LTM 3– Kloning pada Tanaman

Nama : Unik Yulianatina Risqi

NPM : 1306370991

Kelompok : 1

E. coli DH5α sebagai Host Cell kloning dan Agrobacterium tumefaciens sebagai Host Cell
Perantaraan

A. Pemilihan Host cell

E. coli adalah bakteri Gram-negatif berbentuk batang enterik dengan genom melingkar 4,6
Mb. Bakteri ini awalnya dipilih sebagai sistem model karena kemampuannya untuk tumbuh pada
media yang dirancang dan tingkat pertumbuhannya yang cepat. Di media yang kaya, selama fase
eksponensial pertumbuhannya, E. coli membelah setiap 20-30 menit. Kemudahan
transformabilitas dan manipulasi genetikanya memperkuat peran E. coli sebagai host cell pilihan
untuk propagasi, manipulasi, dan karakterisasi DNA rekombinan.
Sifat-sifat umum dari Host cell

1. Kecacatan
Banyak strain laboratorium E. coli membawa mutasi yang mengurangi viabilitasnya
di alam liar dan menghalangi kelangsungan hidup di saluran usus. Ini sering memberi
auxtrophy, yaitu, mereka menonaktifkan kemampuan sel untuk mensintesis metabolit kritis,
yang oleh karenanya harus diberikan dalam media. Mutasi tersebut juga dapat berfungsi
sebagai penanda genetik dan mungkin berguna untuk konfirmasi strain yang benar.
Beberapa vektor mengandung mutasi nonsense pada gen penting untuk mencegah
menyebar ke populasi bakteri alami. Mutasi nonsense adalah kodon rantai-terminasi;
mereka disebut mutasi amber (UAG) atau oker (UAA). Vektor yang mengandung mutasi
ini hanya dapat disebarkan dalam strain E. coli yang mengandung penekan nonsense yang
tepat. Penekan Amber dan oker biasanya ditemukan pada gen tRNA, dan mengubah loop
pengenal kodon sehingga asam amino spesifik kadang-kadang dimasukkan ke lokasi
mutasi nonsense.

2. Status Kesuburan
Beberapa strain E. coli mengandung F episome atau fertility factor, yang dapat
ditemukan dalam beberapa bentuk yang berbeda. Ini dapat dibawa sebagai plasmid
ekstrapromosom melingkar tunggal beruntai tunggal, yang diberi nama F +, atau jika
memiliki gen tambahan, F '. Bentuk ekstrachromosomal ini dapat berpindah ke sel
penerima, yaitu F-, dan kadang-kadang menyebabkan mobilisasi plasmid lain. Pada sel Hfr
(frekuensi kromosom frekuensi tinggi), faktor F diintegrasikan ke dalam kromosom bakteri
 dan dapat menyebabkan transfer kromosom. Mutasi pada lokus tra menghambat transfer
dan mobilisasi. Strain yang mengandung faktor F menghasilkan pili permukaan, yang
diperlukan untuk infeksi oleh vektor berdasarkan fag filamen.

