DNA REKOMBINAN

Transformasi

Page 1

Tahapan DNA Rekombinan

1. Isolasi DNA
2. Pemotongan & penggabungan molekul DNA
3. Kloning DNA
a. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
b. Vektor kloning
4. Transformasi
5. Reisolasi molekul DNA rekombinan
6. Analisis DNA rekombinan
Page 2

ISTILAH TRANSFORMASI
Dalam biologi molekuler, transformasi perubahan
genetik dari sel yang dihasilkan karena
penggabungan, penyerapan langsung dan ekspresi
materi genetik eksogen (DNA eksogen) dari
lingkungannya dan diambil melalui membran sel
Transformasi terjadi secara alami pada beberapa
spesies bakteri. Terjadi: bakteri harus dalam
keadaan kompeten (sebagai respon waktu terbatas
dengan kondisi lingkungan seperti kelaparan dan
densitas sel).

Page 3

ISTILAH TRANSFORMASI
3 proses masuknya materi genetik ke dalam sel
bakteri:
1. Transformasi
2. Konjugasi (transfer materi genetik antara
dua sel bakteri secara kontak langsung) dan
3. Transduksi (injeksi DNA asing oleh virus
bakteriofag ke inang bakteri).
"Transformasi juga menggambarkan penyisipan
materi genetik baru ke dalam sel non bakteri: sel
hewan dan tumbuhan, namun, karena
"transformasi" memiliki arti khusus maka
perpindahan DNA asing ke dalam sel eukariotik
disebut "transfeksi
Page 4

ISTILAH TRANSFORMASI
TRANSFORMASI

TRANDUKSI

KONJUGASI
Transfer kromosom

KONJUGASI
Transfer plasmid

MEKANISME TRANSFORMASI
1. Bacteria
a. Natural competence transfer gen horizontal
Beberapa spesies setelah kematian, sel melepas DNA
yang akan diambil oleh sel lain yang kompeten
Pengangkutan DNA eksogen kedalam sel perlu protein
yang terlibat dalam perakitan pili, serta kompleks DNA
translokasi pada membran sitoplasma.
DNA mengikat permukaan sel kompeten pada reseptor,
dan melewati membran sitoplasma dengan DNA
translokasi. Hanya ssDNA dapat melewati, karenanya
satu untai terdegradasi oleh nuclease selama proses
ssDNA translokasi diintegrasikan dlm kromosom bakteri.
sel Gram-negatif, karena ada membran ekstra, DNA perlu
saluran yang dibentuk oleh sekretin pada membran luar.
b. Artificial competence
Page 6

MEKANISME TRANSFORMASI
1. Bacteria
Natural competence
Artificial competence
Kompetensi buatan : sel pasif permeabel terhadap DNA
diekspos pada kondisi yang tidak biasanya terjadi di alam
Sel diinkubasi dalam larutan kation divalen (CaCl2) dalam
kondisi dingin, kemudian heat shock.
Dengan ekspos kation divalen, sel dalam kondisi dingin
dapat mengubah atau melemahkan struktur permukaan
sel sehingga lebih permeabel terhadap DNA.
Panas untuk menciptakan ketidakseimbangan termal
pada kedua sisi membran sel, DNA memaksa masuk ke
dlm sel melalui pori-pori sel atau dinding sel yang rusak.

Page 7

MEKANISME TRANSFORMASI
2. Elektroporasi
sel diberi kejutan singkat dengan medan listrik 10-20 kV /cm,
membentuk lubang pada membran sel sehingga DNA plasmid dapat
masuk. Setelah sengatan listrik, lubang dengan cepat ditutup oleh
mekanisme perbaikan-membran sel.
3. Yeast
Sebagian besar yeast, Saccharomyces cerevisiae, dapat diubah oleh
DNA eksogen di lingkungan atau di bawah kondisi laboratorium.
Ekspos kation alkali seperti cesium atau lithium memungkinkan sel
mengambil DNA plasmid . Protokol mengadaptasi metode
transformasi, menggunakan asetat lithium, glikol polietilen, dan DNA
beruntai tunggal. DNA beruntai tunggal mengikat dinding sel,
mencegah DNA plasmid melakukannya dan meninggalkannya untuk
transformasi. Digesti enzimatik, elektroporasi, atau agitasi dengan
manik-manik kaca juga dapat digunakan untuk mengubah sel yeast.

