1.

Review jurnal internasional

Penilaian Patogen Bakteri Bawaan Makanan pada Susu Mentah Kerbau
Menggunakan Polymerase Chain Reaction Based Assay
A. Pendahuluan
Menurut Organisasi Kesehata Dunia atau World Health Organization ( WHO)
merupakan penyakit bawaan makan yang menyebabkan 420.000 kematian di dunia
setiap tahun ( Guldimann and johler, 2018). Pusat pengendalian dan pencegahan atau
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Telah melaporkan ~73.000 kasus
tahunan penyakit bawaan makanan pada tahun 2013 yang mengarah ke rawat inap
4.200 pasien dan 80 kematian di Amerika Serikat. Prevalensi tinggi penyakit bawaan
makanan juga telah dilaporkan oleh WHO di berbagai negara berkembang ( Zeng et
al,2018). Susu dikonsumsi sebagai minuman yang bergizi. Namun, konidisi
pengolahan susu yang tidak higiensis membuat rentan terhadap gangguan kesehatan
pada manusia. Sifat susu yang sangat bergizi mempercepat pertumbuhan mikroba.
Faktor-faktor seperti infeksi kelenjar susu dan praktik higienitas yang buruk, termasuk
wadah penyimpanan susu yang tidak steril, cara mencuci tangan yang tidak tepat dan
batuk, dapat mengakibatkan kontaminasi susu. (Regasa et al, 2019).
Insiden penyakit bawaan makanan tinggi di negara berkembang (Zeng et al, 2018).
Selama dekade terakhir, prevalensi patogen penyebab penyakit pada susu dan produk
susu berkisar antara 2,0% dan 11,9% di India (Kaushik et al, 2014; Singh et al, 2018;
Sudhanthirakodi et al, 2016). Masalah keamanan pangan telah mendapatkan perhatian
publik yang signifikan selama dua dekade terakhir. Industri makanan sekarang
memberlakukan peraturan ketat untuk membatasi keberadaan patogen bawaan
makanan di berbagai makanan. Prevalensi Salmonella, L. monocytogenes, dan S.
aureus tidak diperbolehkan per 25 mL sampel susu (FSSAI, 2011). Signifikansi
patogen bawaan makanan ini terhadap keamanan pangan dan kesehatan masyarakat
menuntut pengembangan metode deteksi yang sensitif, akurat, dan cepat untuk
identifikasi mereka dalam matriks makanan yang kompleks, termasuk susu.
Metode kultur konvensional banyak digunakan untuk mendeteksi mikroba bawaan
makanan. Namun, metode ini lambat (3-5 hari) dan melelahkan terutama bila hasilnya
sangat dibutuhkan. Oleh karena itu, teknik polymerase chain reaction (PCR)
digunakan di seluruh dunia untuk mendeteksi bakteri patogen target. Karena
sensitivitas dan spesifisitasnya yang tinggi, PCR memiliki Ger dengan cepat muncul
sebagai teknik utama untuk identifikasi patogen protoc bawaan makanan. Multiplex-
PCR (m-PCR) dapat lebih lanjut Russel memanfaatkan berbagai primer terdegenerasi
untuk amplifikasi simultan beberapa gen target selama reaksi tunggal Salmotion. m-
PCR dapat dengan cepat mendeteksi mikroorganisme patogen untuk mengurangi
beban kerja dan menghemat waktu dibandingkan dengan uniplex-PCR To det (u-
PCR) (Ding et al, 2017).
B. Bahan dan metode
Pengumpulan sampel makanan
Empat ratus lima puluh sampel susu mentah kerbau dikumpulkan oleh Hayashi dari
peternakan sapi perah lokal dan pasar eceran toko makanan susu di Bareilly, Uttar
