2.1.

nano material dan persiapan sampel air

Empat MWCNT (Chengdu Organic Chemistry Co., China) dengan diameter luar 8–15 nm
masing-masing digunakan masing-masing sebagai MWCNT, MWCNT-OH, MWCNT-COOH, dan
MWCNT-NH2 . Satu SWCNT (Shenzhen Nanotech Port Co., China) dengan diameter luar 1-2 nm juga
digunakan dengan metode sintesis dan sifat fisik-kimia. CuSO4 ·5H2 O dan K2 Cr2 O7 digunakan
untuk memperkirakan potensi efek gabungan dengan CNT pada komunitas mikroba karena Cu dan
Cr adalah logam beracun yang umum dalam air.

Sampel air diperoleh dari pencampuran air deionisasi (DI) dengan tanah. Tanah diambil dari
bagian utara Kabupaten Miyun, Beijing, Cina, di hulu reservoir Miyun. Prosedur pembuatan sampel
air adalah sebagai berikut: 450 g tanah dan 4,5 L DI air dicampur sepenuhnya, dan dikocok selama 4
hari pada 160 rpm. Kemudian campuran didiamkan selama 24 jam. Setelah itu, Supernatan (30 ml)
dipindahkan ke botol amber 40 ml dengan tutup ulir berlapis Telon dan beberapa udara juga
disimpan untuk mendukung kelangsungan hidup mikroorganisme aerobik. Sementara itu, dua
sampel air diperlakukan untuk ekstraksi DNA sebagai blanko (0 hari).

Sejumlah CNT tertentu dipindahkan ke dalam vial untuk menyiapkan larutan 0, 100 dan 200
mg/L dan ion Cu atau Cr (perkiraan 40 dan 45 mg/L) juga digunakan untuk menilai efek gabungannya
dengan CNT. Untuk efek gabungan, ion logam dan CNT secara bersamaan ditambahkan ke dalam air.
Botol diinkubasi dalam shaker selama 10 hari dan 40 hari pada suhu kamar. Kemudian, larutan
akuatik digunakan untuk analisis selanjutnya (misalnya, konsentrasi Cu dan Cr, dan komunitas
mikroba). Semua botol dan barang pecah belah lainnya, yang dapat disentuh dengan larutan
eksperimental, diautoklaf pada 121◦C selama 30 menit.

2.2. Ekstraksi DNA dan pengukuran logam berat

Rincian spesifik analisis sampel air untuk menghasilkan sidik jari berbasis PCR dapat
ditemukan di tempat lain. Singkatnya, sampel air disaring vakum dengan filter ukuran pori 0,2 m
pada 10 dan 40 hari. Residu pada filter digunakan untuk mengekstrak DNA. kemudian DNA genomik
total diekstraksi dan dimurnikan dengan kit isolasi DNA PowerSoil dari MoBio Laboratory, Inc.
(Carlsbad, CA) seperti yang dijelaskan oleh pabrikan. Kualitas DNA yang diekstraksi dianalisis dengan
elektroforesis pada gel agarosa 1%. Konsentrasi DNA diukur dengan absorbansi pada 260 nm, dan
DNA yang diperkuat divisualisasikan menggunakan Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE).
Filtrat diukur konsentrasi ion Cu dan Cr dengan AA- Spektrofotometer Serapan Atom 6300C
(Shimadzu, Jepang). Setelah itu Ion logam yang diserap dihitung berdasarkan perbedaan massa
sebelum dan sesudah penyerapan.

