protein yang diperoleh dari tulang, tulang rawan atau tenunan ikat hewani
lainnya. Hidrolisis gelatin oleh mikroba tersebut dikatalisis oleh eksoenzim yang disebut
gelatinase. Gelatin yang dicerna tidak mampu membentuk gel dan bersifat cair. Bila
mikroorganisme dapat mencerna gelatin maka media semi padat gelatin tetap bersifat cair setelah
dikeluarkan dari lemari es. Sebaliknya, bila mikroorganisme tidak mampu mencerna gelatin,
maka media semipadat gelatin membeku kembali setelah dikeluatkan dari lemari es

Metil Red
adalah indikator asam-basa yang berubah menjadi merah dalammedium yang sedikit
asam. Jadi, jika metil merah ditambahkan pada mediumbiakan yang mengandung glukosa yang
di dalamnya organisme telah tumbuhselama 18 sampai 24 jam, warna merah menunjukkan
bahwa asam organik telahterbentuk sebagai akibat fermentasi glukosa. Metil merah adalah suatu
indicator yang akan menunjukan warna merah bila pH ada di bawah 4. Hasil test positifditandai
dengan terbentuknya warna merah, sedangkan warna kuning menunjukanhasil negative

Uji VP (Voges Proskauer)

 Medium yang digunakan untuk pengujian ini adalah medium MR-VP broth. Uji Voges-
Proskauer (VP) digunakan untuk menentukan apakah glukosa dapat diubah menjadi asetil metil
karbinol. Uji ini dilakukan dengan cara menginokulasi masing-masing isolat bakteri ke dalam
medium MR-VP broth lalu diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian ditambahkan
5 tetes reagen VP A (yang mengandung naphtol) dan ditambahkan pula 5 tetes reagen VP B
(yang mengandung KOH). kemudian dikocok hingga homogen. Sebelum memastikan hasilnya,
dibiarkan dahulu selama 15-20 menit agar bereaksi. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna menjadi pink atau merah yang mengindikasikan adanya kehadiran aseton.
Sedangkan reaksi negatif pada broth adalah tidak berubahnya warna medium atau menjadi warna
tembaga

Uji Urease
Bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri mengubah urea menjadi amoniak.
Media untuk uji urease menggunakan Urea Base Agar. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna media dari warna kuning menjadi merah muda.

F. Kesimpulan
Ketika akan melakukan identifikasi bakteri kita dapat melakukan pengamatan morfologi
sel bakteri tersebut dan untuk memepermudah pengamatan maka dilakukanlah proses pewarnaan
gram supaya bakteri yang diamati dapat terlihat dengan lebih jelas. Setelah pengamatan
morfologi dilakukan pengamatan sifat-sifat biokimiawi dengan beberapa uji diantaranya adalah
uji oksidase, uji katalase, uji O-F, uji sitrat, uji dekarboksilase lisin,, uji hidrolisi gelatin, uji H2S
dan fermentasi gula-gula, uji idol, uji MR (Methyl Red), uji VP (Voges Proskauer), uji urease.

G. Daftar Pustaka

Bassiri, Ebi. (2020). Stainning of bacterial cells. Philadelphia. University of Pennsylvania.

Kaiser, Garry (2019). Using Biochemical Testing to Identify Bacteria. Department of Education
Open Textbook Pilot Project, the UC Davis Office of the Provost, the UC Davis Library, the
California State University Affordable Learning Solutions Program, and Merlot. We also
acknowledge previous National Science Foundation support under grant numbers 1246120,
1525057, and 1413739. Unless otherwise noted, LibreTexts content is licensed by CC BY-
NC-SA 3.0

Tankeswhar, Acharya (2013). Overview of Biochemical tests used to identify bacteria in

Microbiology laboratory. Nepal. Patan Academy of Health Sciences.

