Deteksi cepat kompleks Mycobacterium tuberculosis dengan real-time PCR dalam sampel dahak

dan penggunaannya dalam diagnosis rutin di laboratorium referensi

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit menular dengan distribusi global, merupakan masalah
kesehatan masyarakat yang serius di Brasil. Negara Bagian Sa˜o Paulo, yang terletak di tenggara
Brasil, melaporkan 16.580 kasus TB baru pada tahun 2013. Instituto Adolfo Lutz adalah
laboratorium rujukan kesehatan masyarakat untuk diagnosis TB di seluruh Negara Bagian.
Mempertimbangkan bahwa diagnosis yang cepat dan akurat sangat penting untuk pengendalian
TB, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi penggunaan uji real-time (RT)-PCR in-
house yang menargetkan gen mpt64 dalam diagnosis rutin TB, dan untuk membandingkan teknik
ini dengan mikroskop smear dan budaya. Dari Agustus 2012 hingga Oktober 2013, 715 sampel
dahak dari 657 pasien dilibatkan dalam penelitian ini. Mikroskopi smear, kultur, identifikasi
fenotipik dan PRA-hsp65 mikobakteri, dan mpt64 RT-PCR dilakukan. Sehubungan dengan
kasus TB yang dikonfirmasi (n562/657; 9,4%), mikroskop smear memiliki sensitivitas 82,3%.
Kultur dan RT-PCR menunjukkan sensitivitas yang sama yaitu 90,3%. Spesifisitas masing-
masing adalah 99,7, 99,4 dan 98,6% untuk mikroskop smear, kultur dan RT-PCR. mpt64 RT-
PCR menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi untuk mendeteksi kompleks
Mycobacterium tuberculosis pada sampel sputum. Teknik ini dapat digunakan di laboratorium
yang tidak memiliki tes cepat untuk TB, sehingga diagnosis TB dapat dilakukan hingga 5 jam.

PENGANTAR
Terdapat w9 juta kasus baru tuberkulosis (TB) di seluruh dunia pada tahun 2013 (WHO, 2014).
Di Brasil, salah satu dari 22 negara yang bertanggung jawab atas 80% dari semua kasus TB di
dunia, w71 100 kasus baru dilaporkan pada tahun 2013 (Ministe´rio da Sau´ de, 2014). Setiap
tahun, 4000-5000 orang meninggal karena TB dalam pengaturan ini (CVE, 2012).
Negara Bagian Sa˜o Paulo terletak di tenggara Brasil dan bertanggung jawab atas 23% dari
semua kasus TB baru yang dilaporkan pada tahun 2013 (CVE, 2014). Instituto Adolfo Lutz
(IAL) adalah

Singkatan: BTA, basil tahan asam; IAL, Instituto Adolfo Lutz; LLD, batas bawah deteksi;
MTBC, kompleks Mycobacterium tuberculosis; NTM, mikobakteri non-tuberkulosis; RT, waktu
nyata; TBC, TBC.

laboratorium rujukan kesehatan masyarakat untuk diagnosis TB dan memiliki unit yang
berlokasi di 13 kota di Negara Bagian Sa˜o Paulo.
Teknik yang paling umum digunakan untuk diagnosis TB di Brazil adalah mikroskopis dan
kultur; namun, yang pertama kurang sensitif, sedangkan yang kedua bisa memakan waktu
beberapa minggu untuk memberikan hasil (de Waard & Robledo, 2007). Untuk mengatasi
masalah ini, banyak alat diagnostik molekuler telah diterapkan dalam diagnosis TB dalam
dekade terakhir, terutama real-time (RT)-PCR, memberikan hasil yang cepat dan akurat (Espy et
al., 2006).

