Meskipun telah dibuktikan bahwa data sekuens gen 16S rRNA pada strain individu dengan tetangga

terdekat menunjukkan skor kesamaan <97% mewakili spesies baru, arti skor kesamaan> 97% tidak
begitu jelas (13). Nilai terakhir ini dapat mewakili spesies baru atau, sebagai alternatif, menunjukkan
pengelompokan dalam takson yang telah ditentukan sebelumnya. Studi hibridisasi DNA-DNA secara
tradisional diperlukan untuk memberikan jawaban pasti untuk pertanyaan semacam itu. Sedangkan data
urutan gen 16S rRNA dapat digunakan untuk berbagai tujuan, tidak seperti hibridisasi DNA (> 70%
reassociation) tidak ada "nilai ambang" yang ditentukan (misalnya, 98,5% kesamaan) di atasnya ada
kesepakatan universal tentang apa yang merupakan definitif dan identifikasi konklusif untuk peringkat
spesies.

Bakteri tak teridentifikasi atau isolat dengan profil ambigu. Salah satu penggunaan potensial yang paling
menarik dari informatika sekuens gen 16S rRNA adalah untuk menyediakan identifikasi genus dan
spesies untuk isolat yang tidak sesuai dengan profil biokimia yang dikenali, untuk strain yang hanya
menghasilkan “kemungkinan rendah” atau “ identifikasi yang dapat diterima menurut sistem komersial,
atau untuk taksa yang jarang dikaitkan dengan penyakit menular manusia. Hasil kumulatif dari sejumlah
penelitian hingga saat ini menunjukkan bahwa sekuensing gen 16S rRNA memberikan identifikasi genus
dalam banyak kasus (> 90%) tetapi kurang begitu untuk spesies (65 hingga 83%), dengan dari 1 hingga
14% isolat tetap tidak teridentifikasi setelah pengujian (5, 11, 17). Kesulitan yang dihadapi dalam
memperoleh genus dan identifikasi spesies termasuk pengenalan taksa baru, terlalu sedikit urutan yang
disimpan dalam database nukleotida, spesies yang berbagi urutan 16S rRNA serupa dan / atau identik,
atau masalah tata nama yang timbul dari beberapa genomovar yang ditetapkan untuk spesies tunggal
atau kompleks.

Analisis sekuens gen 16S rRNA dapat lebih baik mengidentifikasi strain yang dideskripsikan dengan
buruk, jarang diisolasi, atau secara fenotip menyimpang, dapat secara rutin digunakan untuk identifikasi
mikobakteri, dan dapat mengarah pada pengenalan patogen baru dan bakteri nonkultur. Masalah tetap
ada bahwa urutan di beberapa database tidak akurat, tidak ada definisi kuantitatif konsensus dari genus
atau spesies berdasarkan data urutan gen 16S rRNA, perkembangbiakan nama spesies berdasarkan
perbedaan genetik dan fenotip yang minimal menimbulkan kesulitan komunikasi, dan
mikroheterogenitas dalam Urutan gen 16S rRNA dalam suatu spesies adalah umum. Terlepas dari
keakuratannya, analisis urutan gen 16S rRNA kurang digunakan secara luas di luar laboratorium besar
dan referensi karena pertimbangan teknis dan biaya. Dengan demikian, tantangan masa depan adalah
menerjemahkan informasi dari sekuensing gen 16S rRNA menjadi skema pengujian biokimia yang
mudah digunakan, membuat akurasi identifikasi genotipe tersedia untuk laboratorium mikrobiologi
klinis yang lebih kecil dan rutin.

Kami telah melihat bahwa mengidentifikasi bakteri yang diisolasi di laboratorium klinis dengan urutan
alih-alih fenotipe dapat meningkatkan mikrobiologi klinis dengan lebih baik mengidentifikasi strain yang
dideskripsikan dengan buruk, jarang diisolasi, atau menyimpang secara biokimia. Sekuens gen 16S rRNA
memungkinkan identifikasi bakteri yang lebih kuat, dapat direproduksi, dan akurat daripada yang
diperoleh dengan pengujian fenotipik. Hasil tesnya kurang subjektif. Analisis urutan gen 16S rRNA dapat
mengarah pada penemuan patogen baru. Analisis urutan gen 16S rRNA dapat mengidentifikasi bakteri
yang tidak dibudidayakan, memungkinkan kemandirian dari kondisi pertumbuhan.
Penunjukan organisme yang benar itu penting. Misalnya, ketika kita merujuk pada suatu kompleks
organisme dengan satu nama dan organisme ini memiliki potensi patogen yang berbeda, proses
penyakitnya menjadi kabur. Karena diketahui bahwa taksonomi yang benar atau penetapan nama dapat
membuat perbedaan dalam hasil klinis, harus ada permintaan untuk penggunaan yang lebih luas dari
identifikasi akurat yang dapat disediakan oleh analisis urutan gen 16S rRNA.

