BUKU PANDUAN PRAKTIKUM

GENETIKA IKAN

DISUSUN OLEH:

TIM PENGAJAR

PROGRAM STUDI AKUAKULTUR

JURUSAN PERIKANAN
FAKULTAS PETERNAKAN DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS SULAWESI BARAT
2021
 PERCOBAAN 1

MEMBUAT MODEL DNA

A. Pendahuluan

DNA adalah molekul kompleks yang terdapat pada semua

organisme. Untuk memahami tentang struktur, fungsi dan replikasinya
dapat dilakukan dengan cara pembuatan model DNA. DNA mengandung
informasi genetik yang dapat diwariskan pada keturunan berikutnya.
Berbentuk double heliks dengan struktur berbentuk benang panjang yang
tersusun atas gula dan fosfat serta basa nitrogen (adenin, timin, guanin
dan sitosin). Satu unit dasar yang menyusun molekul DNA disebut
nukleotida. Sebuah nukleotida tersusun atas fosfat, gula deoksiribose dan
basa nitrogen (A, T, S, atau G). Kode-kode yang terdapat pada DNA
digunakan untuk membuat protein dari asam amino di dalam sitoplasma.
Proses pembentukan protein diawali dengan pembentukkan RNAd yang
membuat salinan DNA di dalam inti, selanjutnya protein dibangun di
ribosom.

B. Tujuan

Tujuan dari percobaan ini adalah mengenalkan bagaimana struktur

DNA dan menentukan jenis asam amino yang dibentuk berdasarkan kode-
kode dari basa nitrogen.
C. Alat dan Bahan
Unit-unit dasar DNA seperti gambar dibawah ini:
1. Pewarna (merah, hijau, kuning, biru, hitam dan ungu)

Gambar 1. Unit dasar DNA

1
2. Gunting
3. Lem
4. Pensil
5. Kawat
6. Tali /senar

D. Cara Kerja
1. Prosedur A : membangun DNA
a. Potong unit-unit pola di atas, lihat table 1 untuk jumlah yang
dibutuhkan.
b. Berilah warna untuk basa nitrogen, fosfat dan gula; adenine
(biru), guanine (hijau), timin (kuning), sitosin (merah), fosfat
(hitam) dan deoksi ribose (ungu).
c. Bentuk struktur nukleotida dengan menempelkan fosfat, gula
dan satu basa nitrogen menjadi satu rangkaian.
d. Buat 23 buah nukleotida lainnya sehingga seluruh nukleotida
terbentuk 24 buah nukleotida.
Aturan untuk pasangan basa DNA
A berpasangan dengan T
S berpasangan dengan G
e. Gunakan 12 nukleotida untuk membuat benang sebelah kiri dan
12 nukleotida lainnya untuk benang sebelah kanan.
f. Pasangkan benang sebelah kiri dengan benang sebelah kanan
sesuai dengan urutan pasangan basa nitrogennya.
g. Terbentuk DNA yang berbentuk seperti tangga, gunakan tali
/senang untuk menghubungkan masing-masing basa nitrogen,
gunakan kawat agar DNA tersebut dapat digantung.

2. Prosedur B : menentukan asam amino

a. Ambil untaian benang sebelah kiri DNA, dan buat pasangan
basa nitrogen untuk RNAd.
b. Gunakan urutan 3 basa nitrogen dari RNAd menjadi 1 kode
asam amino yang dikenal dengan istilah kodon.
c. 1 untaian benang RNAd akan menghasilkan 4 kode asam
amino, cocokan kode tersebut pada table 3 dibawah.