Penggunaan RT-PCR untuk diagnosis TB telah meningkat, karena telah terbukti sangat sensitif
dan spesifik untuk mendeteksi kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) secara langsung
dalam sampel klinis atau dari isolat kultur (Garcı´a-Quintanilla et al., 2002; Miller dkk., 2002;
Broccolo dkk., 2003; Clearydkk., 2003; Armand et al., 2011; Lira et al., 2013). Banyak daerah
genom mikobakteri telah digunakan dalam diagnosis molekuler TB, seperti IS6110, 16S rRNA,
hsp65, rpoB, sdaA, devR dan mpt64 (Manjunath et al., 1991; Lachnik et al., 2002; Kim et al.,
2004; Chakravorty et al., 2005; Negi et al., 2007; Hwang et al., 2013; Nimesh et al., 2013).
mpt64 ditemukan sebagai salinan tunggal dalam genom spesies MTBC (Lee et al., 1994), dan
telah digunakan untuk diagnosis TB paru dan luar paru (Tan et al., 1995; Dar et al., 1998;
Martins et al., 2000; Bhanu et al., 2005; Therese et al., 2005; Takahashi & Nakayama, 2006; Dil-
Afroze et al., 2008; Kusum et al., 2012; Sethi et al., 2012).
Pada tahun 2014, Kementerian Kesehatan mengimplementasikan GeneXpert MTB/RIF di
beberapa kota di Brasil, sesuai dengan jumlah kasus baru yang dilaporkan. Teknologi ini telah
digunakan sebagai pengganti smear microscopy untuk mendeteksi kasus TB baru (Ministe´rio da
Sau´de, 2013). Namun, tidak semua laboratorium di Negara Bagian Sa˜o Paulo menerima sistem
ini dan yang tidak masih harus menggunakan teknik tradisional.
Mempertimbangkan prevalensi TB yang tinggi di Sa~o Paulo, penggunaan RT-PCR akan
memungkinkan diagnosis yang cepat, memutus rantai penularan dan, oleh karena itu, membantu
mengendalikan penyebaran penyakit. Mengingat hal tersebut di atas, tujuan penelitian ini adalah
untuk mengevaluasi kinerja uji RT-PCR internal untuk mendeteksi MTBC secara langsung pada
sampel dahak dari pasien dengan TB paru di tenggara Brasil. Untuk menilai penggunaan RT-
PCR dalam diagnosis rutin TB, teknik ini diterapkan sedemikian rupa sehingga alur kerja dan
metodologi diagnostik dipertahankan seperti yang direkomendasikan oleh Kementerian
Kesehatan.
METODE
Desain studi. Sampel dahak yang secara rutin dikirim ke unit IAL yang berlokasi di Kota Santo
Andre (Santo Andre IAL) untuk apusan dan kultur dimasukkan dalam penelitian. Sampel ini
diambil secara prospektif dari pasien suspek TB paru yang datang ke unit kesehatan di empat
kota di wilayah selatan Sa˜o Paulo, yaitu Diadema, Maua, Rio Grande da Serra dan Santo Andre,
antara Agustus 2012 dan Oktober 2013. Sampel ukuran (N) dihitung dengan menggunakan
rumus; N 5 Z2P(1–P)/D 2, di mana P adalah perkiraan prevalensi TB di antara kasus baru di
tempat penelitian (P58%), D adalah presisi (95% interval kepercayaan) dan Z adalah nilai dari
normal distribusi untuk kepercayaan 95% (Z51.96) (Bonita et al., 2006),

yang memberi kami ukuran sampel 707. Sebanyak 715 sampel dahak dengan volume minimal 4
ml dikumpulkan dari 657 pasien yang tidak memiliki riwayat TB sebelumnya dan dianalisis.
Data klinis, termasuk temuan radiologis dan laboratorium, juga dikumpulkan dari setiap pasien
menggunakan TB-WEB, sebuah sistem informasi dari departemen surveilans Sa˜o Paulo di mana
semua kasus TB diberitahukan dan diikuti.

definisi kasus TB. Kasus TB dianggap sebagai pasien yang memiliki satu atau lebih hasil BTA-
positif dan/atau hasil kultur positif untuk MTBC, atau pasien dengan hasil BTA dan kultur-
negatif, tetapi diberitahukan di TB-WEB.

