METODE

2.1. Konstruksi plasmid

Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini dirangkum dalam Tabel 1. Escherichia
coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) digunakan untuk kloning gen dan manipulasi plasmid.
Transforman E. coli ditanam dalam medium Lysogeny Broth (LB) dengan 100 μg / mL
ampisilin. Untuk membangun ekspresi cas9 plasmid, ORF gen AUR1-C diamplifikasi oleh
PCR dari plasmid pAUR101, menggunakan primer. Fragmen DNA yang diamplifikasi
diikatkan ke situs restriksi yang sesuai di plasmid p414_TEF1p_Cas9_CYC1t (Addgene,
plasmid No. # 43802). Untuk konstruksi panduan RNA ekspresi plasmid yang menargetkan
GPD1 dan GPD2, strategi PCR overlap. Fragmen DNA pertama diamplifikasi untuk
menggabungkan urutan promotor dan urutan penargetan untuk GPD1 atau GPD2 oleh primer
F1 dan R1. Fragmen DNA kedua diperkuat untuk menggabungkan dengan urutan penargetan
untuk GPD1 atau GPD2, urutan RNA guide, dan urutan terminator oleh primer F2 dan R2.
Kemudian, fragmen DNA pertama dan kedua diamplifikasi kembali menggunakan primer F1
dan R2. Fragmen DNA yang dihasilkan diikat ke situs restriksi SacI dan KpnI dalam plasmid
pRS42H-gLEU2. Plasmid yang diikat akan menjadi ekspresi RNA plasmid untuk
mengganggu GPD1 atau GPD2, pRS42H_gGPD1 atau pRS42H_gGPD2 (Kim dkk., 2019).

(Kim dkk., 2019)

2.2. Konstruksi strain S. cerevisiae yang direkayasa

Transformasi plasmid untuk mengganggu GPD1 dan GPD2 gen dilakukan

menggunakan spheroplast transformation kit (BIO 101, Vista, CA). Untuk memilih
transforman, galur S. cerevisiae ditanam secara aerobik pada suhu 30 ° C dalam media YNB
(6,7 g / L Ragi Basa Nitrogen dengan nukleotida dan asam amino yang sesuai). 20 g / L
glukosa dan 1 g / L etanol digunakan sebagai sumber karbon. Untuk konstruksi galur GPD1
dan GPD2 yang terganggu, galur BD5_T2nox_Cas9 pertama kali dibangun dengan
mentransformasi plasmid pAUR_Cas9 menjadi galur BD5_T2nox. Kemudian, plasmid
pRS42H_gGPD1 atau pRS42H_gGPD2 berubah menjadi strain BD5_T2nox_Cas9 dengan
fragmen perbaikan DNA diamplifikasi dengan PCR dengan F3 / R3 (untuk mengganggu
GPD1) dan F4 / R4 (untuk mengganggu GPD2) primer di media Tambahan Tabel 1. YNB
dengan 0,1 mg / mL dari aureobasidin A dan 250 μg / mL hygromycin B digunakan untuk
memilih koloni yang terganggu GPD (BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2). Untuk
konstruksi galur GPD-null (BD5_T2nox_dGPD1,2), galur GPD1 yang mengandung protein
Cas9 (BD5_T2nox_dGPD1_Cas9) secara bertahap diolah dalam media YNB yang hanya
mengandung aureobasidin A untuk menyembuhkan plasmid pRS42H_gDGPD1 Setelah
konfirmasi penyembuhan plasmid, pRS42H_gGPD2 dan perbaikan DNA plasmid
(amplifikasi oleh primer F4 / R4) ditransformasi bersama menjadi galur terganggu GPD1.
cas9 dan panduan RNA ekspresi plasmid disembuhkan setelah gangguan GPD1 dan GPD2
dengan budidaya serial pada media YNB tanpa aureobasidin A dan hygromycin B.
Menggunakan metode gangguan GPD ini dengan pengeditan genom Cas9, gen PDC yang
heterolog dimasukkan ke tengah ORF dari ADH1 endogen dalam GPD1, 2 ragi terganggu.
Galur GPD terganggu dengan heterolog PDC (BD5_T2nox_dGPD1dGPD2_dADH1CtPDC)
dibangun dengan transformasi dengan plasmid pRS42H_gADH1 dan perbaikan fragmen
DNA yang diamplifikasi PCR dengan primer F5 / R5. Semua strain S. cerevisiae yang
direkayasa tercantum pada Tabel 1 (Kim dkk., 2019).

