METODE KIMIA-HEAT SHOCK

Prinsip
Metode ini merupakan metode paling sederhana di mana bakteri E.coli yang akan
ditransformasi diinkubasi pada larutan yang mengandung kation divalen (umumnya magnesium klorida,
kemudian kalsium klorida pada kondisi dingin, yang kemudian dipaparkan pada pulsa heat shock).
Dengan adanya perbedaan tekanan di antara bagian luar dan bagian dalam sel bakteri, akan terjadi
induksi untuk membuat celah sehingga DNA plasmid superkoil dapat masuk ke bagian dalam sel.
Bakteri E.coli memiliki permukaan yang bermuatan negatif akibat adanya fosfolipid dan lipopolisakarida,
sehingga digunakan kation divalen yang berfungsi untuk melindungi muatan negatif DNA agar dapat
melekat pada permukaan E.coli. Pemaparan E.coli pada larutan kation divalen yang bertemperatur
dingin akan melemahkan struktur permukaan E.coli dan mempengaruhi porositas membran sel sehingga
pada saat terjadi lonjakan temperatur, membran selnya menjadi tidak selektif terhadap molekul asing
(permeabel terhadap DNA plasmid), sehingga produk ligase (plasmid rekombinan) dapat masuk ke
dalam bakteri E.coli. Selanjutnya, pemaparan heat shock akan membentuk ketidakseimbangan termal
pada kedua sisi membran sel, sehingga DNA plasmid dapat masuk melalui pori-pori sel atau dinding sel
yang dirusak tersebut.

Lonjakan temperatur yang tiba-tiba (kejutan panas) menyebabkan dinding dan membran sel
bakteri E.coli mengalami
perubahan, sehingga ia
cenderung akan menerima
plasmid rekombinan yang
asing baginya (DNA dapat
lewat dengan mudah). Bakteri
yang mudah dilewati DNA
disebut bakteri kompeten.
E.coli akan bersifat kompeten
jika ia sedang tumbuh dengan
sangat cepat (berada pada
fase log, dibanding pada fase-
fase lainnya). Maka dari itu,
tahap transformasi genetik
sebaiknya dilakukan saat E.coli berada dalam fase log.

Prosedur Pengerjaan
Gambar X. Tahapan metode heat shock secara umum
Jika dilihat pada tingkatan Sumber: Pearson Education, 2016
seluler, maka yang terjadi adalah:
1. Bakteri E.coli yang tidak mengandung plasmid rekombinan (tidak resisten terhadap ampicillin dan
tidak dapat menghasilkan enzim -glukosidase) ditumbuhkan hingga mencapai fase log, lalu
diintroduksi pada lingkungan larutan CaCl2 dingin dengan temperatur 00C.
2. Plasmid rekombinan yang resisten terhadap ampicillin dan dapat menghasilkan enzim -
glukosidase ditambahkan pada bakteri E.coli yang belum mengandung plasmid rekombinan, yang
masih diinkubasi dalam es selama 20-30 menit. Plasmid rekombinan sebaiknya tidak ditambahkan
terlalu banyak karena larutan sel bakteri yang jenuh oleh plasmid rekombinan akan menurunkan
efisiensi transformasi.
3. Sel bakteri diberi kejutan panas secara tiba-tiba dengan menaikkan temperatur sampai 420C
selama 50 detik. Kejutan panas sebaiknya tidak diberikan terlalu lama karena akan mengurangi
jumlah transforman. Bakteri E.coli kompeten kemudian dapat dimasuki oleh plasmid rekombinan
dengan mudah.
4. Transforman diinkubasi dalam agar pada temperatur 370C selama 60-90 menit untuk membiarkan
plasmid terintegrasi dalam E.coli dengan sempurna, juga agar sifat fenotipe dapat diekspresikan.
5. Bakteri E.coli yang telah diberi perlakuan agar bisa bertransformasi genetik lalu ditumbuhkan pada
medium yang mengandung ampicillin, dan diinkubasi selama 24 jam.

METODE ELEKTROPORASI
Prinsip

Gambar X. Prinsip transformasi plasmid rekombinan pada bakteri E.coli menggunakan metode
elektroporasi
Sumber: www.btxonline.com

Metode elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik untuk membentuk
lubang-lubang pada membran sel, sehingga DNA plasmid dapat memasukinya. Kejutan listrik akan
membuat sel bakteri dapat menyerap DNA eksogenus dari larutan suspensi. Sebagian sel akan
bertransformasi dengan stabil, sehingga dapat diseleksi selanjutnya. Dua mekanisme yang konsisten
dalam elektroporasi adalah: pembukaan kompartemen baru (interior dari sel) agar DNA dapat berdifusi
secara pasif ke dalam sel bakteri, dan aliran ruah dari medium yang mengandung DNA plasmid, menuju
ke sel bakteri. Difusi molekul DNA memang akan sedikit lambat, tetapi jarak antara sel dan DNA sangat
kecil sehingga mekanisme ini memungkinkan DNA plasmid untuk masuk dalam sel bakteri. Sel bakteri
juga dapat menerima 10% dari volume aliran ruah yang dipengaruhi oleh kekuatan osmotik mediumnya.
 Gambar X. Sirkuit listrik dan konfigurasi elektroda yang digunakan dalam elektroporasi E.coli
Sumber: Dower, et al. 1988