Mikroskop apus dan kultur. Pewarnaan Ziehl-Neelsen dilakukan secara langsung pada sputum
yang belum diproses di laboratorium unit kesehatan, sesuai dengan rekomendasi dari
Kementerian Kesehatan (Ministe´rio da Sau´ de, 2008). Sampel kemudian dikirim ke Santo
Andre IAL, di mana mereka dibagi rata dalam dua alikuot: satu untuk kultur dan yang lainnya
untuk ekstraksi asam nukleat. Untuk kultur, sampel didekontaminasi dengan metode Petroff yang
dimodifikasi untuk inokulasi dalam tabung MGIT (Becton Dickinson) atau dengan metode swab
untuk inokulasi pada kemiringan Ogawa-Kudoh (Pedro et al., 2011). Tabung MGIT diinkubasi
selama 6 minggu dan kultur Ogawa-Kudoh diinkubasi selama 8 minggu. Setiap kultur positif
dilakukan pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk mengkonfirmasi keberadaan basil tahan asam (BTA)
dan pembentukan tali pusat, dan untuk menyingkirkan kontaminasi. Isolat mikobakteri
diidentifikasi dengan metode fenotipik konvensional dan dengan PRA-hsp65 (Chimara et al.,
2008). Alikuot dahak yang belum diproses untuk ekstraksi asam nukleat disimpan pada 220 uC
dan dikirim ke Sa˜o Paulo IAL.

Ekstraksi asam nukleat. Di Sa˜o Paulo IAL, sampel dahak diproses dengan 2% N-asetil-L-
sistein-natrium hidroksida (NALC-NaOH), diikuti dengan sentrifugasi pada 3000 g selama 15
menit (Ministe´rio da Sau´ de, 2008) . Sedimen disuspensikan kembali dalam 1 ml air ultra
murni dan direbus pada 100 uC selama 30 menit untuk inaktivasi mikobakteri. Sebuah alikuot
dari 25 ml lisozim pada konsentrasi 0,2 mg ml21 ditambahkan ke 200 ml sampel yang diproses,
yang diinkubasi pada 37 uC selama 30 menit. Total asam nukleat kemudian diekstraksi dan
dimurnikan dengan DNA Genomic dari Tissue kit (Macherey-Nagel), sesuai dengan instruksi
pabrik. Sebuah botol berisi 200 ml air ultra murni digunakan sebagai kontrol negatif. Asam
nukleat murni dielusi dalam 200 ml buffer elusi dan disimpan pada 220 uC sampai amplifikasi
asam nukleat.