Pradesh, India menurut Andrews dan Hammack (2003). Semua sampel dikumpulkan
secara aseptis dari ember susu dalam botol togen kaca steril bertutup ulir (50 mL) dan
ditempatkan dalam kotak es untuk dipindahkan ke laboratorium tanpa paparan sinar
matahari langsung. Metode kultur konvensional seperti yang dijelaskan oleh Hitchins
et al (2003), nd (Wai Amaguaña et al (1998), dan Bennett dan Lancette (1998)
dimulai pada hari yang sama untuk identifikasi bakteri target
Isolasi dan identifikasi kultur bakteri target ang berkembang susu mentah
Bakteri target diisolasi dengan mengikuti metode standar USFDA/BAM/CFSAN
(Hitchins et al, 2003). Uji biokimia berdasarkan pemanfaatan karbohidrat, urease,
sitrat, produksi H,S pada agar miring triple sugar iron (TSI), uji lisin dekarboksilase,
dan uji IMVIC lebih lanjut mengkonfirmasi dugaan isolat Salmonella (Andrews dan
Hammack, 2003). Koloni cembung berwarna abu-abu kehitaman yang dikelilingi oleh
zona bening dianggap S. aureus pada agar Baird Parker (HiMedia, India). Untuk
mengkonfirmasi S. aureus, uji biokimia menggunakan glukosa, oksidase, katalase,
manitol, koagulase, pertumbuhan 10% NaCl, dan DNAse dilakukan menurut metode
USFDA/-BAM/CFSAN seperti yang dilaporkan oleh Bennett dan Lancette 1998.
Semua bakteri yang diisolasi dipertahankan pada kaldu BHI dan disimpan dengan
20% gliserol pada -20°C.
Identifikasi bakteri patogen dengan u-PCR
Ekstraksi DNA genom, protokol ekstraksi phenol chloroform diikuti untuk ekstraksi
DNA ( sambrook dan Russel, 2001). Amplifikasi gen hlyA, invA dan oriC dan nuc
dari cetakan DNA bakteri L. monocytogenes, Salmonella, dan S. aureus: Rincian
primer yang digunakan untuk deteksi bakteri patogen digambarkan pada Tabel 1. -
PCR mendeteksi L. monocytogenes, gen hlyA (234 bp) diamplifikasi menggunakan
primer PCR (Furrer et al, 1991). PCR cy- atau kondisi cling disediakan di Tabel
Tambahan S2. (Sal- Referensi/kultur standar L. monocytogenes (MTCC nulta 657)
berfungsi sebagai kontrol positif, sedangkan Listeria ivanovii ssays (NCTC 11846),
Listeria innocua (NCTC 11288), S. aureus uanti- (MTCC 1145), Rhodococcus equi
(MTCC 1135), Bacillus subtilis (MTCC 121), Shigella sp. (SM-07), Citrobacter sp.
(EN-06), dan Escherichia coli (MTCC 443) berfungsi sebagai kontrol patogen negatif
yang digambarkan pada Tabel 2.
gen invA dan oriC diamplifikasi untuk deteksi Salmonella seperti yang dijelaskan
oleh Cocolin et al (1998) dan Widjojoatmodjo et al (1991); Kondisi bersepeda PCR
disediakan dalam Tabel 2. Referensi/kultur standar Salmonella typhimurium (MTCC
98) dan Salmonella enteritidis (E2094) berfungsi sebagai kontrol positif, sedangkan E.
coli (MTCC 443), S. aureus (MTCC 1145), B. subtilis (MTCC 121), Shigella sp.
(SM-07), Citrobacter sp. (EN-06), pelet dan Campylobacter jejuni (NCTC 11168)
berfungsi sebagai kontrol negatif yang digambarkan dalam Tabel Tambahan S4.
S. aureus dideteksi dengan mengamplifikasi gen nuc lisat (270 bp) menggunakan
primer PCR .Brakstad et al pernata (1992).
Kondisi siklus PCR disediakan dalam Tabel 2. Referensi/kultur standar S. aureus
