Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
TDIA JOURNAL OF BIOLOGI CHEMISTRY
© 1997 oleh The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.
Identifikasi, Kloning, dan Analisis Mutasi Kasein Kinase 1 cDNA
Parasit Malaria, Plasmodium falciparum
EKSPRESI TAHAP-KHUSUS GEN*
(Diterima untuk publikasi, 15 April 1997, dan dalam bentuk revisi, 28 Juli 1997)
Sailen Barik, Russell E. Taylor‡, dan Debopam Chakrabartikan
Dari kanDepartemen Biokimia dan Biologi Molekuler, University of South Alabama, Mobile, Alabama 36688 dan kan
Departemen Biologi Molekuler dan Mikrobiologi, Universitas Central Florida, Orlando, Florida 32816
cDNA untuk kasein kinase 1 (CK1) dari Plasmodium
falciparum dikloning, diurutkan, dan diekspresikan dalam
bakteri. Kerangka baca tunggal utama terbuka dari pasangan
1,2-kilobase cDNA dikodekan untuk polipeptida asam amino
324 dari;37 kDa, urutan prediksi yang menunjukkan identitas
kuat dengan isoform CK1 yang diketahui. Enzim rekombinan
yang dimurnikan menunjukkan sifat karakteristik CK1,
seperti penghambatan oleh CK1-7, kemampuan untuk
memfosforilasi substrat peptida yang sangat spesifik, dan
preferensi yang kuat untuk ATP daripada GTP. Aktivitas
kasein kinase, sebagian dimurnikan dari ekstrak larutP.
falciparum dengan kromatografi afinitas melalui kolom CK1-7
menampilkan sifat yang identik. Aktivitas tersebut
menunjukkan ekspresi spesifik stadium pada parasit, dengan
urutan trofozoit > cincin >> skizon. Analisis utara
menunjukkan keberadaan dua mRNA CK1 utama, panjang 2,4
dan 3,2 kilobase, tingkat yang berada di cincin urutan >
skizon > trofozoit. Mutagenesis CK1 rekombinan
mendefinisikan residu asam amino penting dan peran
potensialnya dalam konformasi enzim. CK1 malaria
tampaknya merupakan salah satu enzim CK1 terkecil dan
mungkin paling primitif yang diketahui, mengandung sedikit
informasi urutan di luar domain katalitik minimal.
Protozoa parasit, Plasmodium falciparum, adalah agen penyebab
malaria di seluruh dunia dan bertanggung jawab atas angka kematian
tahunan hampir 3 juta, yang sebagian besar adalah anak-anak dan
ibu hamil (1). Namun, alat yang tersedia untuk mengendalikan
malaria tidak memadai, dan jenis yang resistan terhadap obat
tersebar luas; apalagi, prospek langsung dari vaksin yang berguna
tidak pasti. Dengan demikian, ada kebutuhan mendesak untuk
memperoleh pengetahuan dasar tentang berbagai proses selulerP.
falciparum pada tingkat molekuler, sehingga target yang rentan
dapat diidentifikasi. Dengan tujuan jangka panjang ini, kami telah
memulai studi tentang sistem transduksi sinyal diP. falciparum.
Karena fosforilasi dan defosforilasi protein reversibel merupakan
mekanisme utama transduksi sinyal (2), salah satu tujuan langsung
kami adalah mengkarakterisasi berbagai protein kinase di
P.falciparum. Dalam makalah ini, kami melaporkan karakterisasi,
ekspresi, tahap-
* Biaya publikasi artikel ini sebagian dibiayai oleh pembayaran biaya
halaman. Oleh karena itu, artikel ini harus diberi tanda “iklan” sesuai
dengan 18 USC Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini.
Sebuah akun awal dari pekerjaan ini dipresentasikan pada Molecular
Parasitology Meeting VII di Woods Hole, MA (15-19 September 1996).
Urutan nukleotida yang dilaporkan dalam makalah ini telah diserahkan
ke GenBankTM/EBI Data Bank dengan nomor aksesi AF017139.
Kepada siapa korespondensi harus ditujukan. Telp.: 334-460-6860; Faks:
334-460-6127; Email: sbarik@jaguar1.usouthal.edu.
26132
Ini adalah artikel Akses Terbuka di bawah CC BY lisensi.
Jil. 272, No. 42, Edisi 17 Oktober, hlm. 26132–26138, 1997
Dicetak di AS
regulasi spesifik, dan analisis mutasi P. falciparumkasein kinase 1
(PfCK1).1
Kasein kinase-1 dan -2 (CK1 dan CK2) adalah protein kinase Ser/
Thr multipotensial, awalnya dimurnikan dari lisat retikulosit
kelinci menggunakan kasein sebagai substrat (ditinjau dalam Ref.
3 dan 4). Pada tahun-tahun berikutnya, kedua enzim terbukti
memfosforilasi, dan dengan demikian mengatur, berbagai
macam protein seluler. Penjajaran urutan gen CK1 dari berbagai
organisme dan analisis penghapusan ragi rekombinan CK1 baru-
baru ini menghasilkan penggambaran domain berikut dalam
prototipe enzim ragi 45-kDa (diringkas dalam Ref. 5 dan 6):
domain katalitik N-terminal dari sekitar 300 asam amino yang
diikuti oleh regangan 12-residu yang dipertahankan di antara
beberapa bentuk tetapi tidak dalam bentuk lain; segmen 85-
residu hidrofilik diprediksi fleksibel dan kaya akan Pro dan Ser;
dan akhirnya, situs prenilasi terminal-C 43-residu yang berisi
sinyal lokalisasi. Struktur kristal dari inti katalitik 298-residu dari
Schizosaccharomyces pombe CK1 dalam kompleks dengan
MgATP baru-baru ini telah dijelaskan pada resolusi 2,0-Å (6).
Struktur tersebut menunjukkan peran sejumlah residu yang
dilestarikan dalam berbagai fungsi katalitik enzim, seperti
pengikatan ATP, Mg21, dan gugus fosfat dari substrat.
Untuk mengkonfirmasi identitas cDNA CK1 (PfCK1) malaria,
kami telah mempelajari sifat biokimia dari enzim malaria
rekombinan secara rinci dan membandingkannya dengan
aktivitas enzim asli. Selain itu, analisis mutasi awal enzim
dilakukan untuk memastikan sifat esensial dari beberapa residu
invarian dan pengaruhnya terhadap parameter enzimatik. Studi
ekspresi spesifik tahap gen PfCK1 menyarankan peraturan
transkripsi dan pasca-transkripsi. Hasil kami merupakan laporan
pertama dari enzim CK1 dalam parasit protozoa eukariotik.