RT-PCR untuk mpt64. Gen mpt64 (nomor aksesi GenBank NC_000962) primer dan urutan
probe dijelaskan pada Tabel 1 (Takahashi & Nakayama, 2006). Gen rnaseP manusia (nomor
aksesi GenBank NM006413) diamplifikasi secara terpisah sebagai kontrol untuk keberadaan
inhibitor PCR dan untuk memantau efisiensi ekstraksi asam nukleat (Tabel 1). Produk yang
diperkuat dideteksi dengan menggunakan probe TaqMan yang diberi label pada posisi 59 dengan
FAM dan di posisi 39 dengan BHQ1 (Tabel 1). RT-PCR dilakukan dengan sistem Roche
LightCycler 480 II (Roche Diagnostics). Volume reaksi total 25 ml digunakan untuk semua
sampel dan berisi 5 ml murni
DNA, 12,5 ml 2| TaqMan Universal Master Mix (Biosistem Terapan-
tems), 2 ml setiap primer (maju dan mundur) pada 300 nM, probe 2 ml
pada 100 nM dan 1,5 ml air tingkat PCR (Roche Diagnostics). Kondisi bersepeda adalah satu
siklus pada 50 uC selama 2 menit dan satu siklus pada 95 uC selama 10 menit diikuti dengan
PCR dua langkah (45 siklus 15 detik pada 95 uC dan 1 menit pada 60 uC). Semua sampel diuji
dalam rangkap dua, dan setiap reaksi termasuk dua sumur untuk kontrol positif (M. tuberculosis
galur referensi H37Rv, ATCC 27294), dua sumur untuk kontrol negatif ekstraksi dan pemurnian
DNA (air ultra murni) dan empat kontrol tanpa DNA (dua untuk area persiapan Master Mix dan
dua untuk area penambahan DNA). Kontrol ini digunakan untuk mengesampingkan
kemungkinan kegagalan amplifikasi atau kontaminasi silang. Hasilnya dianalisis dengan
perangkat lunak LightCycler 480 II SW versi 1.5.0 SP3 (Roche Diagnostics). Total waktu untuk
amplifikasi, deteksi, dan analisis menggunakan protokol ini adalah *110 menit untuk 30 sampel.
Pengukuran fluoresensi dilakukan pada setiap siklus. Siklus ambang
Nilai (Ct) adalah siklus di mana terjadi peningkatan fluoresensi yang signifikan dan nilai ini
dikaitkan dengan pertumbuhan eksponensial produk PCR selama fase log-linear.

Batas bawah deteksi (LLD). LLD untuk mpt64 dihitung dalam rangkap dua menggunakan DNA
H37Rv yang diekstraksi dan dimurnikan. DNA diencerkan dalam air ultra murni hingga
konsentrasi 10 ng ml21. Dari konsentrasi ini, DNA diencerkan dalam seri pengenceran 10 kali
sampai 1028 atau 0,1 fg ml21.

Interpretasi hasil. Dalam penelitian ini, cut-off untuk hasil positif dan negatif ditentukan
berdasarkan nilai Ct. Sampel dengan Ctj36 dianggap positif untuk mpt64. Tidak ada sampel yang
tidak meyakinkan karena semua sampel yang memiliki Ctw36 adalah BTA dan kultur negatif,
dan pasien ini tidak diberitahukan di TB-WEB. Untuk rnaseP, semua sampel dengan Ctj42
dianggap positif dan juga tidak ada hasil yang tidak meyakinkan. Sampel dengan Ct50 atau w36
untuk mpt64 dan Ct50 atau w42 untuk rnaseP dianggap negatif.
Studi ini disetujui oleh dewan etik IAL (nomor protokol 79574/2012).

Table 1. Primer and probe sequences and final concentrations used in RT-PCR for detection of M. tuberculosis

Gene target Primers and probes Sequence (59R39) Final concentration Tm (8C) Amplicon length
(nM) (bp)
mpt64 Forward primer GTGAACTGAGCAAGCAGACCG 300 60 76
Reverse primer GTTCTGATAATTCACCGGGTCC 300
TaqMan Probe* FAM-TATCGATAGCGCCGAATGCCGG-BHQ1 100
rnaseP Forward primer AGATTTGGACCTGCGAGCG 300 60 65
Reverse primer GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 300
TaqMan Probe* FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1 100

*Probe 59-end-labelled with FAM (6-carboxyfluorescein) and 39-end-labelled with BHQ1 (Black Hole Quencher 1).