3. Pembatasan dan Modifikasi Sistem

Sistem modifikasi pembatasan berperan dalam mencegah pertukaran genetik antar
kelompok bakteri dengan memungkinkan tuan rumah mengenali dan menghancurkan DNA
asing. Sistem arketipe terdiri dari metilase DNA dan endonuklease restriksi kognitifnya.
Metilase secara kovalen memodifikasi DNA inang, dengan memindahkan gugus metil dari
S-adenosylmethionine ke residu sitosin atau adenin, dalam urutan pengenalan enzim
restriksi kognitifnya. Metilasi mencegah pencernaan di situs ini, membatasi pencernaan
DNA asing yang masuk. Sistem modifikasi pembatasan yang ada di host E. coli akan
mempengaruhi pola dan luas metilasi DNA rekombinan dan secara signifikan dapat
mempengaruhi keberhasilan pencernaan dan transformasi bakteri.
3.1 Dam dan Dcm Metilasi
Derivat E. coli K-12 biasanya mengandung tiga metilase DNA spesifik lokasi: Dam,
Dcm dan EcoK. DNA adenine methylase, dikodekan oleh Dam, methylates adenine
residu dalam urutan GATC. Urutan ini akan terjadi setiap 256 bp dalam sepotong DNA
urutan acak secara teoritis. DNA cytosine methylase, dikodekan oleh dcm, methylates
residu sitosin internal dalam urutan CC (A / T) GG, yang terjadi rata-rata setiap 512 bp.
Metilasi dapat mengganggu pembelahan DNA yang dikloning dan disebarkan pada
strain Dam+ dan dcm + E. coli. Tidak semua restriksi endonuklease sensitif terhadap
metilasi. Adanya metilasi Dam atau Dcm juga dapat mempengaruhi efisiensi transformasi
plasmid. Sebagai contoh, DNA modifikasi-Dam tidak dapat dimasukkan secara efisien ke
dalam Dam, karena inisiasi replikasi dihambat saat DNA di-hemimetilasi.
3.2 Sistem EcoK
Metilase E. coli K-12 EcoK memodifikasi residu adenin yang ditunjukkan dari
urutan target A (mA) CN6GTGC, dan komplemen GC (mA) CN6GTT. Endonuklease
serumpun akan membelah DNA yang tidak dimodifikasi pada urutan ini. Karena situs
EcoK jarang terjadi, kira-kira kira-kira setiap 8 kb, jenis metilasi ini umumnya tidak
mengganggu pencernaan. Namun, transformasi DNA plasmid yang tidak dimodifikasi
menjadi strain hsdR+ menghasilkan pengurangan efisiensi lebih dari 1000 kali lipat dan
dapat menyebabkan kurang representasi fragmen yang mengandung situs EcoK di
perpustakaan. Jadi, jika mentransfer DNA antara strain dengan genotipe EcoK yang
berbeda, plasmid harus dilewatkan melalui strain hsdM sebelum dimasukkan ke strain
hsdR +.

3.3 Retriksi Metilasi

E. coli K-12 juga mengandung beberapa sistem restriksi bergantung metilasi, yaitu
McrA, McrBC, dan Mrr. Metilcytosine yang membatasi endonuklease, McrA dan McrBC,
 memecah metileptida dalam urutan CG dan (A/C) G, masing-masing (18 - 21). Mrr
memotong methyladenine, namun urutan pengenal yang tepat tidak diketahui.

4. Rekombinan
Setelah transformasi vektor plasmid yang sukses menjadi E. coli, sistem rekombinasi
inang dapat mengkatalisis penataan ulang molekul rekombinan. Jika produk yang
dihasilkan lebih kecil dari molekul aslinya, maka akan bereplikasi lebih cepat dan cepat
mendominasi populasi. Mutasi pada inang yang menekan rekombinasi dapat membantu
menjaga integritas DNA kloning. Sifat rekombinasi sangat relevan dengan pilihan host
untuk propagasi perpustakaan agar tidak terjadi keliru karena adanya pertumbuhan klon
tertentu yang tidak merata. Namun, strain defisien rekombinasi pada umumnya tidak layak
dan mengalami sensitivitas yang meningkat terhadap agen yang merusak DNA,
kekurangan dalam memperbaiki jeda untai ganda dalam DNA, tingkat pertumbuhan yang
lambat, dan akumulasi sel-sel yang tidak dapat bertahan secara cepat.
E. coli mengandung tiga jalur rekombinasi utama yang dikodekan oleh recBCD, recE,
dan recF. Ketiga jalur tersebut bergantung pada produk recA, dengan pengecualian
rekombinasi plasmid dan fag tertentu yang dipromosikan oleh jalur RecE. Oleh karena itu,
recA- adalah kondisi dan mutasi yang paling ketat dalam recA yang mengurangi
rekombinasi 10.000 kali lipat dibandingkan tipe liar, yang hampir sepenuhnya menghalangi
rekombinasi.