Kelemahan dari diskriminasi yang lebih baik yang diberikan oleh analisis urutan gen 16S rRNA adalah
bahwa hal itu menimbulkan kesulitan komunikasi, karena ada banyak urutan yang lebih berbeda
daripada nama atau deskripsi fenotipik. Tanpa korespondensi satu-ke-satu, mungkin ada masalah dalam
menetapkan nama ke urutan dengan cara yang berarti. Data tambahan mungkin juga sulit untuk
dikomunikasikan sepenuhnya dengan rekan klinis. Upaya untuk mengatasi hal ini disajikan pada Tabel
Tabel5.5. Lebih lanjut, informasi bahwa sekuensing gen 16S rRNA telah tersedia sejauh ini (dan terlebih
lagi di masa depan) menghadapkan ahli mikrobiologi klinis dengan keharusan untuk mengubah
beberapa konsep yang sudah dikenal tentang identifikasi spesies.

Sekuensing gen 16S rRNA secara tradisional memainkan peran terbatas dalam identifikasi
mikroorganisme di laboratorium mikrobiologi klinis, terutama karena biaya tinggi, persyaratan untuk
keterampilan teknis yang hebat, dan kurangnya perangkat lunak analisis sekuensing komparatif yang
mudah digunakan dan database yang divalidasi. Namun, ketersediaan teknik pengurutan DNA yang
ditingkatkan, database yang jauh meningkat, dan kit serta perangkat lunak yang lebih siap tersedia,
menjadikan teknologi ini alternatif kompetitif untuk teknik identifikasi mikroba rutin untuk beberapa
kelompok organisme, seperti mikobakteri. Biayanya juga dapat dibandingkan dengan metode
identifikasi tradisional untuk organisme lain yang tumbuh lambat dan sulit diidentifikasi, terutama jika
sequencer tersedia untuk multitasking di bagian lain dari laboratorium.

Fungsi penting tambahan untuk sekuensing gen 16S rRNA adalah menyediakan organisme yang
dikelompokkan secara akurat untuk studi lebih lanjut. Terlepas dari keakuratannya, analisis urutan gen
16S rRNA kurang digunakan secara luas di luar laboratorium besar dan referensi karena pertimbangan
teknis dan biaya. Dengan demikian, tantangan masa depan untuk laboratorium klinis, referensi, dan
penelitian yang besar adalah untuk menerjemahkan informasi dari sekuensing gen 16S rRNA menjadi
skema pengujian biokimia yang mudah digunakan, membuat akurasi identifikasi genotipe tersedia untuk
laboratorium mikrobiologi klinis yang lebih kecil dan rutin.
Clarridge J. E., 3rd (2004). Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on
clinical microbiology and infectious diseases. Clinical microbiology reviews, 17(4), 840–862.
https://doi.org/10.1128/CMR.17.4.840-862.2004

16S rRNA Bakteri Genotipe

Gen rRNA sangat penting untuk kelangsungan hidup semua organisme karena perannya dalam sintesis
protein. Gen 16S rRNA memiliki panjang 1.500 bp dan terdiri dari 10 bagian yang "terpelihara dengan
baik" dan 10 bagian "yang tidak terlindungi".

Analisis sekuensing gen 16S rRNA adalah salah satu metode standar yang digunakan dalam genotipe dan
taksonomi bakteri. Dengan mendeteksi perbedaan urutan (polimorfisme) di daerah yang sangat
bervariasi dari gen 16S rRNA yang ditemukan di semua bakteri, perbedaan yang jelas dapat dibuat
antara strain yang berbeda.

Penggunaan PCR gen 16S rRNA jarak luas sebagai alat untuk identifikasi bakteri dimungkinkan karena
gen 16S rRNA ada di semua bakteri (Woese, 1987). Gen 16S rRNA terdiri dari urutan nukleotida yang
sangat terkonservasi, diselingi dengan daerah variabel yang spesifik untuk genus atau spesies. Primer
PCR yang menargetkan wilayah rRNA yang dikonservasi memperkuat urutan variabel rRNA

gen (Relman, 1999). Bakteri dapat diidentifikasi dengan analisis urutan nukleotida produk PCR diikuti
dengan perbandingan urutan ini dengan urutan yang diketahui disimpan dalam database (Clarridge,
2004).

