PLASMID : pBR322 dll

Disusun oleh
Kelompok 5 :
1. Duwi Wulandari 1713023034
2. Irma Helza Desvia 1713023004
3. Pratiwi Indah Sari 1753023046
4. Ummi Nur Aini 1653023002

Kelas :B
Program Studi : Pendidikan Kimia
Mata Kuliah : Bioteknologi
Dosen Pengampu : Emmawaty Sofya S.Si.,M.Si.

PENDIDIKAN KIMIA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDARLAMPUNG
2020
 PEMBAHASAN

1. pBR322

Gambar 1. Plasmid pBR322

Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen
adalah plasmid pBR322. Plasmid pBR322 ini mengandung gen penyandi resistensi terhadap
ampisilin dan tetrasiklin. berbagai sisi yang dapat dipotong oleh enzim restriksi. Adanya gen
resistensi terhadap antibiotik yang didalamnya mengandung situs enzim restriksi akan
memberikan kemudahan dalam menyeleksi plamid rekombinan atau memudahkan dalam
menyeleksi klon bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih
memudahkan lagi dengan adanya enzim yang hanya memotong pada bagian gen resistensi
terhadap antibiotik. Misalnya, enzim Pst I yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian
gen resistensi terhadap ampisilin (gen Ap R). Demikian pula dengan enzim Bam HI yang
akan memotong plasmid pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap tetrasiklin (gen Tet R).

Beberapa tahap untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA Dari beberapa perangkat diatas
(enzim restriksi, enzim DNA ligase, dan plasmid), telah memungkinkan bagi kita untuk

2
mengklonkan gen atau fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid
rekombinan (plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi. Bila
dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA, yaitu transformasi, kita
dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel bakteri. Tahapan utama untuk
mengklonkan gen atau fragmen DNA adalah sebagai berikut: Pemotongan plasmid.
Menyisipkan gen atau fragmen DNA. Memasukkan DNA kedalam sel bakteri (trasformasi).
Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan
1. Pemotongan plasmid.
Plasmid pBR322 dipotong di dalam tabung reaksi menggunakan enzim Pst I maka
pBR322 akan terpotong pada bagian gen Ap R.
2. Menyisipkan gen atau fragmen DNA
Bila pBR322 yang sudah terbuka lingkarannya dicampur dengan potongan DNA asing
dan kemudian ditambahkan enzim DNA ligase, maka kemungkinan hasilnya adalah
berupa campuran yang berisi:
 plasmid pBR322 yang tersambung kembali atau membentuk lingkaran lagi
seperti semula, dan
 plasmid rekombinan yaitu pBR322 yang telah disisipi oleh DNA asing.
3. Memasukkan DNA kedalan sel bakteri (Trasformasi).
Campuran kedua bentuk plasmid ini kemudian dicampurkan dengan kumpulan sel
bakteri hidup yang tidak mempunyai plasmid. Kemungkinan hasilnya berupa campuran
yang berisi:
 sel bakteri yang mengandung plasmid pBR322 tanpa sisipan.
 sel yang mendapatkan plasmid rekombinan (pBR322 yang telah disisipi DNA asing).
 sel bakteri yang tidak mengandung (tidak dimasuki) plasmid. Contoh plasmid
lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen adalah
plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322.
Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen lac Z yang menyandikan enzim ß -
galactosidase. Enzim ß -galactosidase akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-
bromo-4-chloroindigo (biru). Oleh karena itu koloni bakteri yang mengandung
plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru bila ditumbuhkan pada media
yang mengandung Xgal. Pada lac Z terdapat daerah yang disebut daerah polikloning.

