IMMUNIHISTOCHEMOSTRY (IHC)

A. Alat:
1) Humidity chamber
2) Mikropipet 100-1000 µL
3) Mikropipet 10-100 µL
4) Mikropipet 1-10 µL
5) Stopwatch
6) Glass jar kaca
7) Glass jar akrilik
8) Microwave
9) Handschoen/gloves
10) Masker
B. Bahan:
1) Antibodi anti-αSMA (first anibody)
2) BSA 1% dalam PBST
3) Background Sniper (Starr Trek Universal-HRP Detection Kit)
4) Trekkie Universal Link (Starr Trek Universal-HRP Detection Kit)
5) Betazoid DAB Chromogen & Substrate Buffer (Starr Trek Universal-HRP Detection Kit)
6) Citrate buffer 1x
7) PBS
8) Aquades
9) Etanol 70%, 80%, 90%, 100%
10) Xylene
11) Entellan® (mounting medium)
12) Tip biru, putih, kuning
13) Parafilm
14) Tisu
C. Langkah Kerja (1 Day)
1) Ambil slide sampel dari kulkas 4⁰C dan diamkan pada suhu ruang selama ±30 menit.
2) Deparafinisasi: Rendam sampel dalam xylene 3 kali selama 5 menit.
3) Rehidrasi: Rendam sampel dalam etanol bertingkat mulai dari 100%-90%-80%-70%.
4) Lakukan antigen retrieval (AR) dengan menggunakan metode HIAR (heat induced AR).
5) Pindahkan slide ke dalam humadity chamber.
6) Cuci slide dengan PBS 1 x 1000 µL selama 5 menir sebanyak 3 kali.
7) Keringkan slide menggunakan tisu pada permukaan bawahnya dan sekitar jaringan
(tanpa menyentuh jaringan).
8) Inhibisi peroksidase endogen dengan H2O2 3% selama 5 menit.
9) Cuci slide dengan PBS 1 x 1000 µL selama 5 menit sebanyak 3 kali.
10) Keringkan slide menggunakan tisu pada permukaan bawahnya dan sekitar jaringan
(tanpa menyentuh jaringan).
11) Lakukan blocking background dengan menggunakan kit dari Star Trek Universal-HRP
Detection Kit selama 20 menit.
12) Keringkan slide menggunakan tisu pada permukaan bawahnya dan sekitar jaringan.
13) Pemerian first antibody (αSMA) dan simpan sampel pada suhu ruangan selama 1 jam.
14) Cuci slide dengan PBS 1 x 1000 µL selama 5 menit sebanyak 3 kali.
15) Keringkan slide menggunakan tisu pada permukaan bawahnya dan sekitar jaringan.
16) Teteskan 1-2 tetes Trekkie Universal Link (Star Trek Universal-HRP Detection Kit)
kemudian tutup jaringan dengan parafilm tunggu selama 60-90 menit pada suhu ruang.
17) Cuci slide dengan PBS 1 x 1000 µL selama 5 menit sebanyak 3 kali.
18) Keringkan slide menggunakan tisu pada permukaan bawahnya dan sekitar jaringan.
19) Teteskan 1-2 tetes TrekAvidin-HRP Label (Starr Trek Universal HRP Detection Kit)
kemudian tutup jaringan dengan parafilm tunggu selama 45 menit pada suhu ruang.
20) Cuci slide dengan PBS 1 x 1000 µL selama 5 menit sebanyak 3 kali.
21) Keringkan slide menggunakan tisu pada permukaan bawahnya dan sekitar jaringan.
22) Persiapkan larutan DAB 1:400 (1 µL Betazoid DAB Chromogen + 400 µL Betazoid
DAB Substrate Buffer). Tiap slide membutuhkan sekitar 100 µL larutan DAB.
23) Teteskan 70-100 µL DAB pada jaringan per slide dan tunggu selama 3 menit.
24) Cuci dengan air mengalir selama 5 menit dalam glass jar kaca.
25) Rendam slide sampel dalam glass jar kaca yang berisi hematoxylin selama 2 menit
(optional).
26) Cuci dengan air mengalir selama 5 menit dalam glass jar kaca.
27) Dehidrasi.
28) Clearing.
29) Mounting.
 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