Truckee Meadows Community College (2020). General Biochemical Tests. Dandini Boulevard
Reno, Nevada
PERTANYAAN
1. Mengapa untuk identifikasi bakteri pengecatan gram perlu dilakukan?
Bakteri dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan/ pengecatan atau dengan
pewarnaan/ pengecatan. Pada umumnya pengamatan bakteri tanpa pengecatan akan lebih sulit
dibandingkan dengan pengamatan bakteri yang telah dilakukan pengamatan. Dengan pengecatan
juga dapat dilihat struktur sel mikroba lebih seksama dan dapat membedakan bakteri gram positif
atau negatif

2. Mengapa hasil akhir pengecatan berbeda pada berbagai bakteri sehingga dapat dikelompokan ke
dalam bakteri gram positif dan bakteri gram negatif?
Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat
dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan (safranin), hal ini disebabkan
karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya, yang mempunyai afinitas kuat terhadap kompleks
crystal violet dan iodine (jodium). Bakteri Gram negatif tidak mengikat cat utama secara kuat,
sehingga dapat dilunturkan o!leh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan.

3. Pengamatan apa saja yang bisa digunakan sebagai parameter untuk mengidentifikasi dan
mendeterminasi bakteri tak dikenal
Pada identifikasi bakteri mula-mula diamati morfologi sel individual secara mikroskopik
dan pertumbuhannya pada bermacammacam medium. Karena suatu bakteri tidak dapat
dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, maka perlu diteliti pula sifat-sifat
biokimiawi dan faktor- faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya. Bakteri-bakteri yang
morfologinya sama mungkin berbeda dalam kebutuhan nutrisi dan persyaratan ekologi lainnya

4. Jelaskan mekanisme reaksi biokimiawi yang anda uji dalam praktikum ini
Mikroba tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai bahan yang terdapat
di lingkungannya. Nutrien yang terdapat di lingkungan sekelilingnya terdiri dari molekul sederhana
seperti H2S dan NH atau molekul organik yang kompleks seperti protein dan polisakarida. Mikroba
mengoksidasikan nutrien ini untuk memperoleh energi dan prekursor untuk sintesis dinding sel,
membran dan flagella. Penggunaan nutien tergantung aktivitas metabolisme mikroba. Percobaan-
percobaan dalam uji biokimiawi mencakup berbagai uji untuk mengetahui aktivitas metabolisme
mikroba. Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan mikroba untuk
menggunakan dan menguraikan molekul kompleks, seperti zat pati, lemak, protein dan asam
nukleat. Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang sederhana seperti asam amino
dan sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian dan identifikasi mikroba
Tabel 1. Hasil pengamatan morfologi sel isolat murni bakteri:
Jeni mikroba Bentuk Pewarnaa Uji Uji Uji Uji Uji Uji Uji H2S Uji Uji Uji Uji
sel n gram oksidase katalae O-F sitrat karbokilae hidrolisi dan indol MR VP urease
lisin s gelatin fermentai
gula
Pseudomona batang negatif + - - - - -
s aeruginosa
E. coli batang negatif - - + + - -
E. coli ETEC batang negatif - - + + - -
Edwardsiella Batang negatif - + + + - -
tarda
Klebsiella batang negatif + - - + +/- +
pneumoniae
Klebsiella batang negatif + - + + - +
oxytoca
Citrobacter batang negatif +/- + + + - -
diversus
Enterobacter batang negatif +/- + + + - -
diversus
Enterobacter batang negatif + - - + - -
aerogenesis
Shigella batang negatif - - - + - -
dysenteriae
Salmonella batang negatif - - - + - -
paratyphosa
A
Salmonella batang negatif - + - + - -
typhi
Salmonella batang negatif + + - + - -
paratyphosa
B
Citrobacter batang negatif + + - + - -
freundii
Serratia batang negatif + - - + +/- -
marcescens
Prateus batang negatif + + - + - +
mirabilis
Providencia batang negatif + - + + - +
rettgeri
Klebsiella batang negatif - - - - - -
ozoaneae