PROSEDUR EKSPERIMEN
Kultur dan Ekstrak Parasit—P. falciparumstrain Dd2 dipertahankan
dalam kultur eritrosit yang dimodifikasi (7, 8). Kultur disinkronkan dengan
pemurnian tahap schizont lebih dari 65% Percoll (Pharmacia) bantal diikuti
dengan inkubasi parasit tahap cincin di 5%D-sorbitol (9). 1 liter sinkronP.
falciparum kultur tahap yang sesuai dan pada parasitemia 15-20% diobati
dengan saponin (konsentrasi akhir 0,1%) untuk melisiskan eritrosit. Pelet
parasit disuspensikan kembali dalam buffer lisis (50 mM Tris-Cl, pH 7,6, 2 m
M dithiothreitol, 2 mM MgCl2, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 10 Mg/ml
leupeptin, 1% (v/v) aprotinin), dihomogenkan, dan disonikasi sebentar
pada suhu 4 °C. Lisat disentrifugasi pada 100.0003 G selama 1 jam pada
suhu 4°C. Supernatan (S100) menjadi sasaran pengendapan amonium
sulfat (0-60%) diikuti oleh resuspensi dan dialisis fraksi pelet dalam buffer
di atas.
Isolasi dari P. falciparum DNA genomik dan RNA dari Saponin-
1 Singkatan yang digunakan adalah: PfCK1, P. falciparum kasein kinase 1; CK1
dan CK2, kasein kinase-1 dan -2, masing-masing; kb, pasangan kilobase;
HALAMAN, elektroforesis gel poliakrilamida.
Makalah ini tersedia secara online di http://www.jbc.org
 Malaria Kasein Kinase 1
lisis P. falciparumeritrosit yang terinfeksi dan kloning cDNA ke dalam
pBlueScript telah dijelaskan (10).
Ekspresi Gen CK1 Malaria pada Bakteri—Kerangka baca terbuka gen
PfCK1 diduga (975 pasangan basa) disubklon dari pBlueScript-SK6
terhadap ekspresi bakteri berbasis T7 plasmid pET3a sebagai berikut. Gen
tersebut diamplifikasi oleh primer berikut (sesuai dengan 59- dan 39-ujung
gen, masing-masing): 59-GGAGTT-GCATATGGAAATTAGAGTGGCA-39 dan 5
9-GAGGATCCATCAATTA-TTTCGTTGATCTC-39 (NS Ndesaya dan bamsitus HI
digarisbawahi). Produk PCR dibatasi denganNdesaya dan bamHI dan
kloning ke dalam dua situs yang sama dari pET3a atau pET15b seperti yang
dijelaskan (11). Klon yang dihasilkan, ditunjuk pET3a-PfCK1 atau pET15b-
PfCK1, dikonfirmasi oleh sekuensing DNA dan dimasukkan ke dalamE. coli
BL21(DE3). Pertumbuhan transforman, induksi dengan isopropil-1-tio-B-D
-galactopyranoside, dan lisis dengan lisozim-EDTA dilakukan pada
dasarnya seperti yang dijelaskan sebelumnya (11). SDS-PAGE dilakukan
menurut Laemmli (12), menggunakan 14% akrilamida
(akrilamida:bisakrilamida5 30:0.4) gel untuk protein dan gel 40% untuk
peptida.
Mutagenesis dan penghapusan gen CK1 yang dikloning dilakukan
dengan metode "megaprimer" berbasis PCR seperti yang dijelaskan
sebelumnya (13).
Pemurnian PfCK1 Rekombinan—Ekstrak total 1 g sel BL21(DE3)
terinduksi yang mengandung plasmid pET3a-PfCK1 disiapkan seperti di
atas dan disonikasi untuk memotong DNA kromosom dan mengurangi
viskositas (5). Lisat disentrifugasi pada 120.0003 G, dan supernatan (S100)
yang mengandung CK1 rekombinan terlarut dimuat pada kolom DEAE-
selulosa 8-ml yang diseimbangkan dengan buffer A (50 mM
Tris-Cl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5% gliserol, 1 mM dithiothreitol) mengandung
20 mM NaCl. Menggunakan gradien NaCl dalam buffer A, enzim kemudian
dielusi pada konsentrasi NaCl sekitar 80 mM. Fraksi yang dikumpulkan
langsung diterapkan ke kolom fosfoselulosa 5 ml yang diseimbangkan
dengan buffer A ditambah 80 mM NaCl dan kemudian dielusi pada sekitar
0,5 M NaCl dalam gradien garam. Fraksi fosfoselulosa, sudah sangat murni
(Gbr. 8,jalur 1), dipekatkan dengan penyaringan melalui kartrid
Centricon-10 dan selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel
melalui Sephadex G-50 (Gbr. 8, jalur 2), dari mana ia dielusi sebagai
monomer nyata (data tidak ditampilkan).
CK1 bertanda polihistidin dan mutannya (dari klon pET15b-PfCK1) pada
dasarnya dimurnikan seperti yang dijelaskan (5). Sebagai perbandingan,
CK1 rekombinan murniD subunit, dinyatakan dalam Escherichia coli (14),
dibeli dari New England Biolabs (Bedford, MA).
Kromatografi Afinitas CK1—Sepharose digabungkan dengan senyawa
isoquinolinesulfonamide CK1-7 (Seikagaku America, Ijaxville, MD), inhibitor
CK1 spesifik, dihasilkan dengan mereaksikan 5 mg CK1-7 dengan 0,5 ml
Sepharose 4B yang diaktifkan CNBr mengikuti prosedur standar.
Kromatografi afinitas enzim CK1 pada kolom ini dilakukan pada dasarnya
seperti yang disarankan (15), dengan beberapa modifikasi sebagai berikut.
0,1 ml (1,0 mg protein) ekstrak S100 malaria dilewatkan empat kali melalui
kolom CK1-7. Kolom dicuci terlebih dahulu dengan 1 ml buffer B yang
mengandung 1 mM dithiothreitol dan kemudian dengan 0,5 ml 0,2 M
arginin. CK1 terikat dielusi dengan 0,3 ml 0,8M
arginin (15). Eluat didialisis semalaman terhadap buffer B yang
mengandung 5 mM B-mercaptoethanol dan disimpan beku pada 280 °C.
Uji Kasein Kinase—Kecuali disebutkan sebaliknya, reaksi uji protein
kinase standar (10 Ml) berisi sebagai berikut: 20 MG A-kasein (tidak
terdefosforilasi; dari Sigma) atau 1 mM dari peptida sintetis
KRRRALpSVASLPGL (di mana pS mewakili fosfoserin) (New England
Biolabs), 15 MM (10 MCi) [G-32P]ATP (atau [G-32P]GTP dari aktivitas spesifik
yang sama, jika disebutkan), 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, dan 50-100
ng kinase murni dalam buffer B (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 120 mM
NaCl, 5% gliserol). Jika diindikasikan, heparin atau CK1-7 juga dimasukkan
dalam reaksi. 10 mM larutan stok CK1-7 dibuat di Me2SO, dari mana
pengenceran yang sesuai dibuat dalam air segera sebelum digunakan.