Tabel 1. Kodon RNAd

Asam Amino Kodon Asam amino Kodon
GCU, GCC, UUA, UUG, CUU,
Alanin Leusin
GCA, GCG CUC, CUA, CUG
CGU, CGC,
Arginin CGA, CGG, Lisin AAA, AAG
AGA, AGG
Asparagin AAU, AAC Metionin AUG
Asam aspartat GAU, GAC Fenilalanin UUU, UUC
CCU, CCC, CCA,
Sistein UGU, UGC Prolin
CCG

2
 UCU, UCC, UCA,
Glutamin CAA, CAG Serin
UCG, AGU,AGC
ACU, ACC, ACA,
Asam glutamat GAA, GAG Treonin
ACG
GGU, GGC,
Glycine Trpytophan UGG
GGA, GGG
UAU, UAC UAU,
Histidin CAU, CAC Tirosin
UAC
AUU, AUC,
Isoleusin Valin GUU, GUC,
AUA
Start AUG, GUG Stop UAG, UGA, UAA

Tabel 2. Basa DNA, kodon RNAd, dan asam amino

Basa DNA, kodon RNAd, dan asam amino
DNA
RNAd
Asam
amino

3
 PERCOBAAN 2

PREPARASI KROMOSOM (KARIOTIPE)

A. Pendahuluan

Analisa kromosom dapat digunakan untuk menentukan tingkat

ploidi (diploid, tiploid dan sebagainya) dan karakteristik suatu spesies
yang dikenal dengan teknik kariotipe. Pengamatan ukuran serta jumlah
kromosom dapat dilakukan dengan pembuatan preparat kromosom. Untuk
itu sangat diperlukan ketrampilan khusus dalam pembuatan preparat
kromosom. Pembuatan preparat kromosom dapat dilakukan dengan dua
cara yaitu dengan teknik jaringan padat dan teknik kultur darah. Preparasi
kromosom teknik jaringan padat lebih murah dan tidak membutuhkan
waktu yang terlalu lama dibandingkan dengan teknik kultur darah.

B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa mampu melakukan
preparasi kromosom jaringan padat dan dapat mengamati, mengetahui
serta menganalisa jumlah dan bentuk kromosom untuk menentukan
tingkat ploidi dan karakteristik spesies ikan yang diamati.

C. Bahan dan Alat

1. Bahan-bahan :
 Kolkisin (C22H25NO6)
 Etanol atau Metanol (C2H5OH)
 Kalium Klorida (KCl)
 Asam Asetat Glacial (CH3COOH)
 Giemsa
 Akuades

2. Alat-alat :
 Timbangan
 Mikroskop Binokuler
 Hot Plate
 Kertas Tissue
 Gelas objek
 Alat bedah (pinset dan pisau bedah)
 Pipet tetes
 Gelas objek cekung

4
D. Cara Kerja

1. Pembuatan Reagen
a. Larutan kolkisin 0,007 % w/v : dibuat dengan melarutkan 70 mg
kolkisin dalam 1 liter air.
b. Larutan hipotonik 0,075 M (1 liter) : dibuat dengan melarutkan
5,6 gram KCl dalam 1 liter akuades.
c. Larutan Carnoy : dibuat dengan mencampurkan Asam Asetat
Glacial dan Etanol atau Metanol dengan perbandingan volume 1
: 3.
d. Larutan alkohol 70 % : dibuat dengan mencampurkan Etanol
Absolut dan akuades dengan perbandingan 7 : 3 (1 liter alkohol
70 % = 700 ml etanol absolut + 300 ml akuades).
e. Larutan Giemsa 20 % : dibuat dengan mencampurkan Giemsa
dan akuades dengan perbandingan 2 : 8 (100 ml larutan Giemsa
20 % = 20 ml giemsa + 80 ml akuades).
f. Asam Asetat 50 % : dibuat dengan mencampurkan Asam Asetat
Glacial dan akuades dengan perbandingan volume 1 : 1.

2. Perendaman dengan Kolkisin dan Pengawetan Jaringan

a. Ikan direndam dalam larutan Kolkisin 0,07 w/v selama 6-9 jam.
Selama perendaman, ikan dibiarkan berenang dalam wadah
dengan aerasi yang baik. Setelah itu ikan dibunuh.
b. Sirip ekor dan insang ikan dipotong kecil-kecil. Potongan jaringan
tersebut direndam dalam larutan hipotonik (KCl 0,075 M) selama
60 menit pada suhu ruang. Larutan hipotonik diganti setiap 30
menit selama waktu perendaman dengan volume 20 kali volume
jaringan.
c. Jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 60 menit.
Larutan Carnoy diganti dengan yang baru setiap 30 menit.
d. Kemudian dilanjutkan dengan pembuatan preparat (bila
diperlukan jaringan yang telah difiksasi dapat disimpan dalam
refrigerator selama 2-3 minggu).