HASIL
Ada 62 (9,4%) kasus TB baru yang dikonfirmasi, baik secara bakteriologis atau dengan
pemberitahuan pasien di TB-WEB, di antara 657 pasien dengan suspek TB. Masing-masing dari
62 kasus TB hanya memiliki satu sampel yang disertakan dalam penelitian. Dari 715 sampel
yang dianalisis, 53 (7,4%) adalah BTA-positif; 60 (8,4%) kultur positif untuk mikobakteri, 610
(85,3%) kultur negatif dan 45 (6,3%) kultur terkontaminasi. Lima puluh enam (93,3%) dari 60
kultur positif diidentifikasi sebagai MTBC, satu (1,7%) sebagai Mycobacterium intracellulare,
satu (1,7%) sebagai Mycobacterium kansasii dan dua (3,3%) sebagai milik kelompok
achromogen rapid petani.
LLD untuk pengujian ditentukan menjadi 2 pg untuk
gen mpt64, dengan Ct minimum 19 dan maksimum
36. Reaksi memiliki efisiensi 94,6% dengan kemiringan 23,4. Untuk hasil yang akurat, reaksi
harus memiliki efisiensi mendekati 100%, yang setara dengan kemiringan 23,32 dan berarti
produk RT-PCR berlipat ganda pada setiap siklus.
Dari 715 sampel yang dianalisis, 650 (90,9%) negatif dan 65 (9,1%) positif untuk gen mpt64
dengan RT-PCR. Amplifikasi rnaseP terjadi di semua 715 sampel, artinya tidak ada inhibitor
PCR dalam sampel yang negatif untuk mpt64.
Tabel 2 menunjukkan sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif, nilai prediksi negatif dan
akurasi mikroskopis BTA, kultur dan RT-PCR menurut kasus TB yang dikonfirmasi. Mikroskop
apus mendeteksi 51 dari 62 kasus TB (sensitivitas 82,3%), sedangkan kultur dan RT-PCR
mendeteksi 56 kasus, menunjukkan sensitivitas yang sama sebesar 90,3%. Nilai spesifisitas
adalah 99,7, 99,4 dan 98,6% untuk mikroskop smear, budaya dan RT-PCR, masing-masing.
Semua sampel dengan isolasi non-TB mycobacteria (NTM) negatif untuk gen mpt64,
menunjukkan bahwa target ini spesifik untuk MTBC.
Dari 51 kasus TB yang terdeteksi dengan mikroskop smear, 47 dikonfirmasi dengan biakan dan
49 positif untuk mpt64 (masing-masing sensitivitas 92,2 dan 96,1%). Dari 11 kasus TB BTA-
negatif, sembilan dikonfirmasi dengan kultur dan tujuh positif untuk mpt64 dengan RT-PCR
(masing-masing 81,8 dan 63,6% sensitivitas).
Dua kasus TB terdeteksi hanya dengan RT-PCR – satu BTA dan biakan negatif, dan yang
lainnya BTA negatif dan terkontaminasi biakan. Salah satu pasien ini memulai pengobatan hanya
4 bulan setelah tanggal pengumpulan dahak.

Table 2. Results of smear microscopy, culture and RT-PCR according to confirmed TB cases

Method Result Total samples (n5715) Sensitivity Specificity Positive Negative Accuracy
(%) (%) predictive value predictive value (%)
(%) (%)
TB diagnosis No TB
(n562)* diagnosis
(n5653)
Smear microscopy Positive 51 2D 82.3 99.7 96.2 98.3 98.2
Negative 11 651
Culture Positive 56 4d 90.3 99.4 93.3 99.1 98.6
Negative/ 6§ 649"
contaminated
mpt64 RT-PCR Positive 56 9 90.3 98.6 86.2 99.1 97.9
Negative 6 644d

*The final diagnosis of TB was based on the results of smear microscopy, culture, clinical and radiological findings.

DOne sample had an isolate identified as M. intracellulare and was negative for mpt64.

dAll were non-TB mycobacteria isolates: one M. intracellulare, one M. kansasii and two achromogen rapid growers, and did not
show amplification for mpt64.

§Two samples were confirmed for TB by RT-PCR.

"43 samples were contaminated in culture.