5. α –Komplementasi
Banyak teknik biologi molekuler saat ini bergantung pada studi perintis operon lac
oleh Jacob dan Monod pada tahun 1960an. lac operon terdiri dari tiga gen: lacZYA,
encoding β-galactosidase, yang membelah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa,
permease, dan transacetylase. Sel yang mengandung 5 'delesi dalam lacZ menghasilkan
fragmen C-terminal yang tidak aktif dari β-galaktosidase yang disebut fragmen ω;
Demikian pula, sel dengan penghilangan 3 'di lacZ (lacZ') mensintesis fragmen N-terminal
α yang tidak aktif. Namun, jika kedua fragmen diproduksi di sel yang sama maka aktivitas
β-galaktosidase dipulihkan. Fenomena ini, yang dikenal sebagai α –Komplementasi yang
merupakan dasar untuk pemilihan visual dari klon yang mengandung vektor rekombinan
dengan "skrining biru putih".

B. Strain DH5α
Struktur genom strain DH5α berupa kromosom melingkar tunggal yang terdiri dari
4.686.137 nukleotida, 4359 gen, dan 4128 gen pengkode protein. Strain ini juga mengandung
plasmid, dan memiliki kemampuan untuk menerima penyisipan plasmid dengan sangat baik.
Plasmid yang diperkenalkan ke DH5α dilakukan dengan metode elektroporasi dan heat shock.
Metode heat shock merupakan metode yang sederhana dengan keefesiensi yang tinggi.
 E. Coli DH5α memiliki fitur-fitur yang menjadikan strain ini sangat berguna untuk
rekombinasi

a) Mutasi endA1 memungkinkan degradasi endonuklease lebih rendah dan menjamin laju
transfer plasmid lebih tinggi.
b) lacZΔM15 untuk skrining biru / putih warna koloni di piring yang berisi X-gal atau Bluo-
gal
c) recA1 mengurangi rekombinasi homolog untuk sisipan yang lebih stabil.

C. Bakteri A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri berbentuk batang gram negatif (Jin, S.) yang
berkaitan erat dengan bakteri pengikat nitrogen yang tinggal di nodul akar pada kacang polong.
Tidak seperti kebanyakan bakteri penghuni tanah lainnya, ia menginfeksi akar tanaman sehingga
menyebabkan Crown Gall Disease (Jin, S.). Di alam liar A. tumefaciens menargetkan tanaman
dikotil, dan menyebabkan kerusakan ekonomi pada tanaman pertanian seperti kenari, tomat dan
mawar.

Modus aksi A. tumefaciens yang unik telah memungkinkan bakteri ini digunakan sebagai
alat pemuliaan tanaman. Setiap gen yang diinginkan, seperti gen toksin insektisida (lihat Bacillus
thuringiensis) atau gen resistensi herbisida, dapat direkayasa ke dalam DNA bakteri dan
dimasukkan ke dalam genom tanaman. Penggunaan Agrobacterium tidak hanya memperpendek
proses pemuliaan tanaman konvensional, namun juga memungkinkan gen baru (non-tanaman)
untuk direkayasa menjadi tanaman. Bakteri mengambil keuntungan dari inangnya dengan
menyuntikkan DNA yang berasal dari plasmid Ti (tumor inducing) ke inangnya, menyebabkan
tanaman tersebut menciptakan galls yang mengeluarkan vaksin yang digunakan bakteri sebagai
sumber energi. Namun, para ilmuwan telah memanfaatkan kemampuan bakteri ini untuk
menempatkan DNA ke dalam inangnya untuk menciptakan tanaman transgenik. A. tumefaciens
telah digunakan sebagai alat molekuler penting untuk memanipulasi tanaman dan menciptakan
tanaman hasil rekayasa genetika untuk penelitian dan pertanian. Karena pentingnya di
laboratorium, genom lengkap A. tumefaciens strain C58 diterbitkan pada tahun 2001 (Goodner, B