Reaksi dimulai dengan penambahan kinase dan diinkubasi selama 15
menit pada suhu 37 °C. Ketika peptida sintetis adalah substrat, 2-4Ml reaksi
dihentikan dengan penambahan buffer sampel SDS, dididihkan selama 5
menit, dan dianalisis dengan elektroforesis dalam gel poliakrilamida 40%
yang mengandung SDS (16), diikuti dengan autoradiografi. Jika diperlukan,
autoradiograf dipindai secara densitometri. Ketika kasein digunakan
sebagai substrat,32Penggabungan P dihitung dengan pengendapan asam
trikloroasetat pada kertas Whatman 31-ET (17). Satu unit kasein kinase
didefinisikan sebagai aktivitas yang mampu menggabungkan 1 nmol fosfat
ke kasein dalam 1 jam pada suhu 37 °C. Parameter katalitik (Vmaksimal, Kkucing,
dan KM) diukur dalam kondisi pengujian standar dan dihitung dengan
metode Eadie-Hofstee (18, 19). KM kasein dihitung berdasarkan asumsi
massa molekul 24 kDa. Reaksi kasein kinase 2 (CK2) dilakukan di bawah
kondisi yang identik menggunakan CK2 rekombinan (11).
26133
HASIL
Identifikasi Homolog CK1 cDNA pada Parasit Malaria—Urutan
klon acak dari a P. falciparumPustaka cDNA di Malaria Parasite
Gene Sequencing Project (20) mengidentifikasi klon dengan
sisipan 1,3-kb, yang menampilkan homologi signifikan dengan
urutan CK1 di basis data Pusat Informasi Bioteknologi Nasional.
Gen CK1 diduga ini, yang disebut gen PfCK1, berisi kerangka baca
terbuka 975-nukleotida dengan potensi untuk mengkode
polipeptida dari 324 asam amino. 39-urutan PfCK1 yang tidak
diterjemahkan panjangnya 190 nukleotida, diikuti oleh ekor
poli(A). Urutan deduksi polipeptida PfCK1 menunjukkan
kesamaan yang luas dengan wilayah katalitik terminal-N dari
polipeptida CK1 yang diketahui. Perbandingan representatif
dengan CK1 manusia dan ragi ditunjukkan pada Gambar. 1.
Protein PfCK1 ditemukan 59% mirip dengan urutan manusia;
kesamaan meningkat menjadi 69% jika penggantian konservatif
juga disertakan. Signifikansi khusus adalah temuan bahwa PfCK1
pada dasarnya mengandung semua residu asam amino yang
benar-benar invarian dalam semua protein CK1 yang diketahui
(Gbr. 1,tanda bintang). Tujuh residu PfCK1 yang merupakan
pengecualian untuk ini ditunjukkan oleh:titik di atas mereka (Gbr.
1); tiga di antaranya adalah pengganti nonkonservatif,yaitu.
melalui78, Tiru165, dan Ser245, residu invarian yang sesuai di semua
CK1 lainnya adalah Asn, Ile, dan Pro, masing-masing. Karena CK1
malaria aktif secara katalitik (lihat di bawah), kita dapat
menyimpulkan bahwa ketiga residu ini mungkin tidak penting
dalam katalisis.
Organisasi Gen PfCK1—Untuk mengumpulkan pengetahuan awal
tentang organisasi gen PfCK1, kami melakukan analisis Southern blot
dari restriksi yang dicerna endonuklease P. falciparum DNA genom
menggunakan 32Sisipan cDNA PfCK1 berlabel P sebagai probe. Seperti
yang ditunjukkan pada Gambar. 2A, sebagian besar enzim restriksi
menghasilkan pita tunggal, menunjukkan keberadaan gen CK1
tunggal. Analisis RNA blot (Utara) (Gbr. 2B) mengungkapkan adanya
dua kelas ukuran transkrip, yaitu. 2.4 dan 3.2kb. Karena panjang
gabungan dari urutan pengkodean PfCK1 dan 39-urutan yang tidak
diterjemahkan adalah 1,17 kb, 59-urutan yang tidak diterjemahkan
tampaknya memiliki panjang setidaknya 1,2 kb. Ini agak panjang 59-
urutan yang tidak diterjemahkan adalah tipikal dari banyak transkrip
parasit malaria (10). Masih harus ditentukan apakah kedua transkrip
tersebut disebabkan oleh peristiwa transkripsi yang berbeda atau
merupakan produk dari penyambungan alternatif.
Karakterisasi Aktivitas CK1 Parasit Malaria—Untuk mengidentifikasi
aktivitas CK1 di P. falciparum, kami menggunakan ekstrak S100 untuk
kromatografi afinitas menggunakan senyawa
isoquinolinesulfonamide, CK1-7 (15). Fraksi protein malaria yang
diperoleh dengan cara ini menunjukkan aktivitas kasein kinase yang
kuat (Gbr. 3) yang resisten terhadap heparin (aktivitas 90% dengan 25
Mg/ml heparin) tetapi sensitif terhadap CK1-7 (66 dan 85%
penghambatan dengan 10 MM dan 20 MM CK1-7, masing-masing).
Fraksi CK1 malaria asli juga secara efisien memfosforilasi
substrat peptida spesifik CK1, KRRRALpS-VASLPGL, di mana Ser
yang digarisbawahi adalah situs fosforilasi CK1 (Gbr. 4). 40MM
CK1-7 menghambat fosforilasi hampir 80% pada konsentrasi ATP
15 MM (jalur 4). CK1 rekombinanD isoform testis tikus dinyatakan
dalam E. coli (22) menunjukkan penghambatan yang pada
dasarnya serupa oleh CK1-7 (jalur 2). Menariknya, heparin (10Mg/
ml) merangsang aktivitas sekitar 2 kali lipat. Seperti yang dibahas
kemudian, efek stimulasi unik dari heparin, diamati hanya ketika
peptida kecil digunakan sebagai substrat, juga ditunjukkan
dengan CK1D isoform (17). Enzim menunjukkan preferensi yang
ditandai untuk ATP; GTP digunakan jauh lebih efisien (Gbr. 4,jalur
6). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwaP. falciparum
mengandung aktivitas protein kinase yang pada dasarnya identik
dengan CK1.
Ekspresi spesifik tahap PfCK1 mRNA dan Enzim—NS
26134 Malaria Kasein Kinase 1

FAKU G. 1.Penjajaran urutan asam amino

polipeptida CK1. Urutan asam amino yang
diprediksi dari malaria, manusia (21), dan
ragi (S. pombe; Ref. 22) Polipeptida CK1
telah dibandingkan menggunakan program
PILEUP dan PRETTY dari paket Grup
Komputer Genetika (Madison, WI). NS
penomoran didasarkan pada urutan
malaria. Tanda bintang menunjukkan residu
asam amino yang invarian dalam semua
isoform CK1 yang diketahui yang
diidentifikasi hingga saat ini; residu malaria
yang merupakan pengecualian dari aturan
ini ditunjukkan oleh:titik di atas NS residu.

parasit malaria mengalami perubahan morfologi yang berbeda
selama perkembangan melalui siklus hidup intraeritrositiknya:
cincin (tahap pematangan awal setelah invasi), trofozoit (sel
mononukleat yang lebih besar yang aktif secara metabolik yang
mengandung pigmen hemozoin), dan skizon (sel berinti banyak).