DISKUSI
Teknik tradisional untuk diagnosis bakteriologis TB didasarkan pada visualisasi AFB dalam
spesimen klinis dengan mikroskop dan menumbuhkan mikroorganisme ini dalam biakan untuk
identifikasi selanjutnya. Di Brazil, mikroskop sputum smear adalah teknik yang paling umum
digunakan untuk diagnosis TB paru, karena sederhana, cepat dan murah, meskipun
sensitivitasnya rendah (60-70%) (WHO, 2002). Kultur, yang merupakan standar emas, tetapi
dapat memakan waktu beberapa minggu untuk memberikan hasil, dilakukan pada kasus berikut:
BTA negatif berulang, BTA positif pada bulan kedua pengobatan, kecurigaan TB ekstra paru,
kecurigaan mikobakteriosis, kontak dengan TB yang resistan terhadap berbagai obat, pasien
dengan riwayat pengobatan sebelumnya, pasien imunosupresi, imigran, pasien pribumi dan
populasi dengan risiko infeksi TB yang lebih tinggi (tahanan, tuna wisma, pasien rawat inap)
(Ministe´rio da Sau´ de, 2011).
Dalam penelitian ini, kultur dan RT-PCR mendeteksi jumlah kasus TB yang dikonfirmasi lebih
tinggi dibandingkan dengan mikroskop, seperti yang juga ditemukan oleh Sethi et al. (2012) dan
Nimesh et al. (2013). Selain itu, RT-PCR menunjukkan spesifisitas yang tinggi, seperti yang
ditemukan oleh Broccolo et al. (2003) dan Armand et al. (2011). Sensitivitas tinggi dari
mikroskop yang kami temui dapat disebabkan oleh fakta bahwa hanya sampel sputum minimal 4
ml yang dimasukkan dalam penelitian kami, mendukung deteksi BTA. Juga, spesifisitas yang
tinggi dari teknik ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa hanya satu dari empat sampel dengan
isolasi NTM yang BTA-positif.
Telah didokumentasikan dengan baik bahwa metode molekuler menunjukkan sensitivitas yang
baik pada sampel BTA-positif, tetapi kurang sensitif pada sampel pausibasiler (Greco et al.,
2006; Armand et al., 2011). Kami menemukan sensitivitas RT-PCR pada sampel BTA-positif
dan negatif masing-masing sebesar 96,1 dan 63,6%. Armand dkk. (2011) melaporkan temuan
serupa dengan GeneXpert MTB/RIF dan RT-PCR internal untuk IS6110.
Hasil negatif palsu pada uji molekuler dapat dijelaskan dengan rendahnya jumlah mikobakteri,
adanya inhibitor polimerase, dan distribusi basil yang tidak merata pada

