ELEKTROFORESIS DNA

I. PENDAHULUAN
Elektroforesis DNA merupakan suatu teknik pemisahan sampel DNAberdasarkan
berat molekulnya. Proses pemisahan molekul DNA ini dilakukan dalammedia gel,
dengan bantuan arus listrik. Gel yang biasa digunakan dalam proses elektroforesis
DNA adalah gel agarosa. Dengan menggunakan gel agarosa, ukuran sampel DNA
yang dapat dipisahkan berkisar dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).

Selain dipengaruhi oleh besarnya molekul, proses pemisahan sampel DNA ini
juga dipengaruhi oleh bentuk molekul dan besaran arus listrik yang digunakan.
Molekul DNA sendiri bermuatan negatif. Hal ini menyebabkan terjadinya pergerakan
sampel DNA menuju kutub positif (anode) jika suatu sampel DNA ditempatkan
dalam gel agarosa yang telah dialiri listrik. Semakin kecil berat molekul suatu sampel
DNA, maka akan semakin cepat pergerakan atau migrasinya. Begitu pun sebaliknya,
semakin besar ukuran molekul, maka akan semakin lambat atau rendah laju
migrasinya.

Berat molekul suatu sampel DNA dapat diperkirakan dengan cara

membandingkan laju migrasi atau pergerakannya dengan laju migrasi suatu fragmen
molekul DNA standar yang telah diketahui ukurannya (marker). Selanjutnya hasil laju
migrasi baik sampel DNA maupun marker akan divisualisasi sehingga dapat dinilai.
Tindakan visualisasi dilakukan dengan menggunakan paparan sinar ultraviolet setelah
sebelumnya gel yang berisikan sampel DNA yang sudah bermigrasi tersebut direndam
didalam larutan etidium bromida.

II. TUJUAN PRAKTIKUM

Mahasiswa mengetahui prinsip dan cara kerja pemeriksaan elektroforesis DNA

III. BAHAN DAN ALAT

BAHAN
a. TBE Buffer 1x
b. Bubuk agarosa (agarose powder)
c. Air destilasi
d. Ethidium Bromide
e. Sampel DNA yang telah melalui PCR (amplicon)
f. Loading dye

ALAT
a. Timbangan analitik
b. Gelas ukur 1000 ml
c. Labu erlenmeyer 100 ml
d. Microwave
e. Mikropipet 100 μL dan 20 μL beserta tipnya
f. Sarung tangan
g. Kertas Parafilm
h. Apparatus elektroforesis
i. UV transiluminator
j. Kaca mata UV
k. Gel Doc

IV. CARA KERJA

IV.1. Pembuatan Gel Agarosa
a. Timbang bubuk agarosa di timbangan analitik sesuai kebutuhan. Misalnya kita
hendak membuat gel agarosa 2%. Artinya kita membutuhkan gel agarosa
sebanyak 2 gr untuk 100 ml Buffer TBE 1x
b. Tuang 2 gr bubuk agarosa kedalam tabung erlenmeyer
c. Tambahkan 100 ml Buffer TBE 1x
d. Didihkan sampai larut (homogen) didalam pemanas atau microwave selama ± 4
menit
e. Dinginkan tabung hingga kurang lebih mencapai suhu 600C dalam suhu kamar
f. Tambahkan ethidium bromide sebanyak 5 μL
g. Goyangkan tabung perhalan hingga ethidium bromide tercampur merata
h. Larutan siap dituangkan
IV.2. Loading
a. Siapkan baki (tray) elektroforesis
b. Pasang sisir (comb) elektroforesis di salah satu ujung baki dengan posisi hampir
menyentuh dasar baki.
c. Jika baki sudah terpasang sisir, tuangkan larutan agarosa yang tadi telah
dipersiapkan.
d. Diamkan larutan hingga berubah menjadi gel yang padat.
e. Jika telah terbentuk gel yang padat, cabut sisir dengan hati-hati.
f. Ambil gel yang telah padat dan letakkan ke dalam tangki elektroforesis yang
sebelumnya telah berisikan larutan TBE Buffer 1x. Pastikan gel benar-benar
terendam sepenuhnya didalam larutan tersebut.
g. Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
h. Campurkan secara merata sejumlah sampel DNA dan loading dye sesuai yang
dibutuhkan diatas kertas parafilm terlebih dahulu sebelum campuran tersebut
dimasukkan ke dalam sumuran gel
i. Buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang
dimasukkan

IV.3. Running
a. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (Pastikan bahwa
kabel yang tersambungkan ke kutub negatif berada di dekat sumuran, sedang
kabel yang tersambung ke kutub positif berada jauh dari sumuran; jika tidak
demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
b. Nyalakan sumber arus, aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh
voltase dan waktu yang diinginkan dengan cara menekan tombol yang sesuai
pada sumber arus.
c. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run
pada sumber arus.
d. Elektoforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang
ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari
tangki elektroforesis.
e. Dengan menggunakan sarung tangan keluarkan gel.
IV.3. Visualisasi
a. Keluarkan gel dan letakkan di atas UV transiluminator (Letakkan selubung kaca
hitam di atas UV transiluminator).
b. Nyalakan UV transiluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi
ATAU
a. Keluarkan gel dan masukkan kedalam gel doc
b. Lakukan pemotretan, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi
 EKSTRAKSI DNA (Metode Chelex - 100)

Bahan :
1. PBS (Phosphate Buffer Saline) pH 7,4
2. Safonine 0,5% dalam PBS
3. Chelex 20% dalam ddH2O pH 10,5

Cara Kerja nya :

1. Ambil 200 luL darah dan dimasukkan ke dalam tabung 1,5mL steril
2. Dicuci dengan {BS pH 7,4 sebanyak 1000 luL kemudian disentrifuge dengan
kecepatan 5.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang. Tahap ini diulang 2-3 kali.
3. Supernatan dibuang lalu ditambahkan 500luL saponin 0,5% , campur dengan baik
menggunakan vortex. Inkubasi dalam selama 24 jam di lemari pendingin -20oC.
4. Vortex kembali biar segar mencair. Lalu sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 10 menit, buang supernatan.
5. Tambahkan PBS 1.000 luL, sentrifuge pda kecepatan 5000 rpm selama 10 menit,
buang supernatan. Diulangi 2x sampai supernatan bening.
6. Supernatan dibuang ditambah 50 luL Chelex dan ditambahkan 1000 luL ddH2O.
7. Diinkubasi dalam air mendidih selama 10 menit
8. Sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
9. DNA akan berada pada bagian supernatan (DNA containing water) lalu bagian ini
dipindahkan dalam tabung steril dan disimpan pada -20oC.

KOMPOSISI PCR Mix :

1. ddH2O 9 luL
2. 2. GoTaq Green 10 luL
3. Prmer-R 0,5 luL
4. Primer-F 0,5 luL
5. DNA (Sampel) 5 luL
Total 25 luL
RFLP Mix :

1. ddH2O 9 luL
2. Buffer 1 luL
3. Enzim 0,5 luL
4. Amplikon 10 luL
5. Total 15 luL

37oC selama 2-3 jam

HASIL :