(MTCC 1145) digunakan sebagai kontrol positif, sedangkan S. epidermidis (MTCC
435), L. monocytogenes (MTCC 657), dan R. equi (MTCC 1135), B. subtilis (MTCC
121), Shigella Multiple sp. (SM-07), Citrobacter sp. (EN-06), dan kultur C. jejuni
(NCTC 11168) berfungsi sebagai kontrol negatif untuk menguji spesifisitas PCR
(Tambahan Tabel S4). Produk PCR masing-masing dipisahkan melalui elektroforesis
gel agarosa (1,5%), phimuri diwarnai dengan etidium bromida (Sigma-Aldrich), dan
divisualisasikan di bawah sinar ultraviolet (UV)
Sensitivitas u-PCR untuk menentukan batas deteksi spesifik pada sampel susu yang
dibubuhi (diinokulasi secara artifisial). Met- (odologi NCTC dari Alarcón et al
(2004). dengan sedikit modifikasi. untuk menyiapkan sampel susu mentah yang
diinokulasi untuk Hasil positif palsu dapat diperoleh dari populasi bakteri Tabel S4
asli lainnya yang ada dalam susu mentah. Untuk tujuan itu uji elektroph u-PCR
diperiksa spesifisitasnya, menggunakan patogen bakteri yang berbeda yang tercantum
dalam Tabel 4. Setiap aliquot diperiksa untuk keberadaan bakteri spesifik sebagai
negpatogen menggunakan metode kultur juga. Kultur bakteri sebanyak 1,0 mL
ditebarkan pada masing-masing media padat selektif menggunakan metode spread
plate untuk memeriksa koloni-koloni bakteri
DNA dari sampel berduri diekstraksi dengan metode lisis panas (Arora et al, 2006).
Awalnya, sampel berduri Sal- (100 µL) disentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit.
Pelet kemudian disuspensikan kembali dalam 100 µL dalam tabung microcentrifuge
steril, dan prosedur yang sama diulang tiga kali. Hasilnya benar-benar dilarutkan
dalam garam gatif buffer fosfat dan diberi perlakuan panas selama 10 menit dalam
penangas air mendidih diikuti dengan perlakuan es segera selama 10 menit. Lisat gen
sel yang diperoleh disentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit, dan supernatan
dikumpulkan dalam tabung baru untuk digunakan sebagai cetakan apel PCR. Produk
PCR dikenakan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v), dan alikuot yang tidak
diinokulasi berfungsi sebagai kontrol
Multiplex-PCR
Uji m-PCR dilakukan untuk amplifikasi produk masing-masing gen L.
monocytogenes (hlyA, 234 bp), S. ty- (1,5%), phimurium (oriC, 163 bp), dan S.
aureus (nuc, 270 bp) sesuai dengan Alarcón et al (2004). Kondisi bersepeda PCR
disediakan dalam Tabel 3 . L. monocytogenes (MTCC 657), S. typhimurium (MTCC
98), dan S. aureus (MTCC 1145) berfungsi sebagai kontrol positif untuk menguji
spesifisitas deteksi PCR, sedangkan L. ivanovii (NCTC 11846), L. innocua e meth -
(NCTC 11288), E. coli (MTCC 443), B. subtilis (MTCC 121), Shigella sp. (SM-06),
Citrobacter sp. (EN-06), C. jejuni s for de- (NCTC 11168), S. epidermidis (MTCC
435), dan R. equi (MTCC 1135) berfungsi sebagai kontrol negatif (Tambahan
ligenous Tabel S4). Produk PCR dipisahkan melalui elektroforesis tujuan gel agarosa
(1,5%), diwarnai dengan etidium bromida berbeda (Sigma-Aldrich), dan
divisualisasikan di bawah sinar UV. Produk PCR 564. Setiap hasil disimpan pada
suhu -20°C sampai analisis lebih lanjut.