3
 Pada daerah polikloning ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim
restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk
memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lac Z. Dengan demikian kita dapat
menyisipkan DNA asing pada bagian lac Z. Bila gen lac Z disisipi oleh DNA asing
maka gen lac Z tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan ß -galactosidase). Bila
kita menggunakan pUC118 atau pUC119 sebagai plasmid vektor, maka koloni yang
membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan media tumbuh
yang mengandung Xgal (5-bromo- 4-chloro-indolyl-b-D-galactoside). Koloni bakteri
yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru karena ada gen
lac Z yang menghasilkan ß - galactosidase. Enzim ß -galactosidase memecah Xgal
menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri
akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada
bagian lac Z. Dalam hal ini gen lac Z tidak berfungsi karena disisipi DNA asing.
Jadi, koloni yang mengandung plasmid rekombinan adalah koloni yang berwarna
putih.

2. pUC18

4
 pUC18 adalah vektor kloning plasmid yang biasa digunakan dengan E. coli. Panjang vektor
adalah 2686 bp dan diisolasi dari E. coli strain DH5α dengan prosedur standar. pUC18
dibuat dengan menggunakan gen resistensi ampisilin dan asal replikasi pMB1 dari pBR322.
pUC18 adalah derivat pBR322 dengan jumlah salinan tinggi (high copy number, yaitu >500
salinan per sel bakteri.PMB1 dari pUC18 berbeda dari pBR322 pada mutasi satu titik dan
kurangnya gen rop, yang mengarah ke jumlah salinan yang tinggi. pUC18 memiliki
beberapa situs kloning dalam lacZ alpha-fragment. Sisipan yang diklon ke dalam situs ini
mengganggu aktivitas beta-galaktosidase dan menimbulkan koloni putih pada pelat X-Gal /
IPTG. DNA asing yang dimasukkan dalam bingkai dengan gen lacZ akan diekspresikan
sebagai protein fusi (mengandung sebagian beta-galactosidase) di bawah kendali promotor
lac. Promotor diinduksi dengan IPTG dan diikuti oleh kodon inisiasi serta situs pengikatan
ribosom. pUC18 mirip dengan pUC19, tetapi wilayah MCS nya terbalik.

3. pUC19

pUC19 adalah salah satu molekul vektor yang paling banyak digunakan
sebagai rekombinan , atau sel-sel di mana DNA asing telah diperkenalkan, dapat dengan
mudah dibedakan dari non-rekombinan berdasarkan perbedaan warna koloni pada media

5
 pertumbuhan. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan
mempunyai peta retriksi. Plasmid Puc19 mempunyai berbagai sisi pemotongan untuk enzim
BamHI. Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten terhadap
ampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke plasma sel
bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam, sehingga
menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19 menjadi resisten terhadap ampisilin.
Karena penggunaannya yang luas sebagai vektor kloning dalam penelitian dan industri,
pUC19 sering digunakan dalam penelitian sebagai model plasmid. Sebagai contoh, studi
biofisik pada keadaan superkoil alami telah menentukan jari - jarinya berkisar 65,6 nm
dan jari - jarinya Stokes menjadi 43,6 nm.

4. Plasmid Ti

Plasmid Ti adalah vector alamiah yang digunakan untuk mentransfer DNA ke dalam sel
tanaman. Bakteri yang membawa plasmid Ti ( contohnya agrobacterium tumefaciens) dapat
menyebabakan tumor pada tanaman yang disebut crown gall, terutama tannaman dikotiil.
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah yang secara genetik dapat mentransfer
gen ke tanaman. Bakteri ini secara alami mampu menginfeksi tanaman dan menyebabkan
timbulnya tumor akibat dari transfer fragmen DNA (T-DNA) dari plasmid Ti (tumor-

6
inducing) bakteri ke sel tanaman. Sifat unik ini memungkinkan plasmid Ti menjadi alat
pemindah gen-gen antar spesies yang berbeda, yaitu dengan menyisipkan gen asing pada T-
DNA.