3. Pembuatan Preparat
a. Jaringan yang telah difiksasi diambil dengan menggunakan
pinset dan disentuhkan pada kertas tissue untuk menghilangkan
larutan fiksatif.
b. Kemudian jaringan tersebut diletakkan di atas gelas objek
cekung dan ditmbahkan 3-4 tetes asam asetat 50 %. Setelah itu
jaringan digerak-gerakkan dengan menggunakan pisau bedah
secara hati-hati hingga terbentuk suspensi sel (larutan menjadi
keruh).
c. Gelas objek yang akan digunakan sebagai preparat sebelumnya
direndam di dalam Alkohol 70 % minimal selama 2 jam.
d. Suspensi sel yang terbentuk diambil dengan menggunakan pipet
tetes lalu diteteskan di atas gelas objek yang ditempatkan di atas
hot plate dengan suhu 45-50 ºC, dan dihisap kembali dengan

5
 cepat setelah terbentuk lingkaran (ring) dengan diameter 1-1,5
cm. Pada setiap gelas objek idealnya dapat dibuat menjadi 3
lingkaran.

4. Pewarnaan Preparat
a. Preparat yang telah berisi lingkaran (ring) diwarnai dengan
larutan Giemsa 20 % dengan cara memberikan larutan sebanyak
3-5 tetes lalu disebarkan hingga menutupi ring dengan
menggunakan tusuk gigi, atau melalui teknik perendaman.
Pewarnaan dilakukan selama 20-30 menit pada suhu kamar.
b. Preparat dibilas dengan menggunakan akuades lalu dibiarkan
kering udara.
c. Preparat diamati di bawah mikroskop.
5. Preparat yang diperoleh kemudian difoto lalu digunting satu
persatu. Selanjutnya kromosom tersebut diukur dan disusun mulai
dari ukuran kromosom yang paling besar hingga terkecil.

6
 PERCOBAAN 3

SIMULASI HUKUM HARDY-WEINBERG

A. Pendahuluan
Salah satu cabang ilmu genetika yang sangat berkembang saat ini
adalah Genetika Populasi. Genetika Populasi merupakan ilmu yang
mempelajari atau melukiskan konsekuensi pewarisan mendel dari suatu
populasi dalam bahasa (terminologi) matematik. Genetik populasi
berhubungan dengan frekuensi dan interaksi alel dalam suatu populasi
mendel (medium populasi), yaitu suatu kelompok interbreeding dari
organisme yang masing-masing memiliki gen pool.
Berbagai macam spesies ikan yang memiliki keragaman yang
berbeda-beda yang dipengaruhi oleh 2 faktor utama yaitu faktor
lingkungan dan faktor genetik. Faktor lingkungan mempengaruhi
keragaman ikan dalam kemampuannya untuk beradaptasi, sedangkan
faktor genetik berpengaruh pada sifat-sifat ikan yaitu menyangkut warna,
bentuk tubuh, ukuran, berat badan, kecepatan pertumbuhan dan lain
sebagainya. Adanya pengaruh faktor genetik pada keragaman ikan
menyebabkan perlunya mempelajari tentang ilmu genetika atau pewarisan
sifat.

B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa :
1. Mempelajari kesetimbangan Hardy-Weinberg dengan
menggunakan frekuensi alel dominan dan alel resesif.
2. Mempelajari sifat dari pasangan alel yang memungkinkan untuk
bersifat dominan dan resesif dalam populasi yang diturunkan oleh
parental.
3. Mengetahui pewarisan sifat yang terlihat (fenotip) dari parental ke
keturunannya dengan merujuk pada hukum mendelian.
4. Mengetahui proporsi pewarisan sifat fenotip keturunan dari parental
dengan fenotip yang berbeda khususnya pada kasus fenotip ikan
guppy.

