Vatika Kamaliyyah Zahra 21/478772/KU/23211

Analisis Pengaruh Pemberian Ekstrak Flavonoid Buah Cantigi terhadap Ekspresi Gen
Inflamasi TNFα pada Sel RAW264.7 Menggunakan RT-qPCR

Latar Belakang
Buah cantigi atau bilberry (Vaccinium myrtillus L.). Buah cantigi merupakan salah
satu jenis makanan fungsional yang juga dikenal sebagai ‘superfood’ karena memiliki
kandungan antosianin yang merupakan antioksidan utama dan diketahui memiliki sifat
antiglikosidan (Neamtu, dkk., 2020). Selain itu, buah cantigi juga memiliki kandungan
senyawa bioaktif lainnya seperti terpenoid (triterpenoid, tetraterpen, and iridoid), flavonol
(quercetin and myricetin), tanin and flavanol (katekin dan epikatekin), kumarin, asam fenolik
dan resveratrol (Sharma & Lee, 2022).

Inflamasi adalah respons normal tubuh terhadap cedera, iritasi, atau infeksi. Ini adalah
proses biologis kompleks yang melibatkan reaksi sistem kekebalan tubuh untuk melindungi
jaringan tubuh dari agen penyebab cedera atau infeksi (Sharma & Lee, 2022). Selama
inflamasi, zat kimia mediator seperti histamin, prostaglandin, dan sitokin dilepaskan. Ini
menyebabkan gejala inflamasi seperti kemerahan, pembengkakan, nyeri, dan peningkatan
suhu di area yang terkena. Inflamasi bertujuan untuk memperbaiki kerusakan, melawan
infeksi, dan memulai proses penyembuhan. Inflamasi dapat terjadi dalam dua bentuk, yaitu
inflamasi akut dan inflamasi kronis. Inflamasi akut berlangsung dalam waktu singkat dan
biasanya terkait dengan infeksi atau cedera jaringan. Inflamasi kronis, di sisi lain,
berlangsung dalam jangka waktu yang lebih lama dan terkait dengan kondisi seperti penyakit
autoimun atau penyakit kronis (Sharma & Lee, 2022).

Sel RAW264.7 merupakan sel kultur yang menyerupai makrofag (Taciak, dkk.,
2018). Sel ini biasa digunakan dalam penelitian biomedis dan imunologi sebagai model untuk
mempelajari respons imun dan inflamasi (Taciak, dkk., 2018). Untuk menginduksi sinyal
inflamasi pada sel RAW264.7, digunakan jalur persinyalan TLR4 (Toll-like Receptor) yang
diaktivasi oleh LPS (Bayazid, dkk., 2021). TLR4 kemudian akan mengaktivasi nuclear
factor-kB (NF-kB) yang akan menginduksi sinyal ekspresi gen pro-inflamasi (Bayazid, dkk.,
2021).
Vatika Kamaliyyah Zahra 21/478772/KU/23211

Tujuan
Mengetahui pengaruh ekspresi gen inflamasi TNFα pada sel RAW264.7 akibat pemberian
ekstrak flavonoid buah cantigi menggunakan teknik RT-qPCR

Metode Analisis

Untuk mengevaluasi tingkat ekspresi mRNA sitokin pro-inflamasi TNFα digunakan

metode RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction) adalah
sebuah metode analisis ekspresi gen yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur jumlah
relatif mRNA (asam ribonukleat pesan) spesifik dalam sampel biologis. Metode ini
menggabungkan teknik transkripsi balik (reverse transcription) untuk mengubah mRNA
menjadi DNA komplementer (cDNA), dan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk
mengamplifikasi dan mengukur jumlah cDNA yang dihasilkan (Xie, dkk., 2019).

Sel RAW264.7 direaksikan dengan LPS selama 8 jam, kemudian ekstrak flavonoid
dari buah cantigi dengan dosis 200 μmol/L ditambahkan ke dalam sel tersebut, kemudian
diinkubasi selama 72 jam. Selanjutnya, tingkat ekspresi mRNA sitokin pro-inflamasi TNFα
diukur menggunakan RT-qPCR. Kemudian, tingkat ekspresi mRNA pada sampel yang
diberikan ekstrak flavonoid dan yang tidak diberikan ekstrak flavonoid dibandingkan (Xie,
dkk., 2019).