Untuk mengatasi apakah gen PfCK1 diekspresikan dalam cara
khusus tahap melalui siklus hidup yang rumit ini, sampel RNA
diisolasi dari kultur yang disinkronkan setiap 6 jam. Seperti yang
ditunjukkan oleh Gambar. 5, ekspresi transkrip PfCK1 memang
diatur oleh siklus sel. Kedua kelas ukuran transkrip menunjukkan
ekspresi puncak pada tahap cincin awal dan hampir tidak
terdeteksi pada tahap trofozoit dan skizon.
Menariknya, ketika kami menentukan aktivitas spesifik CK1
dalam ekstrak S100 dari berbagai tahap parasit, gambaran yang
berbeda muncul. Menggunakan substrat fosfopeptida spesifik,
aktivitas CK1 tertinggi ditemukan pada trofozoit, diikuti oleh
cincin, sedangkan aktivitas pada skizon hampir tidak terdeteksi
(Gbr. 6). Kegiatan relatif dalam tiga tahap,
ditentukan dengan pemindaian densitometri, berada pada rasio
100:42:3. Keaslian aktivitas CK1 selanjutnya diverifikasi oleh
sensitivitasnya terhadap inhibitor CK1-7 dan dibandingkan
dengan CK1D (Gambar 6). Pada 20MM CK1-7, misalnya, aktivitas
semua tahap dihambat oleh 85-90%.
Substrat Endogen Malaria CK1—Dalam upaya untuk
mendapatkan perkiraan awal substrat alami CK1 malaria, kami
menjadikan ekstrak S100 dari tiga tahap utama parasit untuk
memfosforilasi sendiri, di mana jumlah yang sama dari protein
S100 diinkubasi dengan adanya [G-32P]ATP dan peningkatan
konsentrasi CK1-7. Analisis produk reaksi pada SDS-PAGE, seperti
yang ditunjukkan pada Gambar. 7, menghasilkan sejumlah
temuan, yang diringkas sebagai berikut. (A) Sejumlah polipeptida
malaria tampaknya berfungsi sebagai substrat untuk kinase
endogen. Spesies fosfoprotein utama yang umum di kedua cincin
dan trofozoit menunjukkan massa molekul 66, 60, 33, dan 27 kDa
di samping sejumlah spesies dengan berat molekul tinggi,
sedangkan 42-
 Malaria Kasein Kinase 1
FAKU G. 2.A, Analisis Selatan P. falciparum DNA genom Dd2. 3Mg DNA
genom, dibatasi dengan enzim berikut, menjadi sasaran analisis Selatan
menggunakan PfCK1 cDNA sebagai probe (10). Jalur 1, NdeSAYA;jalur 2, pst
SAYA; jalur 3, ramah lingkunganRI; jalur 4, ramah lingkunganRV; jalur 5,
bamHAI; jalur 6,hindIII; jalur 7, XbaSAYA; jalur 8, KpnSAYA. B, Analisis utara
RNA CK1. 10Mg dari total P. falciparum RNA dari kultur asinkron diperiksa
dengan cDNA PfCK1 (10). Penanda DNA dan RNA standar ditampilkan.
FAKU G. 3.Aktivitas kasein kinase dari PfCK1 asli. Sekitar 20 ng fraksi
enzim malaria yang dimurnikan dengan kromatografi afinitas melalui
kolom CK1-7 diuji untuk aktivitas kasein kinase dalam reaksi fosforilasi
standar, diikuti dengan analisis dalam SDS-PAGE.jalur M mewakili jalur
bernoda yang mengandung kasein; jalur lain adalah autoradiograf. Reaksi
fosforilasi dilakukan dengan penambahan berikut: tidak ada (jalur 1); 25M
g/ml heparin (jalur 2); 10MM
CK1–7 (jalur 3); dan 20MM CK1–7 (jalur 4). jalur 0 adalah kontrol (tidak ada
enzim).
FAKU G. 4.Aktivitas PfCK1 asli pada substrat peptida tertentu.
Fosforilasi peptida KRRRALpSVASLPGL oleh 20 ng CK1 malaria asli
(pemurnian afinitas CK1-7) (jalur 3–6) atau dengan CK1 komersial (jalur 1
dan 2) dan analisis reaksi oleh SDS-PAGE diikuti dengan autoradiografi
dilakukan seperti yang dijelaskan di bawah "Prosedur Eksperimental."
Donor fosfat adalah [G-32P]ATP (jalur 0–5) atau [G-32P]GTP (jalur 6).
Penambahan reaksi fosforilasi adalah sebagai berikut: tidak ada (jalur 1, 3,
dan 6); 40MM CK1–7 (jalur 2 dan4); 10Mg/ml heparin (jalur 5).
dan spesies 36-kDa dominan dalam cincin saja. Skizon, di sisi lain,
menunjukkan pola yang sangat berbeda dari cincin atau trofozoit
dan terdiri dari dua spesies utama sekitar 98 dan 75 kDa. Dalam
ketiga ekstrak, sebagian besar fosfoprotein tampak kecil
Plasmodium Protein S100, seperti yang dinilai dengan
membandingkan pita di autoradiogram dengan yang ada di gel
diwarnai Coomassie Blue (panel A). (B) Dengan meningkatnya
konsentrasi CK1-7, pita terfosforilasi dari cincin dan trofozoit
mulai menghilang jauh lebih awal daripada skizon. Pada 50MM
CK1-7, misalnya, fosforilasi ekstrak cincin dan trofozoit hampir
sepenuhnya dihambat, sedangkan skizon tetap tidak terpengaruh
secara substansial. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa
CK1 mungkin merupakan protein kinase utama pada tahap cincin
dan trofozoit, sedangkan tahap skizon mungkin memiliki susunan
kinase yang berbeda. (C) Dalam upaya untuk menilai apakah pola
fosfoprotein spesifik tahap disebabkan oleh perbedaan tingkat
substrat atau enzim, rekombinasi yang dimurnikan
26135
FAKU G. 5.Ekspresi spesifik panggung dari mRNA PfCK1. Total RNA
diisolasi setiap 6 jam dari synchronous P. falciparum budaya Dd2. Sekitar 4
Mg sampel RNA dari setiap titik waktu dianalisis seperti pada GambarB.
Jalur 1, trofozoit awal; jalur 2, trofozoit;jalur 3, trofozoit dewasa/skizon
awal; jalur 4, skizon; jalur 5, tersegmentasi; jalur 6, dering awal; jalur 7,
cincin. Posisi penanda RNA standar (dalam kb) ditampilkan. Jumlah relatif
transkrip, ditentukan oleh pemindaian densitometrik dari autoradiograf,
dalam rasio berikut (kiri ke Baik): 4:14:12:22:45:100:98.