A. tumefaciens adalah bakteri yang tidak biasa karena merupakan salah satu dari sedikit
yang memiliki kromosom linier dan melingkar. Genomnya memiliki total 5,7 juta pasangan basa,
dengan 2,8 juta berada pada kromosom melingkar dan 2,1 juta berada pada kromosom liniernya
(Goodner, B). Sebagian besar gen yang penting untuk kelangsungan hidupnya terletak pada
kromosom melingkar, walaupun melalui evolusi beberapa gen penting bermigrasi ke kromosom
linier. Berdasarkan analisis sekuens, ditentukan bahwa kromosom linier berasal dari plasmid yang
kemudian berubah menjadi bakteri lama (Goodner, B).
 Ujung kromosom linier dilindungi oleh telomer yang membentuk jepit rambut kovalen
tertutup, seperti pada bakteri lain yang mengandung kromosom linier (Goodner, B). Selain dua
kromosom, strain C58 juga mengandung dua plasmid, pTiC58 (biasa disebut Ti) dan pAtC58
(disebut juga "plasmid samar"). pTiC58 mengandung gen yang diperlukan untuk patogenisitasnya
melawan tanaman (Goodner, B.), termasuk T-DNA yang disuntikkan ke dalam tanaman dan
menyebabkannya menghasilkan opin, bersama dengan protein aksesori yang membantu T-DNA
masuk dan mengubah sel tanaman ke dalam sel tumor. pAtC58 mengandung gen yang penting
untuk katabolisme opine (Vaudequin-Dransart, V.), atau kemampuannya untuk menggunakan opin
sebagai sumber energi, yang penting untuk gaya hidupnya sebagai patogen.