C. Bahan dan Alat

Seratus buah manik-manik yang terdiri atas dua warna dengan
nisbah (perbandingan) yang telah ditentukan dalam kotak tertutup.

D. Cara Kerja
1. Kocok manik-manik yang ada dalam kotak. Tanpa melihat isi kotak,
ambil secara acak dua buah manik-manik. Keduannya
menggambarkan datu individu yang diploid di dalam generasi
berikutnya. Catat genotif individu yang didapat (AA, Aa, aa) pada
Tabel 1.

7
Tabel 1. Data Pasangan Gen (Alel) Populasi Baru
1. 11. 21. 31. 41.
2. 12. 22. 32. 42.
3. 13. 23. 33. 43.
4. 14. 24. 34. 44.
5. 15. 25. 35. 45.
6. 16. 26. 36. 46.
7. 17. 27. 37. 47.
8. 18. 28. 38. 48.
9. 19. 29. 39. 49.
10. 20. 30. 40. 50.

2. Kembalikan kedua manik-manik yang telah terambil (langkah 1) ke

dalam kotak dan kocok isi kotak tersebut untuk mengembalikan
unggul gen (gene pool). Dengan mengembalikan manik-manik ke
dalam kotak setiap waktu pengambilan berarti besar gen akan tetap
dan peluang seleksi alel tetapsama dengan frekuensinya.
3. Ulangi langkah kedua sampai anda mendapatkan 50 (lima puluh)
individu yang membentuk generasi baru di dalam populasi.
4. Catat jumlah individu diploid untuk setiap genotif pada tabel 2.
Hitung frekuensi untuk ketiga macam genitip (AA, Aa, aa) dan
frekuensi alel untuk alel dominan dan resesif. Nilai yang didapat
merupakan frekuensi hasil pengamatan (observed) di dalam
populasi baru dan jumlahnya harus sama dengan satu.

Tabel 2. Frekuensi Genotip dan Alel Hasil Pengamatan dalam Populasi

Baru
Genotip
AA Aa Aa Jumlah Presentase
Individu
Gen A
Gen a
Total
Presentase

5. Untuk menentukan frekuensi harapan (expected), gunakan

frekuensi alel yang telah ditentukan di awal praktikum (perhatikan
bahwa frekuensi G = p dan frekuens g = q). Hasil frekuensi genotip
dengan rumus kesetimbangan Hardy – Weinberg : p2 + 2pq + q2 =
1. Jumlah individu harapan untuk setiap genotip dipoeroleh dengan
mengalihkan 50 (total populasi) dengan frekuensi harapan (pada
table 3).

8
Tabel 3. Frekuensi Harapan Genotip dan Alel pada Populasi Baru
Nilai Pengamatan

(Jumlah Genotip/Individu)
Genotip Frekuensi Alel
Harapan
Observed
(Expected)
AA
Aa
Aa
Jumlah

6. Untuk membandingkan hasil pengamatan dengan harapan, anda

dapat menggunakan uji statistik, chi-square (pada tabel 4).

Chi-square digunakan untuk menguji suatu nilai proporsi dari 2

kategori, dapat digunakan Chi-square test. Chi-square test akan tepat
digunakan apabila banyaknya observasi lebih besar dari 25. Apabila
kurang dari 25 observasi, sebaiknya menggunakan Binomial test. Selain
itu, tipe data yang digunakan pada Chi-square Test adalah nominal.