2.3. Kondisi fermentasi

Untuk inokulasi, S. cerevisiae yang direkayasa diolah selama 5 hari dalam media 5
mL YNB yang mengandung 20 g / L glukosa dan 1 g / L etanol, bila perlu. Sel-sel yang telah
tumbuh dipindahkan ke media 100 mL YNB yang mengandung 20 g / L glukosa dan 0,5 g / L
etanol (jika perlu) dan dikultur secara aerob (250 rpm) sebelum fermentasi utama pada suhu
30 ° C. Setelah 48 jam pra-budidaya, sel-sel (OD600 <3.0) dipanen dan dicuci dengan air
suling ganda berulang kali. Akhirnya, sel-sel yang dicuci diinokulasi ke dalam kultur utama
pada konsentrasi awal 0,20 gDCW / L. Fermentasi batch dalam labu dilakukan dalam kondisi
mikroaerob (80 rpm) dalam media YNB yang mengandung 100 g / L glukosa, 0,5 g / L etanol
(jika perlu) dan 50mM kalium phthalate pada pH 5,5 disesuaikan oleh NaOH dalam 30 ° C
inkubator. Fermentasi batch dan fed-batch utama dilakukan oleh 1 LJ (Kim dkk., 2019).

2.4. Analisis berat sel kering dan metabolit

Sel-sel yang tumbuh dalam penelitian ini diukur menggunakan spektrofotometer (UV-
1601, Shimadzu, Jepang) dan dinyatakan dengan kepadatan optik pada 600 nm (OD600).
Berat sel kering (DCW) diperkirakan berdasarkan faktor konversi (0,20 gdry cell / L /
OD600). Konsentrasi metabolit (glukosa, gliserol, asetoin, 2,3-BD dan etanol) diukur dengan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Agilent, CO, USA) yang dilengkapi dengan kolom asam
organik Rezex ROA-organik (Phenomenex, CA, USA ). Kolom ini dielusi dengan asam
sulfat 5mM pada laju aliran 0,6 ml / menit. Metabolit dikuantifikasi menggunakan detektor
indeks bias (RI) (Kim dkk., 2019).

2.5 Konstruksi plasmid untuk ekspresi gdh O.parapolymorpha

Urutan kode O. parapolymorpha gdh diamplifikasi dari plasmid p424gdh

menggunakan primer 267 dan 288. Phleomycin resistance cassette (ble) direstriksi dengan
NotI dari pUG66. The marker cassette dikloning ke situs NotI p41TEF dan p41TEF-Opgdh
menghasilkan p41bleTEF dan p41bleTEF-Opgdh (Klein dkk., 2016).
2.6 Konstruksi expression cassettes untuk integrasi genom

Expression cassette untuk gen FPS2 dari Pachysolen tannophilus (PtFPS2) dibangun
dengan ligating urutan pengkodean ke vektor ekspresi S. cerevisiae p416TEF, dengan
membawa ekspresinya di bawah kendali promotor TEF1 dan terminator CYC1.Amplifikasi
PCR dari urutan pengkodean PtFPS2 dilakukan dari DNA genom P.tannophilus CBS 4044
menggunakan primer 182 dan 183. Fragmen yang diperoleh diikat ke beberapa situs kloning
p416TEF dengan restriksi-ligasi kloning menggunakan enzim restriksi XbaI dan XhoI yang
menghasilkan p416TEFPtFPS2 . Urutan pengkodean untuk DAK1 dari CBS6412-13A dan
FPS1 dari Cyberlindnera jadinii DSM 2361 diamplifikasi dari masing-masing DNA
genomik. Semua promotor dan terminator diamplifikasi dari DNA genom yang diisolasi dari
strain S. cerevisiae S288c. Sel-sel E. coli DH5α ditransformasikan dengan 5 μL dari sana aksi
dan vektor yang dihasilkan bernama pUC18-DAK1, pUC18-DAK1OE-2 dan pUC18-CjFPS1
(Klein dkk., 2016).