A. tumefaciens menginfeksi tanaman biasanya melalui luka terbuka untuk mencari senyawa
fenolik yang tumpah dari luka tanaman dan secara chemotactically bergerak ke arah sumbernya.
Begitu memasuki inang tanamannya, ia menyuntikkan bagian DNAnya yang disebut T-DNA yang
berasal dari plasmid Ti (tumor inducing) ke inangnya (Moore, L. W.). T-DNA kemudian
diintegrasikan ke dalam genom tanaman, dan memiliki dua efek pada tanaman inang. T-DNA
pertama-tama mengarahkan sel tumbuhan untuk membuat auksin dan sitokinin, yang
menyebabkan sel menjadi tidak beraturan dan membentuk tumor yang tampak disebut empedu
(Moore, L. W.). T-DNA kemudian mengarahkan sel tanaman untuk mulai membuat opines
(biasanya nopaline atau agropine) yang digunakan A. tumefaciens sebagai sumber energi
(Vaudequin-Dransart, V.). Karena beberapa organisme lain (termasuk sel tumbuhan yang
menginfeksi) dapat menggunakan opines sebagai sumber energi, A. tumefaciens menciptakan
ceruk khusus untuk dirinya sendiri di dalam empedu (Vaudequin-Dransart, V.).
Meskipun jelas bahwa A. tumefaciens mengintegrasikan DNAnya sendiri ke dalam hostnya
dan menginduksi hostnya untuk membuat sel tumor penghasil opine. Bakteri menggunakan sistem
sekresi Tipe IV untuk menyuntikkan protein T-DNA dan virulensi ke dalam inangnya. Telah
ditemukan bahwa seluruh rangkaian protein, selain T-DNA, diperlukan untuk menginduksi
tanaman inang untuk membuat sel tumor. Ketika T-DNA disalin dari plasmid Ti protein yang
disebut kompleks VirD2 dengannya untuk melindunginya dari nukleases sel induk dan membantu
pengangkutannya ke nukleus di mana ia dapat bertindak (Escudero, J.). Agar T-DNA dapat
menyeberang dari bakteri ke dalam sel tanaman, protein yang disebut VirE2 membentuk saluran
antara membran tanaman dan sel bakteri (Duckley, M). Protein lain, VirE3, telah ditemukan untuk
disuntikkan ke dalam sel tanaman. Telah ditunjukkan bahwa VirE3 ditranslokasi ke dalam nukleus
tumbuhan dimana ia berinteraksi dengan faktor transkripsi asli sehingga menyebabkan deregulasi
proliferasi sel tumbuhan dan menyebabkan pertumbuhan galls (Garcia-Rodriguez, F. M.). Faktor
virulensi lainnya tidak diperlukan untuk proses induksi tumor namun memperluas jangkauan host
A. tumefaciens. Proses dimana A. tumefaciens menyebabkan penyakit belum sepenuhnya
dijelaskan, penelitian masa depan masih menjanjikan untuk menjelaskan prosesnya.
A. tumefaciens mengandung flagella, yang penting dalam siklus hidup mereka karena
membantu mereka berenang melewati tanah untuk menemukan host tanaman mereka. Mutasi pada
gen flagela mengurangi virulensi A. tumefaciens di laboratorium. Strain dengan mutan fla protein
tidak bisa menginfeksi tanaman yang tumbuh secara alami di tanah (Chesnokova, O.). Bakteri
berenang menuju konsentrasi senyawa fenolik dan juga metabolit kecil seperti glukosa dan asam
amino yang biasanya dipancarkan dari luka tanaman. VirA adalah reseptor yang merasakan adanya
zat ini dan memandu flagela menuju sumber zat ini. Actived VirA kemudian memfosforilasi VirG,
yang bertanggung jawab untuk mempersiapkan sel untuk menginfeksi jaringan tanaman inang,
termasuk respon chemotactic berenang ke arah gradien fenolat untuk menemukan inangnya .
Seperti banyak bakteri lain A. tumefaciens membuat pili yang oleh para ilmuwan disebut
T-pilus (Bulgakov, V.). Pada bakteri lain, struktur ini digunakan untuk mentransfer materi genetik
antar bakteri selama konjugasi, namun bakteri ini mengadaptasinya untuk mentransfer bahan
genetik ke inangnya.

A. tumefaciens dapat menggunakan berbagai substrat untuk energi dan karbon, namun
secara khusus berkembang untuk menggunakan kelas bahan kimia yang disebut opines, yang
merupakan senyawa mirip asam amino yang merupakan zat antara metabolisme pada sebagian
besar organisme. A. tumefaciens memaksa tanaman menginfeksi untuk menghasilkan opines,
sebuah molekul yang digunakan bakteri sebagai sumber energi dan karbon (Moore, L. W.). Ada
banyak jenis opina yang dapat digunakannya, seperti nopaline, agropine, mannopine (yang umum),
dan chrysopine, deoxy-fructosyl-oxo-proline (yang tidak biasa) (Moore, L. W.). Dipercaya bahwa
setiap strain A. tumefaciens hanya dapat memetabolisme satu jenis opine, dan mengandung gen
untuk sintesisnya (biasanya di T-DNA yang dipindahkan ke inang tanamannya) dan katabolisme,
walaupun ini tidak sepenuhnya benar (Moore , LW)

A. tumefaciens bisa hidup bebas di dalam tanah atau di dalam tanaman sebagai parasit..
Bentuk energi yang diberikan tanaman kepada bakteri adalah opines, yang hanya sedikit bakteri
kecuali A. tumefaciens yang dapat digunakan sebagai satu-satunya sumber energi mereka. Hal ini
menimbulkan "Hipotesis Opine" yang menyatakan bahwa A. tumefaciens adalah penerima manfaat
utama dari hubungan parasit. Namun, situasi alam mungkin lebih kompleks daripada yang
ditunjukkan oleh "Hipotesis Opine", karena berbagai spesies Pseudomonas yang juga memiliki
kemampuan untuk menggunakan opines sebagai sumber energi telah ditemukan di gula penghasil
opine bersamaan dengan A. tumefaciens (Moore , LW), sehingga niche opine yang diciptakan
bakteri juga mendukung pertumbuhan organisme lainnya.