FAKU G. 6.Aktivitas PfCK1 khusus tahap. Uji fosforilasi peptida dilakukan
persis seperti yang dijelaskan pada Gambar. 4 legenda menggunakan 4Mg
ekstrak khusus tahap (cincin (R); trofozoit (T); skizon (S)), disiapkan seperti
yang dijelaskan di bawah "Prosedur Eksperimental." Angka di atas
menunjukkan konsentrasi CK1-7 (MM) yang digunakan dalam reaksi. Jalur C
adalah reaksi tanpa kinase; jalur ditandai CK1 mewakili reaksi dengan CK1
commercial komersialD.
nant malaria CK1 ditambahkan ke ekstrak dari ketiga tahap (Gbr. 7,
jalur dengan tanda plus). Menariknya, ini mengembalikan pola skizon
menyerupai cincin dan trofozoit, sedangkan pola dari dua tahap
terakhir tetap hampir tidak berubah. Seperti yang diharapkan, hanya
pita-pita dalam ekstrak skizon yang disebabkan oleh CK1 yang
ditambahkan secara eksogen yang menunjukkan sensitivitas
terhadap CK1-7. Hasil ini sangat menyarankan bahwa skizon secara
substansial tidak memiliki aktivitas CK1 daripada substrat CK1.
Aktivitas Enzimatik CK1 Malaria yang Diekspresikan Secara Bakteri
—Setelah induksi BL21(DE3) yang mengandung pET3a-PfCK1 dengan
isopropil-1-thio-B-D-galactopyranoside, polipeptida dari MR
;37.000 diproduksi (Gbr. 8), yang sesuai dengan perkiraan berat
molekul 37.807 untuk polipeptida kerangka baca terbuka CK1,
dengan mempertimbangkan sedikit kebasaan keseluruhan dari
polipeptida yang diprediksi (42 residu Asp dan Glu; 55 Lys dan Arg
residu). Protein 37-kDa dimurnikan dengan kromatografi melalui
DEAE dan fosfoselulosa dan kemudian dengan filtrasi gel
menggunakan Sephadex G50. Selama pemurnian, aktivitas kasein
kinase selalu dikromatografi dengan polipeptida 37-kDa.
Persiapan akhir (Gbr. 8,jalur 2) setidaknya 90% murni, tanpa
kontaminan tunggal yang menyusun lebih dari 5% polipeptida 37-
kDa. In vitro, enzim rekombinan yang dimurnikan secara efisien
memfosforilasi kasein (Gbr. 9) dengan aktivitas spesifik ;1020
unit/Mgram protein. Aktivitas tersebut resisten terhadap heparin
(25Mg / ml) tetapi dihambat oleh sekitar 70 dan 80% dengan
adanya 10 dan 20 MM CK1-7, masing-masing (Gbr. 9). Di bawah
kondisi reaksi yang sama, CK2 murni dihambat oleh heparin
tetapi dipertahankan sekitar 90 dan
26136 Malaria Kasein Kinase 1
FAKU G. 7.Fosforilasi endogen dari P. falciparum ekstrak. 5 Mg ekstrak
sitosol cincin (R), trofozoit (T), dan skizon (S) tahapan Plasmodium
difosforilasi sendiri dalam reaksi kinase standar menggunakan [G-32P]ATP
tanpa substrat eksogen. Reaksi dianalisis dalam SDS-PAGE dan
autoradiografi (panel B).Panel A mewakili gel bernoda yang mengandung
80 Mg dari setiap ekstrak seperti yang ditunjukkan. Angka di kiri
menunjukkan ukuran penanda protein (kDa);angka pada atas
menunjukkan konsentrasi CK1-7 (MM) termasuk dalam reaksi. NStanda plus
menunjukkan reaksi di mana tambahan 50 ng PfCK1 rekombinan murni
ditambahkan ke ekstrak. Pita fosfoprotein utama ditandai sebagai berikut
sesuai dengan keberadaan mereka dalam ekstrak: cincin dan trofozoit (titik
tunggal); cincin saja (titik ganda); khusus skizon (mata panah).
FAKU G. 8.Ekspresi PfCK1 rekombinan dalam E. coli. Malaria CK1 atau
turunan fusinya dikloning dan diekspresikan masing-masing dalam pET3a
atau pET15b, seperti yang dijelaskan dalam "Prosedur Eksperimental." Sel
BL21(DE3) yang mengandung klon CK1 rekombinan berikut diinduksi
dengan isopropil-1-thio-B-D-galaktopiranosida (2jalur; atau tidak diinduksi,
1 jalur), dan total ekstrak (2 dan 1 jalur) atau pecahan murni (jalur 1, fraksi
fosfoselulosa; jalur 2, fraksi Sephadex G-50) dianalisis pada SDS-PAGE
diikuti dengan pewarnaan dengan Coomassie Blue: wild type CK1 (jalur 1,
2, 1, dan 2); poli-tipe liar yang dimurnikan dengan tag-Nya (jalur 3); G21A
mutan (jalur 4); K38L mutan (jalur 5), dan terminal-C D18 mutan (jalur 6;
lihat teks untuk detailnya).jalur Mmewakili standar protein dalam kDa. Pita
CK1 ditunjukkan oleh:mata panah.
70% aktivitas di hadapan 10 dan 20 MM CK1-7, masing-masing (3,
14). Dengan demikian, fraksi CK1 malaria rekombinan
menunjukkan sifat-sifat yang khas dari kelas enzim CK1 asli.
Parameter katalitik, diukur dengan adanya 15MM ATP dan 2 Mg
kasein per Ml adalah sebagai berikut: Vmaksimal, 17,5 6 1.5 Mmol
kasein/mg enzim/menit; Kkucing, 15,5 6 1.2 detik21; KM (kasein), 110
6 10 MM, menghasilkan Kkucing:KM rasio 8,45M 21 min21.
M sebelumnya, menghasilkan satu-satunya struktur kristal CK1 yang
Dalam upaya untuk menyederhanakan prosedur pemurnian dan
untuk dapat dengan cepat menyaring berbagai mutan CK1 di masa
depan, kami juga telah mengkloning PfCK1 menjadi pET15b. Ini
menghasilkan fusi peptida kaya histidin 2-kDa MGSS(H)6SSGLVPRGSH
ke CK1, yang meningkatkan MR protein rekombinan menjadi sekitar
39 kDa. Protein fusi dapat dimurnikan hingga mendekati
homogenitas dalam satu langkah menggunakan a
FAKU G. 9.Fosforilasi kasein oleh PfCK1 rekombinan. Kasein difosforilasi
oleh CK1 malaria rekombinan murni (CKI) atau dengan kontrol CK2 (CKII)
dalam reaksi fosforilasi standar menggunakan [G-32P]ATP sebagai donor
fosfat. Reaksi dianalisis dengan SDS-PAGE, diikuti dengan pewarnaan dan
autoradiografi.Panel B menunjukkan autoradiografi, dan panel A
menunjukkan bagian gel yang diwarnai yang representatif (M, standar 20-
kDa; S, kasein). Reaksi fosforilasi dilakukan dengan adanya hal-hal berikut:
tidak ada penambahan (jalur 1 dan 7); 25Mg/ml heparin (jalur 2 dan 8);
CK1–7, 10MM (jalur 3 dan 9), dan 20MM (jalur 4 dan 10). Jalur 6 mewakili
reaksi menggunakan CK1 komersial (New England BioLabs), dan jalur 5
menunjukkan kontrol (tidak ada enzim).
kolom nikel (Gbr. 8, jalur 3), dan menunjukkan aktivitas spesifik yang pada
dasarnya identik dengan aktivitas rekombinan nonfusi (data tidak
ditampilkan).