Page 8

MEKANISME TRANSFORMASI
4. Plants
a. Agrobacterium mediated transformation : mudah dan
lebih sederhana. jaringan tanaman (daun) dipotong
kecil-kecil, 10x10mm, direndam selama 10 menit dalam
cairan mengandung Agrobacterium. Sel tanaman di
sepanjang potongan akan diubah oleh bakteri, yang
menyisipkan DNA-nya ke dalam sel. Tempatkan pada
media perakaran, tanaman akan tumbuh kembali.
b. Particle bombardment: Penembakan partikel: Partikel
emas atau tungsten yang dilapisi DNA ditembakkan ke
dalam sel tanaman muda atau embrio tanaman.
Beberapa materi genetik akan tinggal di sel. Metode ini
juga memungkinkan transformasi plastida tanaman.
Efisiensi transformasi lebih rendah dibandingkan
dimediasi Agrobacterium, namun kebanyakan tanaman
bisa diubah dengan metode ini.
c. Elektroporasi
Page 9

MEKANISME TRANSFORMASI
4. Plants
a. Agrobacterium mediated transformation
b. Particle bombardment
c. Elektroporasi
d. Viral transformasi (transduksi): virus
modifikasi menginfeksi tanaman. Untuk
genom, metode seperti ini adalah bentuk
transfeksi dan bukan suatu perubahan yang
nyata, karena gen yang disisipkan tidak
pernah mencapai inti sel dan tidak
berintegrasi dalam genom inang.
5. Animals : transfection
Page 10

MEKANISME TRANSFORMASI SEL

o Bakteri secara alami mampu mengambil DNA baru.
o Jika memiliki dinding sel, seperti tanaman, ganggang atau jamur:
o enzim memecah dindingmemproduksi protoplas (sel tanpa
dinding sel).
o Muatan listrik membuka pori-pori membran selDNA masuk
(elektroporasi)
o Sel tanaman dapat ditransformasikan juga dengan biolistik.
o Small gold atau partikel tungsten : DNA ditembak ke dalam
sel dengan kecepatan tinggi. Dinding sel tidak harus
dihilangkan
o Sel hewan dapat ditransformasikan dengan elektroporasi,
presipitasi DNA dengan larutan kalsium fosfat, dan Virus
o Mikroinjeksi DNA dalam inti sel telur hewan diperlukan untuk
memasukkan DNA kedalam tubuh hewan. DNA berintegrasi
dalam kromosom hewantelur ditanamkan hewan lahir dengan
sifat yang diinginkan.
Page 11

CHEMICAL TRANSFORMATION
WITH CALCIUM CHLORIDE

Page 12

TRANSFORMATION BY
ELECTROPORATION

Page 13

ASPEK PRAKTIS TRANSFORMASI DALAM

BIOLOGI MOLEKULER
Penemuan kompetensi buatan pada bakteri memungkinkan
bakteri seperti Escherichia coli (plasmid) digunakan sebagai
sel inang untuk manipulasi DNA serta ekspresi protein. Agar
stabil dipertahankan dalam sel, molekul DNA plasmid harus
memiliki ori, yang memungkinkan untuk direplikasi independen
dalam sel
Efisiensi Transformasi : Efisiensi kultur kompeten dapat
mengambil DNA eksogen dan mengekspresikan gen yang
dikenal dan diukur dalam satuan koloni (cfu) per g DNA.
Dalam transformasi CaCl2, sel dingin bertemu Ca2+ (dalam
larutan CaCl2) membuat sel menjadi permeabel terhadap
DNA plasmid. Sel diinkubasi dlm es dengan DNA, dan
kemudian heat shock (42C selama 30-120 detik). Metode ini
sangat baik untuk DNA plasmid sirkuler.