Tabel 4. Uji Chi-Square untuk Membandingkan Hasil Pengamatan dan

Harapan Genotip dan Alel pada Populasi Baru
Genotip Nilai o – e Nilai (o – e)2 Nilai e Hasil (3 : 4)
AA
Aa
Aa
Jumlah (X2 Hitung)
Keterangan : X2 tabel (db = 1, a = 0,05) = 3,841

9
 PERCOBAAN 4

KASUS GENETIKA KUALITATIF PADA IKAN

A. Pendahuluan

Sifat-sifat Mendel klasik yang dijumpai dalam bab-bab terdahulu

bersifat kualitatif, yaitu sifat-sifat yang mudah digolongkan ke dalam
kategori fenotip yang jelas. Fenotip-fenotip yang jelas ini berada di bawah
kendali genetik dari hanya satu atau beberapa gen dengan sedikit atau
tanpa modifikasi-modifikasi lingkungan yang mengaburkan pengaruh-
pengaruh gennya (Stansfield, 1991).
Biasanya kita beranggapan bahwa suatu kelas fenotip itu selalu
mudah dibedakan dari kelas fenotip yang lain. Akan tetapi bila
diperhatikan dengan baik, dalam kenyataannya kelas fenotip tadi tidak
dapat dibedakan semudah itu. Sebabnya karena seringkali masih dapat
diketahui adanya beberapa variasi di dalam suatu kelas fenotip. Misalnya
saja kulit hitam pada orang ada yang hitam sekali, hitam biasa, sawo
matang (Suryo, 2005).
Pewarisan karakter kualitatif mudah dibedakan karena masing-
masing mempunyai populasi yang jauh berbeda. Di lain pihak tertentu ada
kelompok antara yang sukar dikategorikan. Kelompok ini mewakili zona
transisi diantara kedua sistem pewarisan karakter dan termasuk bentuk
antara yang diwariskan karena pengaruh interaksi lingkungan yang
memungkinkan adanya sejumlah genotip yang diekspresikan pada bentuk
fenotipnya (Agus, Rosana dan Sjafaraenan, 2013).
Menurut Nasir (2001) karakter kualitatif merupakan wujud fenotipe
yang saling berbeda tajam antara satu dengan yang lain secara kualitatif
dan masing-masing dapat dikelompokkan dalam bentuk kategori.

B. Tujuan

Tujuan Percobaan ini adalah mahasiswa mampu menganalisis

beberapa kasus dalam genetika kualitatif dan bagaimana secara genetic
hal tersebut terjadi.

C. Bahan
1. Buku bahan ajar: Dasar-dasar Genetika Ikan dan
Pengembangbiakan.
2. Soal pemahaman genetika yang berisi:
a. Ikan Mas berpigmen normal dikawinkan dengan ikan mas
bergaris kuning pada spinal dorsal. Persentase fenotip
dominan dan resesif yang muncul adalah?
b. Ikan Guppy spina normal abu-abu dikawinkan dengan ikan
guppy spina bengkok blondi. Berapa persen didapatkan spina
normal blondi?

10
 c. Ikan Cupang (Siamese fighting fish) warna biru gelap
dikawainkan dengan warna hijau. Berapa yang menghasilan
warna biru logam?
d. Ikan Cupang biru mengkilat dikawinkan dengan ikan cupang
hijau. Bagaimana hasil rasio progeni untuk genotip dan
fenotipnya. Mana yang merupakan galur murni?
e. Ikan Rainbow Trout golden dipijahkan dengan ikan rainbow
trout palomino.Lengkapi (%) bahwa pigmen golden menjadi
galur murni dibandingkan palomino.
f. Ikan Guppy GgCucu dikawinkan ikan guppy Ggcucu. Ada
berapa perbedaan fenotip yang muncul?
g. Stok Ikan Molly didomestikasi dengan warna MMNn; MmNN;
mmNN. Fenotip yang muncul adalah?