Analisis Mutasi Rekombinan Malaria CK1—Peregangan peptida
GxGXXG (residu 16–21), diikuti oleh Lys38
16 residu hilir, dilestarikan di semua inti katalitik CK1 dan
dianggap terlibat dalam pengikatan ATP (23). Studi kristalografi
telah menyarankan bahwa bagian trifosfat ATP berinteraksi
dengan tiga residu bermuatan CK1,yaitu., Lys38, Lys130, dan Asp151
dan dengan tulang punggung amida dari Gly21
(6). Selain itu, Asn133 telah terlibat dalam koordinasi Mg . tunggal12 ion
dalam CK1. Namun, tidak ada studi mutasi rinci untuk memvalidasi
prediksi ini telah dilakukan. Dalam laporan sebelumnya, mutan K38N
dilaporkan sebagai "kinasedead", meskipun mekanisme pasti dari
cacat tersebut tidak dipelajari (14). Karena CK1 rekombinan malaria
aktif secara enzimatik, ini memberi kami kesempatan untuk
menganalisis peran residu spesifik oleh mutagenesis yang diarahkan
ke lokasi. Studi awal kami menggunakan mutan fusi PfCK1 G21A dan
K38L yang diekspresikan dalam pET-15b (Gbr. 8,jalur 4 dan 5). Dalam
uji kasein kinase standar, kedua mutan ditemukan sangat rusak.
Namun, untuk studi kinetik yang terperinci, kami menyatakan ini dan
mutan lainnya dalam vektor pET-3a, bebas dari urutan eksogen apa
pun. Data kinetik yang disajikan pada Tabel I mengungkapkan bahwa
mutan K38L, K130L, dan D151N semuanya memiliki peningkatan yang
sangat tinggi.KM untuk ATP dan sama-sama rusak Kkucing. Menariknya,
mutan ini juga menunjukkan yang lebih tinggiKM untuk Mg21, yang
mendukung gagasan bahwa Mg21 mengikat ATP, dan bahwa Mg21-ATP
kompleks dikoordinasikan dengan residu CK1 yang relevan. Ini lebih
lanjut dikonfirmasi oleh mutasi timbal balik N133A, yang tidak hanya
meningkatkanKM untuk Mg21 seperti yang diharapkan tetapi juga
memiliki efek parah pada KM untuk ATP. Pergantian Gly21 dengan
alanin memiliki efek paling kecil pada parameter enzimatik, mungkin
karena kedua asam amino sangat mirip dan ikatan peptida Gly21
daripada rantai sampingnya didalilkan untuk berinteraksi dengan ATP
(6).
Panjang minimal enzim CK1 fungsional tetap tidak terdefinisi.
Pemotongan asam amino C-terminal 148 dari CKi1 rekombinan
dariS. pombe (produk dari cki1 gen) menghasilkan inti 298-residu
yang hanya berisi 3 residu di luar dipeptida DW invarian (5). "Inti
katalitik" ini aktif secara enzimatik dan, seperti yang disebutkan
tersedia hingga saat ini (6). Namun, penghapusan yang lebih
besar dari ini atau isoform CK1 lainnya belum dilaporkan. Untuk
menggambarkan panjang minimal inti katalitik CK1, kami telah
melakukan penghapusan terminal enzim malaria dalam klon
pET-3a rekombinan. Mutan terpotong diekspresikan dalam
bakteri, dimurnikan, dan diuji menggunakan kasein sebagai
substrat. Penghapusan 18 residu asam amino dari
 Malaria Kasein Kinase 1
TMAMPU Saya
Parameter kinetik enzim PfCK1 mutan
Reaksi kinase menggunakan kasein sebagai substrat dan penentuanKM
dan Kkucing dilakukan seperti yang dijelaskan di bawah "Prosedur
Eksperimental." Semua enzim CK1 yang digunakan dalam percobaan ini
diekspresikan dari vektor pET-3a dan tidak memiliki urutan eksogen,yaitu
milik-Nya6 peptida fusi. DC18 memiliki aktivitas mendekati normal dan, oleh
karena itu, tidak dipelajari secara rinci. Nilai SD dihitung dari tiga
pengukuran independen.
Enzim KM dari Mg21 KM dari ATP Kkucing
MM MM S21 3 100
Tipe liar 12 6 1 14 6 1.5 1550 6 170
K38L 1450 6 130 2240 6 150 12 6 2
K130L 1235 6 120 2500 6 210 861
D151N 1125 6 90 1250 6 110 10 6 2
N133A 2250 6 180 1125 6 102 11 6 2
G21A 15 6 1.8 150 6 12 72 6 10
DC36 21 6 2 25 6 2 124 6 11
DN8 32 6 2 40 6 3 115 6 10
ujung C (DC18) dari PfCK1 ditemukan mempertahankan 80%
aktivitas tipe liar. Pada dasarnya hasil yang sama diperoleh ketika
DC18 mutan (Gbr. 8, jalur 6) memiliki fusi-Nya di ujung N. Namun,
penghapusan 36 residu dari terminal C, yang mengakibatkan
hilangnya DW invarian, menghasilkan enzim yang pada dasarnya
tidak aktif. Penghapusan hanya 8 residu dari ujung N juga
mengakibatkan hilangnya aktivitas, meskipun Gly invarian di
wilayah ini diganti dengan Ala di PfCK1 (Gbr. 1). Parameter kinetik
dari dua enzim terpotong ini,yaitu. DN8 dan DC36,
mengungkapkan cacat yang cukup besar dalam interaksi mereka
dengan Mg-ATP dan cacat yang lebih besar pada Kkucing
(Tabel I), dengan demikian mendefinisikan batas-batas inti katalitik
CK1 minimal dan memastikan bahwa CKi1D298 dari S. pombe
memang mendekati batas ini (5, 6).
DISKUSI
Dalam makalah ini, kami telah mengidentifikasi gen dan enzim
PfCK1 dalam parasit malaria P. falciparum. Kami juga telah
mengkonfirmasi peran beberapa residu PfCK1 yang dilestarikan
melalui studi mutasi yang diarahkan ke lokasi dan menganalisis
ekspresi spesifik tahap parasit dari transkrip PfCK1 dan aktivitas
enzimatiknya. Enzim asli serta rekombinan disintesis diE. coli
menunjukkan sifat diagnostik CK1. Analisis penghapusan PfCK1
(Tabel I) sangat menyarankan peran daerah terminal di luar inti
katalitik yang dilestarikan dalam memodulasi aktivitas enzim.
Anehnya, dalam struktur kristal, tak satu pun dari wilayah ini
diprediksi terlibat langsung dalam pengikatan Mg-ATP atau
fungsi katalitik (6). Jadi, kami menganggap bahwa urutan terminal
ini entah bagaimana dapat mempengaruhi konformasi
keseluruhan enzim atau situs aktifnya. Namun demikian,
penghapusan ini membantu kami menentukan batas inti katalitik
minimal CK1. Sepengetahuan kami, enzim CK1 malaria dengan
panjang asam amino 324 yang dilaporkan di sini adalah salah
satu CK1 terpendek yang terjadi secara alami dan hanya
mengandung 34 residu setelah dipeptida DW invarian (Gbr. 1).