Sensitivitas Sensitivitas m-PCR untuk menentukan batas deteksi pada sampel

susu yang dibubuhi (diinokulasi secara artifisial)
Metodologi Alarcón et al (2004) dengan sedikit modifikasi untuk menyiapkan sampel
susu mentah yang diinokulasi untuk menentukan sensitivitas uji m-PCR. Hasil positif
palsu dapat diperoleh dari populasi bakteri asli lainnya yang ada dalam susu mentah.
Untuk tujuan itu uji m-PCR diperiksa spesifisitasnya, menggunakan berbagai bakteri
patogen yang tercantum dalam Tabel 4. Setiap alikuot diperiksa untuk keberadaan
bakteri spesifik patogen menggunakan metode kultur juga. Kultur bakteri alensi 1,0
mL disebarkan pada masing-masing garis padat selektif dengan media menggunakan
metode pelat sebar untuk memeriksa laporan bakteri koloni. Maroko Metode lisis
 panas Arora et al (2006) diikuti Latvia untuk ekstraksi DNA dari sampel berduri
seperti yang disebutkan (Akran di atas).

C. Hasil dan pembahasan

Penentuan spesifisitas u-PCR untuk target patogen bakteri primer

spesifik digunakan untuk memverifikasi spesifisitas uji u-PCR patogen terhadap
organisme bakteri yang berbeda seperti yang ditunjukkan pada Gambar diatas .
Hasilnya menunjukkan bahwa pasangan primer untuk organisme target yang sesuai.
patogen Produk amplifikasi PCR spesifik dicapai untuk masing-masing patogen
bakteri El-Baz. Produk nonspesifik tidak diamati dalam uji u-PCR apa pun. Demikian
pula, uji m-PCR dari proses L. ivanovii (NCTC 11846), L innocua (NCTC 11288) , E.
coli (MTCC 443), dan R. equi (MTCC 1135) hanya menghasilkan pita spesifik
patogen pada gambar dibawah ( table 2).
Prevalensi L. monocytogenes, Salmonella spp., dan S. aureus pada sampel susu
mentah
Prevalensi berbagai bakteri patogen dalam susu mentah digambarkan Tabel 2.
Prevalensi S. aureus tercatat tertinggi sebesar 14,2% (n=57/400) di antara semua
bakteri sebagai patogen emas diikuti oleh Salmonella spp., 4,0% ( n=16/400)

Kehadiran bakteri patogen dalam susu mentah dapat dikaitkan dengan lingkungan
peternakan sapi perah dan toko susu yang tercemar. Penanganan sebelum dan sesudah
susu mentah yang tidak memuaskan dan pembersihan yang tidak memadai semakin
memudahkan penyebaran patogen. Invasi patogen dan kota patogenisitas terkait racun
dari bakteri terkait susu mentah dapat menimbulkan bahaya kesehatan yang serius
bagi konsumen. Beberapa penelitian juga menjelaskan bahwa kontak langsung dapat
mentransfer anisme bakteri. patogen pada penangan susu melalui rute fecal-oral atau
masing-masing (El-Baz et al, 2017). Tingkat prevalensi patogen berbeda yang
ditemukan selama penelitian ini mungkin disebabkan oleh pemrosesan anovii susu
yang tidak higienis dan sanitasi hewan yang mahal, peternakan sapi perah, MTCC,
dan toko susu (Sonnier et al, 2018). Temuan ini menganjurkan nogen- ketidaksadaran
penangan susu dengan pedoman dasar pengumpulan susu mentah.
Evaluasi batas deteksi u-PCR dan m-PCR dibandingkan dengan metode kultur
bakteri pada sampel susu yang diinokulasi secara artifisial
(Tabel 3). Batas deteksi (LOD) dari metode mengungkapkan hasil yang
hampir sama untuk setiap patogen saat mendeteksi melalui metode kultur (Tabel 4).
Metode kultur dari setiap patogen menunjukkan LOD sebagai 105, 102, Alarcó dan 10
sel/mL setelah 12, 18, dan 24 jam. Metode kultur tidak dapat mendeteksi LOD pada 6
jam (Tabel 4). Sensitivitas dan efisiensi uji PCR juga dievaluasi selama studi sitogen
ini dibandingkan dengan metode kultur konvensional

Tes PCR berhasil mendeteksi patogen bahkan pada (Tabel 3). u-PCR dan m-
PCR mendemonstrasikan LOD sebagai 107, 106, 102, dan 10 sel/mL setelah 0, 6, 12,
18, dan 24 jam pengayaan untuk setiap patogen pada table 3 dan 4 . Metode kultur
tidak dapat menghasilkan hasil ekstraksi spesifik dengan 108, 107, 106, 105, dan 104
sel/mL setelah 6 jam, int DNA yang berkurang menjadi 10 4-10³ sel/mL setelah 12
jam. Di sisi lain, u-PCR dan m-PCR menunjukkan hasil ini sebagai 105 kation o dan
10 sel/mL setelah 6 jam. Tidak ada hasil positif palsu (L. mon diperoleh selama uji u-
PCR diperiksa spesifisitasnya menggunakan patogen bakteri berbeda yang berhasil.
Keunggulan teknik PCR dibandingkan kultur dari metode deteksi patogen dari
sampel susu sel yang diinokulasi secara artifisial telah didokumentasikan. Kultur
bakteri dalam media yang mengandung antibiotik propo dengan pertumbuhan bakteri
yang berkurang secara signifikan dan produksi senyawa biokimia yang lebih rendah
sangat sulit dideteksi melalui teknik kontrol konvensional (Gebretsadik et al, 2011;
Karmakar paratu et al, 2016; Percival et al, 2004; Priyanka et al, 2016; Vidic ments et
al, 2019)
Identifikasi yang cepat dan simultan dari beberapa patogen dalam produk
makanan dapat secara signifikan memastikan keamanan makanan. Oleh karena itu, m-
PCR banyak digunakan untuk deteksi mikroba. Itu bisa secara bersamaan mendeteksi
 beberapa patogen dalam satu -PCR PCR. Standarisasi dan optimalisasi protokol m-
PCR adalah proses yang rumit, tetapi setelah ditetapkan, ini merupakan teknik yang
relatif murah dan cepat untuk deteksi mikroba. Kombinasi yang berbeda dari patogen
bawaan makanan telah dideteksi secara efisien menggunakan m-PCR, yang meliputi
E. coli O157:H7, L. monocytogenes. Salmonella spp., S. aureus, dan Vibrio cholerae
(Chen et al, 2012), L. monocytogenes, S. aureus, dan Salmonella spp. (Ding et al.
2017).