D. Cara Kerja
Adapun metode yang dilakukan dalam praktikum ini yaitu
dengan menjawab 7 soal yang diberikan sebagai data dengan
mengacu pada tabel fenotip yang dipengaruhi oleh gen tunggal otosom
dengan aksidominan lengkap dan tabel genetika kualitatif dari buku
Dasar-dasar Genetika Ikan dan Pengembangbiakan.
Langkah dalam proses mengerjakan soal tersebut yaitu:
1. Menentukan parental dari masing-masing individu.
2. Menentukan fenotipe dan gamet pada masing-masing individu.
3. Menentukan hasil persilangan berupa F1.
4. Menentukan hasil persilangan berupa F2.
5. Menentukan hasil rasio fenotip dan genotip.
6. Menghitung hasil persentase persilangan dengan rumus:
…./16 x 100%

11
 PERCOBAAN 5

ANALISIS DNA

A. Pendahuluan
Analisis DNA banyak digunakan untuk karakteristik sifat genetik
pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip
(materi genetik) yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisa pada level
ini, jauh lebih akurat dibanding dengan analisa fenotip (morfometrik)
karena ciri fenotip merupakan hasil interaksi antara genotip dengan
lingkungan. Dengan kata lain, interpretasi hasil analisa fenotip tidak
pernah mencerminkan genotip yang dimiliki oleh organisme tertentu.
Aplikasi analisis DNA antara lain penentuan marker (penanda)
dalam mengukur hubungan kekerabatan antar kelompok ikan dalam
populasi, baik yang di alam maupun di lingkungan budidaya, studi
taksonomi, genetika populasi, dan diagnosa penyakit. Penggunaan
marker pada level DNA memiliki beberapa kelebihan yaitu tidak
dipengaruhi oleh lingkungan dan faktor pertumbuhan, lebih sensitif,
hampir semua jaringan dapat digunakan sebagai sumber material genetik
dan dapat digunakan dalam jangka waktu yang relatif lebih lama.
Sedangkan kelemahannya adalah prosedur yang cukup rumit dan
mahalnya biaya analisa.
Prosedur analisa DNA diawali dengan mengekstraksi genom DNA
dari sumber sel yang diikuti dengan proses isolasi sekuen DNA tertentu.
Seperti yang diutarakan oleh Lewin (1994), bahwa langkah awal dalam
menganalisa DNA adalah memecahkan genom DNA menjadi fragmen-
fragmen spesifik yang berukuran lebih kecil.
Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari
molekul-molekul lain di dalam suatu jaringan yang dilarutkan. Karena
secara alami, DNA adalah suatu molekul primer yang keberadaannya
selalu terkait dengan RNA dan protein. Sedangkan dalam menganalisa
DNA yang diperlukan adalah DNA dalam bentuk murni (Stine, 1973).
Langkah pertama dalam mengekstraksi DNA umumnya adalah
menghancurkan sel dan isolasi asam nukleat. Selanjutnya dilakukan
penghancuran inti sel sehingga DNA akan terlepas dan akan
menyebabkan viskositas larutan meningkat sehingga molekul DNA terlihat
lebih nyata. Langkah kedua adalah pemisahan DNA dari bahan-bahan
kontaminan seperti RNA dan protein.
Dalam ekstraksi DNA, jenis sumber sel yang digunakan ada
beberapa macam seperti hati, otot, sirip, darah dan sel hasil kultur.
Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar, sumber sel
terfiksasi dan sumber sel beku.

12
B. Tujuan

Tujuan percobaan ini adalah mahasiswa mampu melakukan

ekstraksi DNA secara sederhana dan mengamati presipitasi DNA

C. Metode Ekstraksi DNA Secara Manual

1. Bahan :
a. 10 x Isolasi DNA Buffer, dengan komposisi :
 100 mM Tris HCl (pH 8,0)
 200 mM NaCl
 200 mM EDT
 1 % SDS
b. Proteinase K (20 mg/ml)

2. Cara Kerja :
a. Tissue/jaringan sampel dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml,
disimpan on ice.
b. Tambahkan campuran/mix Lysis Solution sebanyak 50 l, yang
terdiri dari :
 5 l 10x Isolasi DNA Buffer
 2 l Proteinase K
 43 l SDW (Aquabidest steril)
c. Diinkubasi pada temperatur 55-60 ºC selama 2 jam atau sampai
semua tissue telah mengalami lysis.
d. Setelah lysis, kemudian diinkubasi lagi pada temperatur 100 ºC
selama 5 menit.
e. Dinginkan pada suhu ruang, lalu tambahkan 50 l SDW, vortex.
f. Sentrifuse dengan kecepatan 15.000 rpm selama 5 menit.
g. Supernatan yang terbentuk merupakan larutan DNA dan siap
digunakan untuk proses selanjutnya.