2.7 Konstruksi plasmid untuk pengeditan genom yang diperantarai CRISPR-Cas9 di S.

cerevisiae

Penanda auksotrofik digantikan oleh expression cassettes yang memberikan resistensi

terhadap nourseothricin (pada p414-TEF1p-Cas9-CYC1t) dan hygromycin B (pada p426-
SNR52p-gRNA.CAN1. Y-SUP4t). p414-TEF1p-Cas9-CYC1t dilinearisasi dengan urutan
pengodean TRP1 menggunakan MunI dan p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t dilinearisasi
dengan memotong urutan pengodean URA3 dengan NcoI. Kedua plasmid linier itu kemudian
ditransformasi bersama dengan masing-masing marka resistansi yang diamplifikasi PCR
menjadi CEN.PK113-1A dan vektor yang dihasilkan dinamai p414-TEF1p-Cas9-CYC1t-nat1
dan p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-hphMX. gRNA yang menargetkan gen CAN1
dipertukarkan dalam p426-SNR52p-gRNA.CAN1. Y-SUP4t-hphMX dengan menargetkan
GUT1 dengan menghasilkan dua produk PCR yang overlap dari kaset ekspresi gRNA yang
menghasilkan p426-SNR52p-gRNA. GUT1-SUP4t-hphMX (Klein dkk., 2016).

2.8 Modifikasi genetik S.cerevisiae

GALp-GIN11M86 cassette diamplifikasi dari plasmid pGG119, sedangkan gen

penanda kanMX4 atau ble diamplifikasi dari plasmid pUG6 dan pUG66. Seluruh cassette
GALp-GIN11M86 / marker digantikan oleh cassette ekspresi gen masing-masing (PtFPS2
atau DAK1). Sel-sel dilapisi pada media sintetik padat yang mengandung 2% galaktosa
sebagai satu-satunya sumber karbon untuk menginduksi persamaan pertumbuhan GIN11M86
untuk seleksi balik. Cassette gangguan untuk menghapus GUT1 dan GUT2 (resistensi
kanMX4) diperkuat oleh PCR dari pUG6. Cassette gangguan digunakan untuk mengubah
CBS6412-13A serta CBS6412-13A PtFPS2 (Klein dkk., 2016).

2.9 Isolasi DNA genom dari transforman S. cerevisiae dan PCR diagnostik

S. cereviseae distreak kembali pada pelat agar YPD. 50mg sel dari pelat ini
disuspensikan dalam 200 μL buffer TE. Selanjutnya, 300 mg asam dicuci dalam kaca beads
(diameter 0,425- 0,6 mm) dan 200 μL fenol: kloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1)
ditambahkan. Tabung kemudian vortex pada kecepatan maksimum selama 2 menit dan
disentrifugasi pada 15.700 g selama 10 menit. Fasa air (1 μL) digunakan sebagai contoh
dalam 20 μL reaksi PCR. Integrasi yang benar dari semua kaset ekspresi dan gangguan
diverifikasi oleh PCR diagnostik menggunakan TaKaRa ExTaq Polymerase dan buffer (Klein
dkk., 2016).

2.10 Analisis kuantitatif pertumbuhan gliserol dalam Growth Profiler 1152

Sel yang diperoleh dari satu koloni digunakan untuk menginokulasi 3 mL media
glukosa sintetik dalam tabung gelas 10 mL dan diinkubasi pada orbital shaking 200 rpm 30 °
C semalam. Prekultur diinokulasi ke 3 mL media glukosa sintetis segar dalam tabung gelas
10 mL menyesuaikan OD600 0,2. 1 mL biakan sel dibentuk mejadi palet pada 800 g selama 5
menit dan kemudian dicuci sekali dalam 1 mL media gliserol sintetik. Disuspensikan kembali
dalam 1 mL media yang sama dan jumlah sel yang sesuai digunakan untuk menginokulasi 5
mL media gliserol sintetik lagi yang menyesuaikan OD600 0,2. Aliquot dari biakan utama ini
(750 μL) ditransfer segera ke dalam sumur-sumur pelat putih bawah Krystal 24 berwarna
putih jernih. Dibudidayakan di Growth Profiler 1152 (Enzyscreen, Haarlem, TheNetherlands)
pada 30 ° C dan diletakkan orbital shaking pada 200rpm. Growth Profiler 1152
memungkinkan menentukan kepadatan kultur (dinyatakan sebagai nilai hijau atau nilai G) di
setiap sumur tunggal dari lempeng mikro hingga nilai OD600 2,5 pada interval 40 menit.
(Klein dkk., 2016).

2.11 Penentuan konsentrasi dihydroxyacetone ekstraseluler (DHA) oleh HPLC

Volume 20 μL sampel digunakan untuk injeksi. Konsentrasi DHA dalam media kultur
ditentukan menggunakan sistem Waters HPLC (Eschborn, Jerman) yang dilengkapi dengan
kolom Aminex HPX-87H. Standar DHA dijalankan dalam konsentrasi yang sesuai antara
0,05 dan 2,00 g/L. Data diproses menggunakan perangkat lunak Breeze 2 (Waters) (Klein
dkk., 2016)..