Karena kemampuannya untuk mengintegrasikan DNA ke dalam inangnya, A. tumefaciens

telah digunakan untuk membuat tanaman transgenik sejak tahun 1970an. Meskipun metode lain
seperti biolistik telah berkembang untuk memasukkan gen ke dalam tanaman, A. tumefaciens tetap
populer untuk manipulasi genetik tanaman karena jumlah tiruan gen yang rendah pada tanaman
yang diciptakan dan stabilitas transgen (Li, W.). Caranya adalah bahwa A. tumefaciens akan
menyuntikkan DNA apa pun yang diapit oleh urutan ulang 25 bp yang spesifik (Li, W.). Pada tikus
A. tumefaciens yang normal, DNA ini adalah T-DNA, jadi langkah pertama adalah membuat
plasmid buatan dengan DNA T yang dipotong, lalu masukkan konstruk gen yang diinginkan
dengan pengulangan sisi yang mengapit ke plasmid. Konstruksi gen biasanya berisi penanda
pilihan (Li, W.) (biasanya resistensi kanamisin) bersama dengan gen yang diinginkan untuk
diekspresikan di pabrik. Plasmid buatan ini kemudian diubah menjadi A. tumefaciens, mungkin
yang tidak memiliki plasmid Ti normal. Jaringan tanaman kemudian terinfeksi dengan A.
tumefaciens yang direkayasa ini, ditempatkan pada media seleksi (seperti yang mengandung
kanamisin), dan menggunakan metode kultur jaringan tanaman, media seleksi akan membunuh
sel-sel yang belum berubah, dan tunas yang Telah berhasil tumbuh akan mengandung gen yang
diinginkan yang disisipkan.

Metode modern untuk menciptakan tanaman transgenik menggunakan A. tumefaciens

biasanya merupakan variasi dari metode yang dijelaskan di atas. Untuk menyederhanakan proses
konstruksi plasmid, vektor biner kadang kala digunakan (Li, W.). Vektor biner hanyalah strain A.
tumefaciens dengan plasmid Ti yang berisi semua gen yang diperlukan untuk menyuntikkan DNA
ke dalam tanaman tetapi tidak mengandung T-DNA dengan pengulangan berulang (Li, W.).
Plasmid lain yang mengandung gen yang akan dimasukkan ke dalam tanaman kemudian
dimasukkan ke dalam. Karena T-DNA tidak harus berada di plasmid Ti agar bisa diintegrasikan
ke dalam genom inang, maka dapat diletakkan pada plasmid terpisah asalkan mengulangi
pengulangan 25-bp mengapit. Keterbatasan sebelumnya menggunakan A. tumefaciens untuk
menciptakan tanaman transgenik adalah bahwa A. tumefaciens hanya menginfeksi dicots dan
gymnosperma di alam (Li, W.). Namun, metode tambahan telah ditemukan yang memperluas
jangkauan host A. tumefaciens ke monokotil, jadi metode ini sekarang berguna untuk menciptakan
tanaman transgenik untuk semua tanaman berbunga.

Referensi
Casali, N., 2003. Escherichia coli Host Strains. In: A. Preston & N. Casali, eds. E. Coli Plasmid Vectors :
Methods and Applications. USA: Humana Press, pp. 27-48.

Wu, Alan dan Rachel Larsen. 2011. Agrobacterium tumefaciens. https://microbewiki. kenyon.edu/
index.php/Agrobacterium_tumefaciens. [diakses pada 26 November 2017 pukul 15.00]
Zupan, John R. and Patricia Zambryski. 1995. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the Plant Cell.
Plant Physiol 107: 1041-1 047