Dalam hal ini, ini sebanding dengan, meskipun sedikit lebih kecil
dari, CK1A dan B isoform eukariota yang lebih tinggi, yang
terpendek adalah sapi CK1A, mengandung 325 asam amino (24).
Ini mungkin menggarisbawahi status evolusi yang lebih primitif
dari parasit wajib ini dibandingkan dengan inang eukariotiknya.
Pada catatan yang sama, PPaku, suatu protein fosfatase
prokariotik, baru-baru ini terbukti mengandung sangat sedikit
informasi urutan di luar domain yang dilestarikan dan, dengan
demikian, tampaknya setara dengan inti katalitik minimal dari
fosfatase eukariotik yang lebih besar (16).
Terutama melalui analisis mutan penghapusan, ekor Cterminal
di luar wilayah CK1 yang dikonservasi telah didalilkan untuk
terlibat dalam sejumlah mekanisme pengaturan.
26137
nisme, yaitu autofosforilasi, autoinhibisi, lokalisasi membran, dan
aktivasi yang dimediasi heparin (Gbr. 4) aktivitas CK1, beberapa di
antaranya mungkin saling terkait (5, 17). Dalam hal ini, enzim
PfCK1 juga tampak unik. Pertama, sebenarnya lebih pendek dari
semua CK1A isoform dan masih diaktifkan oleh heparin. Kedua,
terminal C pendek dari PfCK1 memiliki sangat sedikit homologi
dengan isoform CK1 lainnya (Gbr. 1). Ketiga, dalam studi
pendahuluan, PfCK1 tidak menunjukkan autofosforilasi yang
cukup besar (data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa ini
mungkin tidak diperlukan untuk aktivasi heparin PfCK1. Akhirnya,
kami tidak mendapatkan penghapusan terminal-C dari PfCK1
yang menunjukkan aktivitas lebih tinggi daripada enzim full-
length. Penghapusan terpendek yang diuji (DC18) sebenarnya
kehilangan sekitar 20% aktivitas tetapi pada saat yang sama juga
kehilangan aktivasi heparin (data tidak ditampilkan). Dengan
demikian, tampaknya enzim malaria unik karena tidak memiliki
autofosforilasi dan autoinhibisi tetapi masih mempertahankan
aktivasi heparin, yang kemungkinan besar memetakan dalam 18
residu terakhir terminal C. Mungkin aktivasi heparin memerlukan
konformasi tertentu dalam terminal C yang dicapai melalui
fosforilasi pada isoform CK1 lain tetapi secara konstitutif hadir
dalam PfCK1. Signifikansi regulasi potensial PfCK1 oleh heparin
dalam siklus hidup parasit menunggu studi lebih lanjut. Karena
wilayah terminal-C telah terlibat dalam menargetkan enzim ke
membran (25), akan menarik untuk menentukan apakah CK1
malaria terutama terlokalisasi di kompartemen sitosol sel parasit.
Enzim CK1 pada umumnya diketahui membutuhkan residu asam
(Asp atau Glu) pada sisi N-terminal Ser terfosforilasi dalam substrat,
terutama pada n-3 posisi, di mana Ser berada di posisi n; Namun,
residu terfosforilasi padan-3 menghasilkan hasil yang jauh lebih tinggi
Kkucing:KM rasio (26, 27). Dengan PfCK1 rekombinan atau asli, kami juga
telah melihat fosforilasi substrat peptida KRRRALpS-VASLPGL yang
lebih baik daripada peptida D4 nonfosforilasi (Promega). Ini
mendorong kami untuk menggunakan kasein asli yang belum
mengalami defosforilasi sebagai substrat untuk pengujian CK1in vitro.
Dalam analisis SDS-PAGE kami, kasein komersial bermigrasi dalam
tiga pita: pita utama yang lebih cepat dan dua pita kecil yang
bermigrasi lebih lambat. Malaria CK1 memfosforilasi pita yang
bermigrasi paling lambat jauh lebih efisien (Gbr. 3 dan 9), sedangkan
CK2 lebih suka memfosforilasi pita yang bermigrasi lebih cepat (Gbr.
9). CK1 rekombinan yang diperoleh secara komersialD juga
menyerupai CK1 malaria dalam hal ini (data tidak ditampilkan).
Meskipun kami tidak tahu alasan pasti di baliknya, kami berspekulasi
bahwa spesies yang lebih lambat dapat mewakili bentuk kasein yang
lebih terfosforilasi dan, dengan demikian, berfungsi sebagai substrat
yang lebih baik untuk CK1.
Beberapa karakteristik PfCK1 yang dijelaskan di sini
mengingatkan pada aktivitas protein kinase yang sebelumnya
dijelaskan dalam fraksi sitosolik yang dimurnikan sebagian dari
Plasmodium (28–30). Singkatnya, aktivitas kasein terfosforilasi
serta phosvitin, membutuhkan Mg21, ATP lebih disukai daripada
GTP, dirangsang oleh poliamina spermine dan spermidine, dan
dihambat oleh flavon, quercitin. Tampaknya juga bahwa trofozoit
memiliki aktivitas ini dalam jumlah yang lebih tinggi daripada
tahapan cincin atau skizon (30), yang serupa dengan variasi
spesifik tahapan aktivitas PfCK1 yang telah kami amati (Gbr. 6 dan
7). Apa yang menarik, bagaimanapun, adalah kurangnya korelasi
tingkat keadaan tunak relatif dari PfCK1 mRNA (Gbr. 5) dan
aktivitas enzim (Gbr. 6) dalam berbagai tahapPlasmodium.
Skizon, misalnya, memiliki mRNA CK1 dua kali lebih banyak
daripada trofozoit; namun, skizon memiliki jumlah aktivitas CK1
yang dapat diabaikan, sedangkan trofozoit menunjukkan aktivitas
tertinggi dari ketiga tahap. Dengan demikian, tergoda untuk
berspekulasi bahwaPlasmodium Ekspresi CK1 mengalami
regulasi khusus tahap pada tingkat transkripsi dan pasca-
transkripsi. Perbedaan antara terjemahan
26138 Malaria Kasein Kinase 1
peraturan nasional dan pasca-terjemahan idealnya akan
membutuhkan penggunaan antibodi anti-PfCK1 spesifik, yang saat ini
tidak tersedia.
Keluarga enzim CK1 memfosforilasi berbagai substrat fisiologis
termasuk faktor transkripsi CREM (31), glikogen sintase (32), p53
(33), dan antigen T SV40 (34). Isoform CK1 individu pada eukariota
rendah ditemukan di sitoplasma serta di inti dan memainkan
peran penting dalam regulasi morfogenesis seluler dan
perbaikan DNA (35-37). Self-fosforilasi ekstrak sitoplasma malaria
mengungkapkan sejumlah fosfoprotein (Ref. 29 dan 30; Gambar.