Plasmid Ti ditemukan pada semua strain A. tumefaciens virulen, berukuran sekitar 200 kb
dan stabil dalam Agrobacterium pada temperatur di bawah 30 °C. Selama pembentukan
tumor urutan tertentu plasmid Ti T-DNA ditransfer ke sel tanaman dan berintegrasi ke
genom inti sel tanaman. Plasmid Ti membawa banyak gen yang terlibat dalam proses
infeksi, sebagian dari sekuennya berintegrasi ke DNA kromosom tanaman. Pada sebagian
besar plasmid Ti tersapat lima kompleks gen, yaitu T-DNA ( bagian yang ditransfer dan
menyatu dengan venom tanaman), gen virulen yan terdiri dari 50 kilo basa untuk mengatur
proses transfer T-DNA ke dalam DNA tanaman, gen tra/trb yang mengtur perpindahan
plasmid Ti antar bakteri, bagian yang mengatur replikasi plasmid dan bagian gen yang
menyenadikan molekul opin. Molekul opin ini akan dihasilkan oleh jarngan tanaman yang
terinfeksi bakteri pembawa plasmid.

Meskipun plasmid Ti efektif untuk dijadikan vektor alami dalam rekayasa genetika tetapi
plasmid tersebut memiliki beberapa kelemahan, oleh karena itu harus dilakukan manipulasi.
Berikut adalah Manipulasi plasmid Ti sebagai vektor kloning dalam rekayasa genetika:
 Produksi phytohormon (auksin dan sitokinin) pada sel transforman mengakibatkan sel
terus membelah (regenerasi sel tidak mengarah pada diferensiasi menjadi individu baru/
tanaman utuh), sehingga gen-gen auksin dan sitokinin harus dihilangkan.
 Gen pengkode sintesis opine tidak berguna bagi tanaman transgenic dan mungkin justru
akan menurunkan produktivitas tanaman transgenic sehingga gen ini perlu dihilangkan.
 Sebagai vektor kloning, sebaiknya plasmid dalam ukuran yang tidak terlalu besar
sehingga gen-gen lain dalam plasmid Ti yang tidak penting harus dihilangkan
 Replikasi plasmid akan lebih mudah bila dilakukan dalam sel bakteri E.coli sehingga
perlu ditambahkan ori dari E. coli

Vektor kloning plasmid Ti secara umum memiliki komponen:

 Gen penanda seleksi (selectable marker gene): gen-gen resistensi thd antibiotik
(kanamycinr, ampisilinr, tetracyclinr), gen gus, dll

7
 Ori E. coli
 Sekuen ‘right border’ dari T-DNA: penting untuk integrasi T-DNA pada DNA sel
tanaman
 Multiple Cloning Site (MCS) untuk memfasilitasi insersi DNA target pada TDNA

8
 DAFTAR PUSTAKA

Arbianto, Purwo. 1994. Biokimia Konsep-Konsep Dasar. ITB: Bandung

Baktir,Afaf.2017.DNA Struktur dan Fungsi. Surabaya : Airlangga University Press.

Old, R.W. dan Primrose. 2003. Prinsip-Prinsip Manipulasi Gen Pengantar Rekayasa. UI Press:
Jakarta.

Royston C. Clowes (September 1972). Molecular Structure of Bacterial Plasmids.

Bacteriological Reviews. 36 (3): 36 1-405.

Sambrook J, Fritsch EF, & Maniatis T. (1989) . Molecular cloning : A laboratory manual. USA:
Cold Sprinh Harbor Lab ress.

Widjayantie, Dwi. 2011. Konstruksi Plasmid Overekspresi Gen sgfpS65T Berbasis Vektor
Binary pCAMBIA13O5.1 untuk Studi Aktivitas Promoter. SKRIPS. Depok: FMIPA UI.

https://en.wikipedia.org/wiki/PUC19 diakses pukul 08.22 tanggal 05 april 2020.

https://bocascientific.com/standard-cloning-vector-puc18-p-773.html diakses pukul 20.00

tanggal 04 april 2020.

9
Pertanyaan Kelompok 5
1. Apa yang terkandung didalam plasmid pBR322 ?

2. Jelaskan bagaimana peran gen penanda pada plasmid pUC19 ?

3. Sebutkan bagian-bagian plasmid Ti

4. Sebutkan Manipulasi plasmid Ti sebagai vektor kloning dalam rekayasa genetika!

10