2. Jelaskan dengan menggunakan konsep 5W +1H mengenai DNA dan Protein

=
peran utama DNA pada makhluk hidup? Peran utama DNA yaitu membawa
informasi genetik yang akan membentuk sifat spesifik dari suatu makhluk hidup
seperti warna rambut cokelat, golongan darah, warna kulit, bentuk gigi dan lain-
lain.  Kenapa DNA berperan membawa dan menyimpan informasi genetik? karena
setiap individup mewariskan genetik tiap keturunannya.Bagaimana bentuk
struktur DNA? Struktur DNA berbentuk seperti untai ganda yang saling berpilin
atau yang dikenal dengan sebutan  double helix (Campbel, et al,  2008) (gambar
1). Pemahaman bentuk struktur DNA berupa double helix  ditemukan pada tahun
1953 oleh ilmuwan asal Amerika, yang bernama Watson dan Crick  (Campbel, et
al,  2008). Kedua ilmuwan tersebut juga menjelaskan bahwa struktur double
helix tersusun atas anak tangga dan ibu tangga. Dimana, ibu tangga berupa
gula deoksiribosa dan fosfat, sedangkan anak tangganya berupa susunan basa-
basa nitrogen.
protein merupakan makromolekul yang menyusun lebih dari 50% massa kering
sebagian sel tubuh. Jika dilihat dari penyusunnya, secara umum protein tersusun
atas kumpulan kombinasi dari asam amino Bagaimanakah fungsi protein?
Protein memiliki peranan sangat penting bagi makhluk hidup. Berbagai fungsi
protein diantaranya yaitu sebagai katalis dalam mempercepat suatu reaksi
(seperti enzim), sebagai penyokong struktural (seperti kolagen), sebagai
 penyimpanan (seperti putih telur), sebagai transport (seperti hemoglobin),
sebagai komunikasi seluler (seperti hormon), sebagai reseptor, untuk bergerak
(seperti aktin dan miosin), dan sebagai pertahanan dari pathogen (seperti
antibodi). Jadi dapat disimpulkan bahwa DNA memiliki keterkaitan dengan
protein. Dimana DNA yang mengnadung informasi genetik ditranslasikan atau
disampaikan informasi tersebut dalam bentuk protein. Sehingga bentuk protein
menyesuaikan informasi genetik dari DNA. Protein-protein inilah yang berperan
dalam kelangsungan hidup dari suatu organisme.
3. Carilah artikel mengenail kasus keracunan pangan yang disebabkan oleh bakteri
patogen yang ada di dunia. Dan beri tanggapan!
=
https://jurnal.dpr.go.id/index.php/aspirasi/article/download/1523/pdf

Tanggapan saya terhadap artikel tersebut adalah dengan menyelenggarakan keamanan

pangan untuk melindungi masyarakat sebagai konsumen adalah hal yang patut diajukan
karena pangan tidak aman jika memiliki potensi bahaya bagi masyarakat dan faktor faktor
yang memicu terkontaminasi bahan pangan sebaiknya di jauhkan contohnya seperti Simpan
makanan pada suhu yang aman, Lakukan proses pemanasan makan dalam suhu yang benar-
benar panas sebelum dikonsumsi agar mikroorganisme tidak tumbuh dan berkembang biak
dengan cepat, Gunakan air dan bahan baku yang aman yaitu yang tidak berwarna dan tak
berbau., Menjaga kebersihan. Mencuci tangan dengan menggunakan sabun dan air bersih
sebelum memasak atau menyediakan pangan. Agar masyarakat dapat mengkonsumsi bahan
pangan dengan baik.