Page 14

ASPEK PRAKTIS TRANSFORMASI DALAM BIOLOGI MOLEKULER

transformation Proses pemindahan DNA

eksogen kedalam sel
Ada 2 metode umum untuk transformasi kedalam
bakteri:
1. Kimia menggunakan CaCl2 dan heat shock
untuk mendukung DNA masuk kedalam sel
2. Elektroporasi : arus pendek listrik

Page 15

PENGUKURAN EFISIENSI TRANSFORMASI

Ditentukan pada kondisi kelebihan sel

Plasmid standar untuk menentukan efisiensi dalam E. coli yaitu
pBR322 atau pUC.
Jumlah sel viabel dalam reaksi transformasi 2x108 - 1011.
10-100 pg DNA dapat digunakan untuk transformasi. Kelebihan
DNA diperlukan untuk low-efficiency transformation.
Setelah transformasi, tanam secara terpisah 1% dan 10% sel
(sel diencerkan untuk memudahkan), pengenceran lanjutan
mungkin perlu untuk high efficiency transformation.
Efisiensi transformasi diukur pada transforman atau colony
forming unit (cfu) per g DNA yang digunakan.
Efisiensi transformasi 1x108 cfu/g untuk pUC19 = 1 dalam
2000 molekul plasmid yang digunakan.
pada E. coli, batasan teori efisiensi transformasi >1x1011 cfu/g
Menghasilkan sekitar 2-4x1010 cfu/g pUC19
Page 16

Faktor yang mempengaruhi efisiensi transformasi

1. Konsentrasi, Bentuk, Kemurnian, Kontaminan dalam
miniprep, Jumlah DNA, dan Campuran Ligasi
2. Heat Shock, Efisiensi optimal (42C for 45 sec dengan
PCR tube ) atau (37C for 60 sec dengan microcentrifuge
tube).
3. Length of Time After Transformation
a. down ten-fold if the cells are plated without any
expression time at all
b. down seven-fold if plated after 15 minutes
c. down three-fold if plated after 30 minutes.
4. Medium Medium SOC menghasilkan two-fold lebih baik
daripada Medium LB untuk sel kompeten
5. Selective Plates
6. Freeze/Thawing of Cells

Page 17

Seleksi dan Skrining Transformasi Plasmid

1. Plasmid dengan selectable marker sel tanpa plasmid
dapat dibunuh atau dihambat. Resistensi antibiotik adalah
penanda untuk prokariot. Penggunaan penanda auksotrofik
dapat mengimbangi ketidakmampuan untuk metabolisme
asam amino tertentu, nukleotida, atau gula.
2. Reporter gen sebagai penanda
a. gen lacZ : mengkode -galaktosidase, skrining biruputih. Menggunakan prinsip -komplementasi
b. Green fluorescent protein (GFP), memproduksi sel-sel
hijau berpendar di bawah sinar biru, dan luciferase
enzim, yang mengkatalisis reaksi dengan luciferin untuk
memancarkan cahaya.
3. Hibridisasi asam nukleat dengan radioaktif RNA probe,
sedangkan sel yang mengekspresikan protein yang
diinginkan dapat dideteksi dengan metode imunologi.
Page 18

Penjelasan : CARA SELEKSI SEL TRANSFORMAN

1. inaktivasi salah satu dari dua gen antibiotik pada plasmid
seperti pada Pbr322
2. -komplementasi seperti pada pUC18/pUC19
sebagian gen lacZ (-galaktosidase) yang mengkode146
asam amino dari N-terminal ada dalam plasmid dan
mengandung multiple cloning site. Kromosom dari inang
yang tepat mengandung ujung karboksi dari lacZ.
Kegagalan penyisipan dalam plasmid menghasilkan complementasi dan produksi -galaktosidase fungsional
yang memecah analog laktosa kromogenik (X-gal) dan
menghasilkan koloni biru.
Keberadaan penyisipan fragmen DNA asing dalam multiple
cloning site dari lacZ dalam plasmid mengganggu lac
operon dan -galaktosidase menjadi tidak fungsional
sehingga koloni gagal berubah biru dan koloni tampak
berwarna putih

Page 19

SELEKSI SEL TRANSFORMAN

Hanya sel E. coli dengan plasmid resisten yang
dapat tumbuh pada antibiotic medium
Hanya plasmid dengan gen lacZ fungsional
yang dapat tumbuh pada Xgal medium