A. Alat:
1) Mikropipet dan tipnya
2) Ice pack
3) Tabung eppendorf 0,2 cc
4) Tabung eppendorf 1,5 cc
5) Etanol 70%
6) Tissue
7) Handschoen/Gloves
8) Masker
B. Bahan:
1) cDNA 1-3 µL
2) Master mix (GoTaq Green, Promega, M7122) 12,5 µL
3) Primer forward 0,6 µL 25 µL
4) Primer reverse 0,6 µL
5) PCR water 8,3-10,3 µL
C. Langkah Kerja:
1) Bersihkan meja yang akan digunakan menggunakan etanol 70%.
2) Masukkan bahan dalam box yang berisi ice pack.
3) Siapkan tabung eppendorf 0,2 cc dan diberi nama sesuai dengan cDNA yang akan
digunakan.
4) Masukkan 3 µL cDNA dari tabung eppendorf yang disimpan pada suhu -20⁰C ke dalam
tabung eppendorf 0,2 cc sesuai dengan namanya menggunakan mikropipet merah.
TETAP DILETAKKAN DALAM ICED BOX.
5) Persiapan PCR Mixture gen GADPH* yang terdiri dari
Jumlah sampel
cDNA 3 µL
Master mix 12,5 µL x… = … µL
Primer forward 0,6 µL x… = … µL
Total Mixture untuk X sampel
Primer reverse 0,6 µL x… = … µL
PCR Water 8,3 µL x… = … µL
6) Masukkan PCR Mixture yang telah dibuat ke dalam tabung eppendorf yang berisi cDNA
sebanyak 22 µL (karena volume cDNAnya 3 µL dan jumlah total volume dalam 1
tabung eppendorf = 25 µL) menggunakan mikropipet.
7) Lakukan PCR di Laboratorium Riset Terpadu dengan kondisi PCR untuk gen GADPH*:
Initial Denaturation 94⁰C 2 menit
Denaturation 94⁰C 10 detik
Annealing 60⁰C* 20 detik 30 siklus*
Extension 72⁰C 1 menit
Last extension 72⁰C 10 menit
Hold 4⁰C
 8) Setelah prosedur PCR selesai, dilanjutkan dengan elektroforesis.

NB:
1) Semua bahan harus diletakkan di box dengan ice pack.
2) Campur dengan cara pipetting tanpa menimbulkan gelembung udara.
3) Transportasi sampel dengan menggunakan iced box.
4) Master mix (GoTaq Green) dikeluarkan paling akhir dari tempat penyimpanan.
5) * = gen GADPH digunakan sebagai contoh dalam protocol PCR ini, bisa menggunakan
gen lain. Suhu annealing dan siklus disesuaikan dengan protocol PCR untuk gen tertentu.
 ELEKTROFORESIS

A. Alat:
1) Perangkat alat elektroforesis
2) Mikropipet dan tipnya
3) Tisu
4) Ice Pack
5) Ice Box
B. Bahan:
1) TAE/TBE 0,5x
2) Gel agarosa
3) GelRed (Biotium, 41003)
4) DNA ladder (Vivantis, NL1407)
5) DNA loading dye
6) Aquades
C. Langkah Kerja:
1) Membuat gel agarosa 2 %:
a. Campur 1 gram gel agarosa dengan 50 mL TAE 0,5x (untuk gel plate ukuran besar,
disesuaikan bila menggunakan gel plate kecil).
b. Panaskan dalam microwave selama 3-4 menit, sampai semua serbuk gel terdilusi
sempurna.
c. Tambahkan 1 µL GelRed untuk 100 mL TAE 0,5x.
d. Dituangkan gel agarosa ke gelplate dan diamkan selama 30 menit hingga 1 jam pada
suhu ruang.
2) Elektroforesis:
a. Letakkan agar dalam mesin elektroforesis yang sudah diisi larutan TBE sampai
semua agar terendam sempurna.
b. Masukkan 5 µL DNA ladder ke dalam well di ujung kiri.
c. Masukkan sampel sebanyak 10 µL ke well berikutnya.
d. Pastikan arah muatan electrode sudah sesuai (DNA akan bergerak dari muatan
negatif ke muatan positif).
e. Jalankan mesin elektroforesis pada tegangan 1000 mV.
f. Tunggu DNA berjalan sampai kira-kira 6 garis (5-10 menit).
g. Bawa agar yang telah di elektroforesis menggunakan kotak plastic ke Laboratorium
Riset Terapdu untuk difoto.

NB:
1) 1 kotak gel plate kecil = 25 mL, 1 kotak gel plate besar = 50 mL.
 ANALISIS SAMPEL HISTOLOGI

A. Alat dan Bahan:

1) Laptop/PC
2) Software ImageJ (NIH)
Bias diunduh pada tautan berikut: https://imagej.nih.gov
3) File foto jaringan