D. Cara Kerja
1. Ekstraksi DNA
a. Penghancuran Sel (Cell Lysis)
 Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan
ekstraksi DNA di Autoclave.
 Sampel ikan ditimbang sebanyak 10-20 mg, lalu dimasukkan
ke dalam tabung evendorf (1,5 ml).
 100-200 l Cell Lysis Solution ditambahkan ke dalam tabung
yang diletakkan di atas es lalu jaringan digerus hingga
homogen. Kemudian 200 l Cell Lysis Solution kembali
ditambahkan ke dalam tabung dan dihomogenkan.
 0,5 l Proteinase K ditambahkan ke dalam tabung dan
diaduk dengan menggunakan pipet.
 Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 55
ºC selama 3-24 jam.

13
 b. Eliminasi RNA
 0,5-1 l Rnase dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu diaduk
dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali.
Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 15-60 menit.
 Setelah inkubasi selesai, homogenat didinginkan pada suhu
ruang.

c. Pengendapan Protein
 30-40 l Protein Precipitation Solution ke dalam larutan
homogenat lalu divortex pada kecepatan tinggi selama 20
detik.
 Kemudian homogenat disentrifuse pada kecepatan 14.000
rpm selama 3 menit hingga terbentuk endapan protein dan
larutan yang mengandung DNA.

d. Pengendapan DNA
 Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-
hati ke dalam tabung baru yang telah berisi 200 l Larutan
Isopropanol 100 %.
 Tabung yang berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan
membolak-balikkan tabung sebanyak 50 kali hingga terlihat
untaian pita DNA yang berwarna putih.
 Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan
14.000 rpm selama 1 menit hingga terbentuk pelet DNA di
dasar tabung.
 Larutan supernatan dibuang dan tabung dikeringkan di atas
kertas tissue.
 200 l Larutan Etanol 70 % dingin, kemudian dimasukkan ke
dalam tabung yang berisi pelet DNA. Lalu tabung dibolak-balik
beberapa kali untuk membilas sisa-sisa DNA yang berada di
dinding tabung.
 Tabung disentrifuse pada kecepatan 14.000 rpm selama 1
menit.
 Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung
dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara
selama 15 menit.
 Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan
menambahkan 20 l akuades steril (SDW) ke dalam tabung.
 Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer atau langsung
digunakan untuk proses selanjutnya.

2. Pengukuran Konsentrasi DNA dan RNA

a. Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 10-20 kali (tergantung
pada hasil ekstraksi).
b. Alat Gene Quant dinyalakan, dan kuvet dikeluarkan dari tempat
penyimpanan lalu dibilas dengan akuades.

14
 c. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur absorbansi pelarut (SDW
untuk DNA), dengan memasukkan 70 l pelarut tersebut ke dalam
kuvet. Kemudian kuvet dimasukkan ke dalam alat, lalu tekan
tombol “set ref”, hasil pembacaan akan menunjukkan nilai
absorbansi 0,000. Dilanjutkan dengan pengukuran konsentrasi
DNA atau RNA.
d. Kuvet yang akan digunakan, dibilas terlebih dahulu dengan 20 l
larutan DNA yang akan diukur. Setelah itu larutan asam nukleat
yang akan diukur dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 70 l dan
kuvet ditempatkan di dalam alat.
e. Setelah tombol “sample” ditekan dan konsentrasi larutan sudah
terbaca, kuvet dikeluarkan dan dibilas dengan akuades.
3. PCR (Polymerase Chain Reaction)
a. Preparasi sampel dapat dilakukan dengan beberapa cara sesuai
dengan Taq Polymerase yang digunakan :
 Menggunakan ExTaq Polymerase
Pembuatan larutan premix yang terdiri dari :
Bahan Jumlah
10 x Buffer Ex Taq 2,50 l x jumlah sampel x 1,1
DNTP 2,00 l x jumlah sampel x 1,1
Primer
 Forward 1,00 l x jumlah sampel x 1,1
 Reverse 1,00 l x jumlah sampel x 1,1
Ex Taq 0,25 l x jumlah sampel x 1,1