Page 20

HASIL TRANSFORMASI SEL-ANTIBIOTIK

Page 21

HASIL TRANSFORMASI SEL-ANTIBIOTIK

HASIL TRANSFORMASI SEL~X-Gal

HASIL TRANSFORMASI SEL~X-Gal

Inaktivasi gen galactosidase.

substrat "X-gal"
berubah biru jika
gen tetap, yaitu
membuat enzim
aktif.
koloni putih pada Xgal diduga ada DNA
rekombinan dalam
plasmid

HASIL TRANSFORMASI SEL

Blue colonies : bakteri resisten
Ampicillin yang mengandung
pVector dan mengekspresikan
fragmen alfa () fungsional dari
urutan sekuen yang mengkode alfa
LacZ (nothing inserted, no clone )
lacZ(+)
White colonies : bakteri resisten
Ampicillin yang mengandung
pInsert dan tidak menghasilkan
fragmen alfa LacZ (successful
insertion & recombination) lacZ(-)
Page 25

IDENTIFIKASI POSITIF KLONING

DNA plasmid diekstraksi dianalisis dengan
digesti restriksi
Fragmen DNA dengan ukuran berbeda
dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa dan
ukuran ditentukan dengan membandingkan berat
molekul DNA marker (standar)

Page 26

AGAROSE GEL
ELECTROPHORESIS

IDENTIFIKASI POSITIF KLONING

Page 28

1. Apa makna transformasi?

2. Bagaimana prinsip kerja transformasi
dengan CaCl2 dan elektroporasi?
(jelaskan secara singkat salah satu yang
Saudara ketahui)
3. Mengapa sel bakteri yang mengandung
transforman membentuk koloni berwarna
putih?

Page 30

SEJARAH TRANSFORMASI

1st Th 1928 British bakteriologi Frederick Griffith. strain tidak berbahaya Streptococcus pneumoniae bisa
dibuat virulen setelah terkena panas-pembunuh strain virulen.
Th 1944 "prinsip transformasi diidentifikasi sebagai genetik oleh Oswald Avery, Colin MacLeod, dan
Maclyn McCarty. isolasi DNA dari strain virulen S. pneumoniae dan hanya menggunakan DNA ini
mampu membuat strain virulen berbahaya. penyerapan dan penggabungan DNA oleh bakteri
"transformasi"
metode lain transfer genetik (konjugasi tahun 1947 dan transduksi pada tahun 1953) oleh Joshua
Lederberg sehingga percobaan Avery diterima
Tahun 1970, Morton Mandel dan Akiko Higa menunjukkan E. coli dapat dirangsang untuk mengambil
DNA dari bakteriofag tanpa menggunakan fag pembantu setelah pengobatan dengan larutan kalsium
klorida.
Tahun 1972, Stanley Cohen, Annie Chang dan Leslie Hsu menunjukkan CaCl2 efektif untuk transformasi
DNA plasmid .
Metode transformasi oleh Mandel dan Higa kemudian diperbaiki oleh Douglas Hanahan.
Penemuan kompetensi artifisial diinduksi di E. coli : sebuah prosedur efisien dan nyaman untuk
mengubah bakteri yang memungkinkan untuk kloning sederhana , dan sekarang prosedur
rutindigunakanl di aboratorium .
Transformasi menggunakan elektroporasi pada akhir 1980-an,
Pada tahun 1907 bakteri yang menyebabkan tumor tanaman, Agrobacterium tumefaciens, ditemukan
dan awal tahun 1970 agen merangsang tumor ditemukan menjadi DNA plasmid disebut Ti plasmid .
Dengan menghapus gen dalam plasmid yang menyebabkan tumor dan menambahkan dalam gen baru
peneliti mampu menginfeksi tanaman dengan A. tumefaciens dan membiarkan bakteri memasukkan
DNA ke dalam genom tanaman. Karena tidak semua sel tanaman rentan terhadap infeksi A.
tumefaciens sehingga metode lain dikembangkan termasuk elektroporasi
mikro-injeksi pemboman Partikel ini dimungkinkan dengan penemuan Delivery System Partikel Biolistic
(pistol gen) oleh John Sanford pada tahun 1990.

Page 31