B. Langkah Kerja:
1. Kuantifikasi fraksi area
a. Penggunaan:
Dapat digunakan untuk kuantifikasi fibrosis jaringan.
b. Prinsip dasar:
 ImageJ akan menandai “Signal’ (imunopositif pada pewarnaan IHC) dan
“Background” sehingga hasil dari pewarnaan IHC diusahakan dapat
membedakan dengan jelas signal (imunopositif) dan background (imunonegatif).
 Kuantifikasi pada ImageJ menggunakan metode “Hitam-Putih”, di mana signal
= hitam, background = putih (atau kebalikannya).
 Pada pewarnaan IHC kadang tidak perlu menggunakan pewarnaan inti sel karena
sudah terwarnai cokelat dengan DAB.
c. Langkah kerja:
1) Buka file foto jaringan: klik File → Open → file foto jaringan yang akan
dianalisis.
2) Klik Image → pilih 8-bit/16-bit untuk membuat gambar menjadi “hitam-putih”.
3) Sesuaikan threshold dari signal dan background (biasanya signal jadi berwarna
merah dan background jadi berwarna hitam). Pengaturan threshold dilakukan
melalui tampilan kotak threshold → atur luas signal sesuai gambar. INGAT:
terkadang inti sel akan terkode signal. Jika seusia klik apply maka signal jadi
berwarna hitam.
4) Hapus objek selain signal yang terkode “signal” (berwarna hitam) dengan
menggunakan brush. Klik tanda panah di bagian kanan atas → pilih drawing tool
→ pilih tulisan brush atau gambar penghapus. Luas hapusan dapat diatur dengan
klik 2x tanda penghapus, kemudian atur luasnya (masukkan angka).
5) Lakukan kuantifikasi dengan mengatur measurement. Klik analyze → pilih set
measurement →pilih area fraction → klik OK.
6) Klik analyze lagi → pilih measurement → muncul result. Hasil fraksi area
terdapat di bagian result dengan satuan persen (%).
7) Fraksi area yang dimaksud adalah luas warna hitam (signal) dalam satu lapamg
pandang (warna putih), dengan satuan PERSEN (%).
2. Mengukur ketebalan dinding arteri
a. Prinsip dasar:
  Mengukur ketebalan dinding dinding arteri biasanya digunakan untuk
mendeteksi adanya hipertrofi tunika media (lapisan otot polos).
 Diperlukan adanya ukuran (dalam µm) pada gambar.
b. Langkah kerja:
1) Mengatur skala untuk menentukan ukuran yang akan digunakan:
a. Buka file foto jaringan yang akan dianalisis di ImageJ.
b. Pilih straight line selection (dibagian atas ImageJ berupa gambar garis lurus).
c. Gunakan pada gambar sesuai dengan ukuran yang ada.
d. Klik analyze → set scale.
e. Masukkan nilai ukuran dan satuannya.
2) Pilih analyze → set measurement pilih area dan perimeter (keliling).
3) Gunakan freehand selection untuk melingkari tepi luar dinding arteri (tunika
eksterna).
4) Pilih analyze →measure, maka didapatkan data perimeter dinding arteri (dalam
µm) dan luas vasa (µm2).
5) Ulangi untuk lapisan endotel dengan freehand selection untuk melingkari tunika
intima (lapisan endotel).
6) Pilih analyze → measure, maka didapatkan data perimeter lumen arteri (dalam
µm) dan luas lumen (µm2).

Keterangan:
Wall thickness = wall area /
perimeter center
Wall area = vessel area – lumen
area
Perimeter center = (perimeter
dinding + perimeter lumen) / 2

Bias juga digunakan untuk

lumen/wall ratio (misal untuk
memperlihatkan penyempitan
lumen akibat vasokonstriksi yang
disebabkan oleh adanya hipertrofi
otot polos.
3. Manual cell counter
1) Buka file foto jaringan yang akan dilakukan kuantifikasi pada imageJ.
2) Klik plugin → analyze → pilih cell counter → klik keep original, initialize, dan
counter type.
3) Tandai signal (sel yang imunopositif pada pewarnaan IHC atau yang akan dihitung)
menggunakan klik kiri pada mouse computer.
4) Hasil tebaca.

4. Analisis densitometry
CARA I
1) Buka file foto elektroforesis yang akan dilakukan kuantifikasi pada ImageJ.
2) Pilih pada menu bar: analyze → set measurement→ integrated density → OK.
3) Klik rectangular pada status bar.
4) Posisikan rectangular agar mengelilingi band elektroforesis, dengan sedikit
menyertakan area yang berwarna hitam. Band elektroforesis berwarna putih
merupakan signal, sedangkan area berwarna hitam merupakan background.
5) Klik analyze → set measurement→ integrated density → OK.
6) Hasil densitas band elektroforesis akan terbaca.

CARA II
1) Buka file foto elektroforesis yang akan dilakukan kuantifikasi pada ImageJ.
2) Klik rectangular pada status bar.
3) Pilih pada menu bar: analyze → gels → select first lane (Ctrl+1) → geser
rectangular tersebut ke band berikutnya.
4) Klik analyze → gels → select next lane (Ctrl+2) → geser rectangular tersebut ke
band berikutnya (lakukan langkah ini sampai band terakhir).
5) Klik analyze → gels → plot lanes (Ctrl+3). Akan didapatkan kurva seperti gambar
disamping ini:
6) Pilih menu straight. Kemudian letakkan melintang di atas kurva, sehingga bagian
atas kurva tertutup.
7) Pilih menu Wand (tracing) tool. Klik pada area di dalam kurva.
8) Hasil densitas band elektroforesis akan terbaca.