 Larutan premix dibagi ke dalam masing-masing mikrotube

sebanyak 6,75 l, yang telah berisi SDW (Sterile Distillated
Water) sebanyak 17,25 l.
 Masukkan masing-masing sampel DNA sebanyak 1 l
sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 25 l.

b. Menggunakan Pure Taq Ready-To-Go-PCR Beads

Tambahkan pada tube yang berisi PCR Beads masing-masing
bahan berisi berikut ini, hingga volume akhir setiap mikrotube
adalah 25 l.
Sampel DNA 2 l
Primer Forward 2 l
Primer Reverse 2 l
SDW 19 l
Total Volume 25 l

15
 c. Masukkan masing-masing mikrotube ke dalam mesin PCR yang
telah diprogram sebagai berikut :
Proses Suhu Lama Waktu
Pengkondisian 94 ºC 4 menit
Awal
Siklus PCR :

Denaturasi 94 ºC 0,45 detik

Annealing 50 ºC 0,45 detik
Extension 72 ºC 90 detik
Penstabilan 72 ºC 7 menit
Note : Suhu annealing disesuaikan dengan sekuen primer yang
digunakan.

d. Setelah proses PCR mencapai 30 ulangan dan mesin

menunjukkan suhu 4 ºC, mesin dimatikan dan hasil PCR disimpan
di dalam refrigerator untuk selanjutnya dapat dielektroforesis.

4. Elektroforesis
Proses elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose
yang kepekatannya disesuaikan dengan sampel yang akan dicek, yaitu
sebagai berikut :
No. Jenis Sampel Konsentrasi Gel
1. Hasil ekstraksi 0,8-1 %
DNA
2. Hasil PCR 1%
3. Hasil restriksi 1,5-2 %
1. Cara pembuatan gel agarose
a. Larutkan serbuk agarose dalam larutan Tris Borate EDTA
(TBE) yang mengandung Ethidium Bromide (30 l/1 liter
TBE).
b. Panaskan dalam microwave selama 1,5 menit atau larutan
sampai menjadi bening.
c. Larutan dibiarkan sampai hangat kemudian dituangkan ke
dalam cetakan yang telah dilengkapi sisir/comb sebagai
cetakan sumur/well elektroforesis.
d. Gel dibiarkan membeku, kemudian dimasukkan ke dalam bak
elektroforesis yang telah berisi larutan buffer elektroforesis.
2. Prosedur Elektroforesis
a. ± 3 l volume sampel yang akan di cek dicampur dengan 0,5
l loading buffer yang mengandung bahan pemberat DNA
dan pewarna (Bromophenol Blue).
b. Campuran dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis.
c. Bak elektroforesis ditutup dan listrik dialirkan dengan
tegangan 250 volt dan kuat arus 80-100 mA.

16
d. Setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif
mencapai ¾ bagian dari panjang gel, maka proses
elektroforesis dapat dihentikan.
e. Gel diangkat dari bak elektroforesis dan dilepaskan dari
cetakan untuk selanjutnya diamati dengan menggunakan
ultraviolet transluminator dengan panjang gelombang pendek
(280 nm).

17
 DAFTAR PUSTAKA

Fujaya, Y. 2005. Genetika dan Pemuliaan Ikan.

Tim Pengajar Mat Kuliah Dasar Genetika Ikan. 2015. Penuntun Praktikum
Dasar Genetika Ikan dan Pemuliaan. Fakultas Ilmu Kelautan dan
Perikanan. Universitas Hasanuddin. Makassar.

18