E.coli yang merupakan bakteri Gram negatif dapat ditransformasi dengan sangat efisien
menggunakan elektroporasi, efisiensi transformasinya bahkan mencapai 109-1010 transforman/g
plasmid pRADZ1. Elektroporasi dilakukan dengan mengintroduksikan suspensi sel terkonsentrasi dan
plasmid DNA rekombinan pada medan listrik dengan amplitudo yang sangat tinggi. Proses elektroporasi
sangat bergantung pada dua karakteristik pulsa listrik: kekuatan medan listrik dan panjang pulsa
(konstanta waktu-hambatan-kapasitas). Sedangkan, efisiensi elektroporasi bergantung pada banyak
faktor, seperti temperatur, parameter medan listrik (voltase, resistansi dan kapasitansi), bentuk topologis
DNA, dan faktor sel inang (latar belakang genetik, kondisi tumbuh, dan kondisi setelah kejutan listrik).
Frekuensi transformasi menunjukkan fungsi yang linear dengan konsentrasi DNA dalam enam tingkat
orde. Sedangkan, efisiensi transformasi merupakan fungsi dari konsentrasi sel bakteri. Sebagian besar
sel bakteri yang tetap hidup merupakan bakteri yang kompeten, dan 80% di antaranya bertransformasi
pada konsentrasi DNA yang tinggi.

Dari penelitian Dower et al., didapatkan hubungan sebagai berikut:

1. Besar pulsa terhadap panjang pulsa
Melemahkan medan listrik akan meningkatkan panjang pulsa yang dibutuhkan untuk
melakukan transformasi genetik pada sel bakteri secara maksimal, sedangkan mengurangi panjang
pulsa akan meningkatkan amplitudo yang dibutuhkan medan untuk melakukan transformasi genetik
secara maksimal. Kombinasi yang optimal antara kekuatan medan dan panjang pulsa menghasilkan
efisiensi transformasi sebanyak 2-3 x 109/g dan kematian sel sebanyak 50-76%.
6. Frekuensi transformasi terhadap konsentrasi DNA
Frekuensi transformasi merupakan proporsi sel yang ditransformasi. Konsentrasi DNA
plasmid menentukan probabilitas sel yang akan ditransformasi. Frekuensi transformasi bergantung
pada volume (konsentrasi DNA) dan transforman yang diperoleh merupakan produk hasil kali dari
frekuensi dan jumlah sel bakteri yang ada.
7. Pengaruh pra- dan pasca-inkubasi sel bakteri dan DNA
 Menambah waktu inkubasi DNA dengan sel bakteri sebelum diberi perlakuan elektroporasi
akan meningkatkan kemungkinan transformasi. Meskipun begitu, waktu inkubasi yang berlebihan
dapat menyebabkan terpotongnya plasmid rekombinan yang diintroduksikan karena sel bakteri
menghasilkan nuklease dalam suspensi sel.

Dari penelitian Sheng, et al., diketahui bahwa elektroporasi merupakan langkah transformasi
genetik yang tepat apabila DNA plasmid yang diintroduksikan pada E.coli berukuran besar. Elektroporasi
memperbesar kemungkinan transforman dapat mengambil DNA plasmid berukuran besar dengan
gradien voltase dan konstanta waktu yang berbeda-beda. Efisiensi transformasi DNA plasmid berukuran
besar juga tetap tinggi dengan menggunakan metode elektroporasi.

Prosedur Pengerjaan
Setelah melewati tahap preparasi, langkah selanjutnya untuk melakukan elektroporasi adalah:
1. Penempatan sel pada temperatur ruang dan pada es. Kemudian, sel ditempatkan pada tabung
polipropilen dingin. Suspensi sel dan DNA ditambahkan ke dalam buffer berkekuatan ionik rendah
seperti TE.
8. Pengaturan generator pulsa: kapasitor 25 F, 2.5 kV, dan 200 ohm secara paralel dalam ruang
sampel.
9. Pemindahan campuran sel dan DNA ke kuvet dingin elektroporasi berukuran 0.2 cm, dan
pengocokan suspensi ke dasar kuvet.
10. Pemberian pulsa listrik sebesar 12.5 kV/cm dengan konstanta waktu 4.5-5 msec.
11. Penambahan medium SOC pada temperatur ruang ke kuvet dan resuspensi sel dengan pipet
Pasteur dengan segera.
12. Pemindahan suspensi sel pada tabung polipropilen dan inkubasi pada temperatur 370C selama 1
jam, kemudian dilakukan pengocokan tabung pada kecepatan 225 rpm untuk meningkatkan
perolehan transforman.
13. Penempatan transforman pada medium selektif yang berisi antibiotik.

Dower, W.J., Miller, J.F., dan Ragsdale, C.W. (1988). High Efficiency Transformation of E.coli by High
Voltage Electroporation. Nucleic Acid Research: 16 (13), 6127-6145.
Primrose, S.B., et al. (2001). Principles of Gene Manipulation, 6th Edition. Italy: Blackwell Science.
Sambrook, J., et al. (1989). Molecular Cloning. United States of America: Cold Spring Harbor Laboratory.
Sheng, Y., V. Mancino, dan B. Birren. (1995). Transformation of Escherichia coli with Large DNA
Molecules by Electroporation. Nucleic Acid Research: 23 (11), pp. 1990-1996.