Sebelum dilakukan analisis, dilakukan ekstraksi RNA pada sel RAW264.7 yang
sudah diberikan perlakuan maupun yang tidak diberikan perlakuan menggunakan metode
yang dilakukan oleh Amirouche, dkk. (2021). Sampel diinkubasi dalam 1 mL TRIzol, lalu
ditambahkan 200 μL kloroform dan pengocokan selama 15 detik. Kemudian tabung tersebut
ditrosentrifugasi selama 15 menit pada 20000g pada suhu 4°C. Lapisan air jernih di bagian
atas, yang mengandung RNA, ditransfer ke tabung baru berkapasitas 1,5 mL, dan
ditambahkan 0,5 mL isopropanol per mililiter TRIzol awal. Pengadukan lembut dengan
membalikkan tabung sebanyak 5 kali dilakukan sebelum diinkubasi selama 10 menit pada
suhu kamar. Sampel tersebut disentrifugasi selama 15 menit pada 20000g pada suhu 4°C.
Supernatan dibuang, dan pelet yang tersisa diresuspensi dalam 1000 μL etanol 80%. Sampel
tersebut kembali disentrifugasi selama 5 menit pada 15000g pada suhu 4°C. Etanol berlebih
dibuang, pertama dengan menggunakan pipet 200 μL dan kemudian dengan pipet 2 μL
hingga menyisakan RNA pada tabung yang bentuknya menyerupai pellet (Pelet harus terlihat
Vatika Kamaliyyah Zahra 21/478772/KU/23211

seperti kaca.) RNA total yang diisolasi dilarutkan dengan 20 μL air bebas nuklease (Ambion).
Konsentrasi dan kemurnian RNA ditentukan dengan menggunakan BioDrop (Biochrom)
dengan menghitung rasio kepadatan optik pada panjang gelombang 260/280 nm dan 260/230
nm.

Selanjutnya, dilakukan RT-qPCR pada sampel menggunakan prosedur yang

digunakan oleh Xie, dkk. (2019). Sebanyak 2 μg total RNA dicampur dalam larutan dengan
volume akhir 25 μL, larutan tersebut berisi campuran yang mengandung 1 × buffer RT, 100
U enzim reverse transcriptase, 8 U inhibitor RNase, 5.3 μmol/L oligo-dT primer, dan 0.8
mmol/L dNTPs. Reaksi transkripsi balik dan qPCR dilakukan dalam keadaan dingin, lalu
qPCR dilakukan dengan sistem PCR real-time MyiQ2. Dengan perangkat lunak Primer 5.0,
primer dirancang dan kemudian disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, China). Kondisi
yang digunakan dalam PCR tercantum dalam tabel berikut:

Primer Gen Bank Panjang Suhu

Primers’ Sequence
s Number BP Annealing
Gtcaacctcctctctgccat (Forward)
TNFα NM_000594.4 188 59
ccaaagtagacctgcccaga (reverse)
Vatika Kamaliyyah Zahra 21/478772/KU/23211

DAFTAR PUSTAKA
Amirouche, A., Ait-Ali, D., Nouri, H., Boudrahme-Hannou, L., Tliba, S., Ghidouche, A. and
Bitam, I., 2021. TRIzol-based RNA extraction for detection protocol for SARS-CoV-2
of coronavirus disease 2019. New Microbes and New Infections, 41, p.100874.
Bayazid, A.B., Chun, E.M., Al Mijan, M., Park, S.H., Moon, S.K. and Lim, B.O., 2021.
Anthocyanins profiling of bilberry (Vaccinium myrtillus L.) extract that elucidates
antioxidant and anti-inflammatory effects. Food and Agricultural Immunology, 32(1),
pp.713-726.
Neamtu, A.A., Szoke-Kovacs, R., Mihok, E., Georgescu, C., Turcus, V., Olah, N.K., Frum,
A., Tita, O., Neamtu, C., Szoke-Kovacs, Z. and Cziaky, Z., 2020. Bilberry (Vaccinium
myrtillus L.) extracts comparative analysis regarding their phytonutrient profiles,
antioxidant capacity along with the in vivo rescue effects tested on a Drosophila
melanogaster high-sugar diet model. Antioxidants, 9(11), p.1067.
Sharma, A. and Lee, H.J., 2022. Anti-Inflammatory Activity of Bilberry (Vaccinium
myrtillus L.). Current Issues in Molecular Biology, 44(10), pp.4570-4583.
Taciak, B., Białasek, M., Braniewska, A., Sas, Z., Sawicka, P., Kiraga, Ł., Rygiel, T. and
Król, M., 2018. Evaluation of phenotypic and functional stability of RAW 264.7 cell
line through serial passages. PloS one, 13(6), p.e0198943.
Xie, Z., Wang, Y., Huang, J., Qian, N., Shen, G. and Chen, L., 2019. Anti-inflammatory
activity of polysaccharides from Phellinus linteus by regulating the NF-κB
translocation in LPS-stimulated RAW264. 7 macrophages. International journal of
biological macromolecules, 129, pp.61-67.