sampel paucibacillary (Reischl et al., 1998). Ada enam sampel negatif palsu dengan RT-PCR
dalam penelitian kami, empat di antaranya BTA-negatif, dua memiliki satu hingga sembilan
BTA dan hanya satu yang negatif dalam kultur. Ada kemungkinan bahwa DNA mikobakteri
hilang selama alikuot sputum di Santo Andre IAL atau pra-perawatan untuk ekstraksi DNA.
Studi lain juga melaporkan hasil negatif palsu oleh RT-PCR pada sampel paucibacillary (Miller
et al., 2002; Cleary et al., 2003; Lira et al., 2013). Para penulis ini mengamati hubungan
berbanding terbalik antara nilai Ct dan jumlah AFB yang terdeteksi dalam mikroskop, seperti
yang juga ditemui dalam penelitian kami (data tidak ditampilkan).
Menurut Garcı´a-Quintanilla et al. (2002), kehilangan sensitivitas PCR mungkin karena deteksi
gen salinan tunggal, seperti kasus mpt64 (Lee et al., 1994). Dalam penelitian ini, kami menguji
hipotesis kemungkinan mutasi di tempat di mana primer dan probe berhibridisasi. Dengan
demikian, kami melakukan RT-PCR dari isolat yang tersedia dari lima sampel negatif palsu
(karena salah satunya adalah kultur negatif) dan semuanya positif untuk mpt64, sehingga
membuang hipotesis ini.
Uji mpt64 RT-PCR mendeteksi MTBC dalam dua sampel dari pasien yang tes konvensionalnya
(smear dan kultur) negatif/terkontaminasi, tetapi didiagnosis dengan TB berdasarkan temuan
klinis/radiologis. Hal ini mengakibatkan keterlambatan pemberitahuan dari salah satu pasien ini,
menunda dimulainya pengobatan dan meningkatkan kemungkinan penularan.
Lima dari sembilan sampel yang positif palsu dengan RT-PCR menunjukkan nilai Ct 35-36,
yang sangat dekat dengan Ct maksimum yang diperoleh dalam deteksi LLD hingga mpt64.
Gomez dkk. (2011) juga melaporkan hasil positif PCR pada sampel dahak dari pasien tanpa TB.
Mereka berpendapat bahwa pasien ini mungkin pausibasiler, atau mungkin ada kontaminasi
silang selama pengambilan sputum atau prosedur laboratorium. Sampel yang dianalisis dalam
penelitian ini dikumpulkan di banyak fasilitas kesehatan dari empat kotamadya di Negara Bagian
Sa˜o Paulo dan dengan demikian kami tidak dapat menjamin bahwa semua langkah
pengumpulan dahak dilakukan secara memadai untuk menghindari kontaminasi silang. Adapun
prosedur laboratorium, alur kerja searah, dan area terpisah digunakan untuk kultur, ekstraksi
DNA, persiapan reagen RT-PCR dan penambahan sampel ke pelat reaksi.
Tak satu pun dari empat sampel dengan isolasi NTM positif untuk mpt64, menunjukkan
spesifisitas target ini untuk deteksi MTBC, seperti yang dilaporkan oleh Takahashi & Nakayama
(2006), Kusum et al. (2012), Sethi et al. (2012) dan Nimesh et al. (2013). Semua pasien yang
terinfeksi NTM diberitahukan dan diobati untuk TB. Satu mengalami perubahan diagnosis
setelah 6 bulan pengobatan, yang lain sudah pernah diobati sebelumnya dan dua sisanya masih
dalam pengobatan TB. Dalam kasus ini, RT-PCR Tujuan penelitian kami adalah untuk
mengevaluasi penerapan uji RT-PCR internal dalam diagnosis rutin TB di laboratorium rujukan,
tanpa perubahan alur kerja dan teknik yang direkomendasikan oleh Kementerian Kesehatan.
Pengecualian sampel sputum v4 ml merupakan keterbatasan penelitian kami, karena sampel ini
adalah sampel yang paling sering diterima oleh laboratorium. Karena kultur dan ekstraksi DNA
dilakukan di dua laboratorium yang berbeda, kami harus menyertakan sampel dengan volume
yang lebih besar, sehingga dapat dipisah.
Selain itu, metode yang paling umum digunakan untuk pengobatan sputum dalam diagnosis rutin
di Brasil adalah swab Petroff dan Kudoh yang dimodifikasi, yang tidak direkomendasikan untuk
pra-perawatan sampel untuk ekstraksi DNA. Ini adalah alasan lain mengapa kami menyertakan
sampel dengan volume yang lebih besar.
Teknik RT-PCR in-house yang dievaluasi dalam penelitian ini, yang menunjukkan sensitivitas
yang sama dengan metode kultur standar emas, dapat diimplementasikan dalam laboratorium
rutin diagnostik di negara-negara dengan insiden TB yang tinggi, seperti Brasil, tetapi tidak
memiliki tes cepat untuk diagnosis TB. Dari sampel dahak yang didekontaminasi untuk apusan
dan biakan, sebagian akan dipisahkan untuk pengujian RT-PCR. Hasilnya akan tersedia pada
hari yang sama dengan kedatangan sampel di laboratorium, menunjukkan keuntungan yang
relevan dalam waktu diagnosis dibandingkan dengan biakan. Dengan demikian, laboratorium ini
juga dapat mengandalkan alat untuk diagnosis cepat TB yang akan digunakan bersama dengan
mikroskopi smear.