2.3. Kuantifikasi bakteri dan komunitas mikroba Actinobacteria dengan Real-Time PCR

Untuk kuantifikasi relatif komunitas mikroba dalam larutan berair, kuantitatif real-time
polymerase chain reaction (qPCR) digunakan sesuai dengan prosedur yang diterbitkan. Secara
singkat, peningkatan emisi fluoresensi dipantau selama amplifikasi PCR oleh sistem 7500 Fast real-
time PCR (PE Applied Biosystem, USA). Nilai Ct yang diperoleh untuk setiap sampel dibandingkan
dengan kurva standar untuk menentukan jumlah salinan awal dari gen target. Kuantifikasi spesifik
bakteri dilakukan dengan primer 357f (5 -CCT ACG GGA CGC AGC AG-3) dan 518 r (3-ATT ACC GCG
GCT GCT GG-5). Untuk actinobacteria, primer yang digunakan dalam qPCR adalah F243 (5 -GGA TGA
GCC CGC GGC CTA-3 ) dan R513 (3 -CGG CCG CGG CTG CTG GCA CGT A-5 ). amplifikasi qPCR
dilakukan dengan 10 L 2,0 × SYBR green master mix (Applied Biosystems, USA), 0,1 L primer, 2 L
template DNA dan 7,8 L DD air dalam 20 L reaksi, yang akhirnya ditutupi oleh film perekat optik.
Sampel disiapkan dalam rangkap tiga.

2.4. Elektroforesis gel

Komunitas mikroba sangat erat kaitannya dengan status lingkungan. Metode DGGE adalah
alat yang cepat dan mudah untuk mengevaluasi struktur komunitas mikroba umum in situ. Gel
dielektroforesis dalam buffer 1 × TAE (40 mM Tris, 20 nM asam asetat, 1 mM Na-EDTA; pH 8,0) pada
160V dan 60 C selama 9 jam. Gel diwarnai dengan SYBR Green I (AIDLAB, China) selama 30 menit dan
difoto menggunakan sistem pencitraan gel REDTM (Alpha, USA). Gambar Bakteri DGGE diproses
menggunakan perangkat lunak Quantity one (4.6.2, Bio-Rad) secara independen band dengan
membedah profil ke dalam interval yang sama.

2.5. Analisis klaster pola DGGE dan pohon filogenetik

Profil DGGE dianalisis menggunakan perangkat lunak Quantity One® (Bio-Rad, USA) untuk
menghitung nilai kesamaan komunitas mikroba. Analisis klaster dilakukan menurut ada dan tidaknya
pita di gel DGGE. Berdasarkan analisis keberadaan/ketidakhadiran pita dan pembobotan pita
(densitas pita), dendrogram filogenik dibangun dengan menerapkan koefisien Dice dan metode grup
pasangan tidak tertimbang dengan menggunakan rata-rata aritmatika (UPGMA).

Untuk menyelidiki identitas filogenetik dari beberapa pita DGGE yang dominan, urutan
nukleotida ini dibandingkan dengan urutan yang diketahui di GenBank menggunakan program
BLAST. Prosedurnya yaitu Setelah sidik jari DGGE diambil gambarnya, pita utama pada gel DGGE
dipotong. Kemudian gel ditambahkan ke dalam 100 L air DI steril, dan disimpan pada suhu 5 C
semalaman. Larutan 1 L sebagai model digunakan untuk mengamplifikasi DNA dalam PCR. Produk
DNA yang dimurnikan diperoleh kembali dengan kit ekstraksi gel. Akhirnya, produk DNA diurutkan
oleh Shanghai Sangon Biotech Company.

2.6. Pencitraan TEM dan SEM-EDS

Tetesan sampel yang mengandung MWCNT-COOH 100 mg/L dan Cr 45 mg/L pada inkubasi
hari ke-10 diletakkan pada kisi-kisi tembaga. Kemudian, sampel dikeringkan di udara selama 4 jam
untuk analisis mikroskop. Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) diperoleh pada JEM-1200EX
TEM (JEOL, Jepang) dengan tegangan percepatan pada 100 kV. Cu atau Cr yang diserap pada
MWCNT-COOH terdeteksi pada Nova NanoSEM 450 (FEI, Holland) setelah interaksinya 10 hari.
MWCNT-COOH disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 5 menit, kemudian dicuci dengan air DI
sebanyak 3 kali untuk menghilangkan ion logam bebas. MWCNT-COOH akhir dengan logam
dikeringkan pada 60 C dan kemudian ditentukan.