7) identitas yang tidak diketahui. Profil fosfoprotein yang unik
pada tahap skizon (Gbr. 7) paling mudah dijelaskan oleh aktivitas
CK1 yang sangat rendah pada tahap ini dibandingkan dengan
yang lain (Gbr. 6) dan oleh fakta bahwa penambahan CK1
eksogen membuat profil skizon menyerupai orang-orang dari
dua tahap lainnya (Gbr. 7). Namun, kemungkinan bahwa
beberapa protein substrat itu sendiri juga dapat mengalami
ekspresi spesifik tahap telah disarankan (30) dan memerlukan
penyelidikan lebih lanjut untuk implikasi regulasinya yang jelas.
Dalam beberapa tahun terakhir,Plasmodiuminfeksi sel darah
merah manusia terbukti menghasilkan peningkatan fosforilasi
sejumlah protein membran sel darah merah manusia (38-41). Ini
termasuk protein 4.1, polipeptida 80-kDa, fosforilasi yang
ditingkatkan pada tahap infeksi trofozoit-skizon, dan tampaknya
melibatkan aktivitas kasein kinase (40). Meskipun studi tambahan
diperlukan untuk memastikan sifat pasti dari kinase, hasil ini
meningkatkan kemungkinan yang menarik bahwa CK1 malaria
sebenarnya dapat memodulasi interaksi inang-parasit, yang akan
memiliki konsekuensi penting dalam pencegahan dan
pengelolaan malaria. Bagaimanapun, demonstrasi gen CK1 dan
enzim diP. falciparum dan regulasi mereka dalam berbagai tahap
siklus hidup protozoa harus membuka arah baru penelitian di
jalur transduksi sinyal parasit penting secara klinis ini.
Pengakuan-Terima kasih kepada Dr. Ratna Chakrabarti atas keahliannya
dalam prosedur kloning.
REFERENSI
1. Oaks, SC, Mitchell, VS, Pearson, GW, dan Carpenter, CC (1991) diKendala dan
Peluang Malaria, Pers Akademi Ilmu Pengetahuan Nasional, Washington, DC
2. Barik, S. (1996) Subsel. Biokimia.26, 115-164
3. Tuazon, PT, dan Traugh, JA (1991) Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res.23,
123-164
4. Issinger, O.-G. (1993)Farmakol. Ada.59, 1–30
5. Carmel, G., Leichus, B., Cheng, X., Patterson, SD, Mirza, U., Chait, BT, dan Kuret, J.
(1994) J.Biol. Kimia269, 7304–7309
6. Xu, R., Carmel, G., Manis, RM, Kuret, J., dan Cheng, X. (1995) EMBO J. 14,1015–1023
7. Trager, W., dan Jensen, JB (1976) Sains 193, 673–675
8. Haldar, K., Ferguson, MAJ, dan Cross, GAM (1985) J.Biol. Kimia260,4969–4974
9. Lambros, C., dan Vanderberg, JP (1979) J. Parasit. 65, 418–420
10. Chakrabarti, D., Schuster, SM, dan Chakrabarti, R. (1993) Prok. Natal akad. Sci.
Amerika Serikat90, 12020–12024
11. Mazumder, B., Adhikary, G., dan Barik, S. (1994) Ilmu pengetahuan virus 205, 93-103
12. Laemmli, Inggris (1970) Alam 270, 680–685
13. Barik, S. (1995) Metode Neurosci. 26, 309–323
14. Graves, PR, Haas, DW, Hagedorn, CH, DePaoli-Roach, A., dan Roach, P.
(1993) J.Biol. Kimia268, 6394–6401
15. Chijiwa, T., Hagiwara, M., dan Hidaka, H. (1989) J.Biol. Kimia264,4924–4927
16. Ansai, T., Dupuy, L., dan Barik, S. (1996) J.Biol. Kimia271, 24401–24407
17. Graves, PR, dan Roach, P. (1995) J.Biol. Kimia270, 21689–21694
18. Eadie, GS (1942) J.Biol. Kimia146, 85–93
19. Hofstee, BHJ (1959) Alam 184, 1296–1298
20. Chakrabarti, D., Reddy, GR, Dame, JB, Almira, EC, Ferl, RJ Rowe,
TC, dan Schuster, SM (1994) mol. Biokimia. parasit.66, 97-104
21. Ikan, KJ, Cegielska, A., Getman, ME, Landes, GM, dan Virshup, DM
(1995) J.Biol. Kimia270, 14875–14883
22. Kearney, PH, Ebert, M., dan Kuret, J. (1994) Biokimia. Biofis. Res. komuni.203, 231–
236
23. Walker, JE, Saraste, M., Runswick, MJ, dan Gay, NJ (1982) EMBO J. 1,945–951
24. Rowles, J., Slaughter, C., Moomaw, C., Hsu, J., dan Cobb, MH (1991) Prok. Natal akad.
Sci. Amerika Serikat88, 9548–9552
25. Wang, PC, Vancura, A., Deasi, A., Carmel, G., dan Kuret, J. (1994) J.Biol. Kimia269,
12014–12023
26. Aliran, H., Kuburan, PR, Wang, A., Fiol, CJ, Roeske, RW, dan Roach, P.
(1990) J.Biol. Kimia265, 14264-14269
27. Meggio, F., Perrich, JW, Reynolds, EC, dan Pinna, LA (1991) FEBS Lett.
283, 303–306
28. Wiser, MF, Eaton, JW, dan Sheppard, JR (1983) J. Sel. Biokimia.2,305–314
29. Wiser, M., dan Schweiger, H.-G. (1985)mol. Biokimia. parasit.17, 179–189
30. Wiser, M., dan Plitt, B. (1987) Eks. parasit.64, 328–335
31. DeGroot, RP, Hertog, J., Vandenheede, JR, Goris, J., dan Sassone-Corsi, P.
(1993) EMBO J. 12, 3903–3911
32. Roach, PJ (1991) FASEB J. 4, 2961–2968
33. Milne, DM, Palmer, RH, Campbell, DG, dan Meek, DW (1992) Onkogen
7, 1361–1369
34. Cegielska, A., dan Virshup, DM (1993) mol. Biol Sel.13, 1202–1211
35. Hoekstra, MF, Liskay, RM, Ou, AC, DeMaggio, AJ, Burbee, DG, dan Heffron, F. (1991)
Sains 253, 1031–1034
36. Robinson, LC, Hubbard, EJ, Graves, PR, DePaoli-Roach, AA, Roach, P.
J., Kung, C., Haas, DW, Goebl, M., Cublertson, MR, dan Carlson, M. (1992) Prok.
Natal akad. Sci. Amerika Serikat89, 28–32
37. Wang, PC, Vancura, A., Mitcheson, T., dan Kuret, J. (1992) mol. Biol Sel.3,275–286
38. Murray, MC, dan Perkins, ME (1989) mol. Biokimia. parasit.34, 229–236
39. Lustigman, S., Anders, RF, Brown, GV, Coppel, RL (1990) mol. Biokimia. parasit.38,
261–270
40. Chishti, AH, Maalouf, GJ, Marfatia, S., Palek, J., Wang, W., Fisher, D., dan Liu, S.-C.
(1994)Darah 83, 3339–3345
41. Suetterlin, BW, Kappes, B., dan Franklin, RM (1991) mol. Biokimia. parasit.46,
113-122