Detection and identification of bacteria in clinical samples by 16S rRNA gene sequencing: comparison of
two different approaches in clinical practice Claire Jenkins,1,2 Clare L. Ling,1,2 Holly L. Ciesielczuk,1,3
Julianne Lockwood,1 Susan Hopkins,1,3 Timothy D. McHugh,3 Stephen H. Gillespie3,4 and Christopher
C. Kibbler. Journal of Medical Microbiology (2012), 61, 483–488

***

Genotipe adalah proses menentukan perbedaan dalam susunan genetik (genotipe) individu dengan
memeriksa urutan DNA individu menggunakan uji biologis dan membandingkannya dengan urutan
individu lain atau urutan referensi. Ini mengungkapkan alel yang diwarisi seseorang dari orang tua
mereka. [1] Genotipe tradisional adalah penggunaan urutan DNA untuk menentukan populasi biologis
dengan menggunakan alat molekuler. Biasanya tidak melibatkan pendefinisian gen individu.

Metode genotipe saat ini meliputi identifikasi polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLPI) DNA
genom, deteksi polimorfik amplifikasi acak (RAPD) DNA genom, deteksi polimorfisme panjang fragmen
yang diperkuat (AFLPD), reaksi rantai polimerase (PCR), sekuensing DNA, alel oligonukleotida spesifik
(ASO) probe, dan hibridisasi ke mikroarray atau manik-manik DNA. Genotipe penting dalam penelitian
gen dan varian gen yang terkait dengan penyakit. Karena keterbatasan teknologi saat ini, hampir semua
genotipe bersifat parsial. Artinya, hanya sebagian kecil dari genotipe individu yang ditentukan, seperti
dengan (epi) GBS (Genotyping by sequencing) atau RADseq. Teknologi sekuensing massal [2] baru
menjanjikan untuk menyediakan genotipe genom utuh (atau sekuensing genom utuh) di masa
mendatang.
Genotipe berlaku untuk berbagai individu, termasuk mikroorganisme. Misalnya, virus dan bakteri dapat
dibuat genotipe. Genotipe dalam konteks ini dapat membantu dalam mengendalikan penyebaran
patogen, dengan menelusuri asal muasal wabah. Daerah ini sering disebut sebagai epidemiologi
molekuler atau mikrobiologi forensik.

Manusia juga bisa digenotipe. Misalnya, saat menguji peran ayah atau ibu, para ilmuwan biasanya hanya
perlu memeriksa 10 atau 20 wilayah genom (seperti polimorfisme nukleotida tunggal (SNP)), yang
mewakili sebagian kecil dari genom manusia.

Saat membuat genotipe organisme transgenik, mungkin hanya satu wilayah genom yang perlu diperiksa
untuk menentukan genotipe. Tes PCR tunggal biasanya cukup untuk membuat genotipe tikus transgenik;
tikus adalah model mamalia pilihan untuk banyak penelitian medis saat ini.

Dalam arti luas, istilah "genotipe" mengacu pada susunan genetik suatu organisme; dengan kata lain, ini
menggambarkan set lengkap gen suatu organisme. Dalam arti yang lebih sempit, istilah ini dapat
digunakan untuk merujuk pada alel, atau bentuk varian gen, yang dibawa oleh suatu organisme.
Manusia adalah organisme diploid, yang berarti mereka memiliki dua alel di setiap posisi genetik, atau
lokus, dengan satu alel yang diwarisi dari setiap induknya. Setiap pasang alel mewakili genotipe gen
tertentu. Misalnya pada tanaman kacang manis, gen warna bunga memiliki dua alel. Satu kode alel
untuk bunga ungu dan diwakili oleh huruf besar F, sedangkan kode kedua untuk bunga putih dan
diwakili oleh huruf kecil f. Oleh karena itu, populasi tanaman kacang manis yang bervariasi dapat
menampilkan tiga kemungkinan genotipe pada lokus ini: FF, Ff, atau ff. Setiap genotipe tanaman
memberikan kontribusi terhadap fenotipenya, yang dalam hal ini adalah penampilan luar bunganya.
Genotipe tertentu dideskripsikan sebagai homozigot jika memiliki dua alel identik dan heterozigot jika
kedua alel berbeda. Proses penentuan genotipe disebut genotipe.

bentuk gen yang bertanggung jawab atas karakteristik itu. Versi alternatif gen seperti itu sekarang kita
sebut alel, dan seluruh kumpulan alel yang dimiliki oleh seseorang — susunan genetiknya — disebut
genotipnya.

(PCA) telah terbukti berguna untuk mengevaluasi dan mengklasifikasikan plasma nutfah ketika sejumlah
besar aksesi dinilai untuk beberapa karakteristik kepentingan agronomi. Oleh karena itu, penelitian ini
direncanakan dengan tujuan untuk mengevaluasi delapan puluh genotipe ubi kayu (Manihot esculenta
Crantz.) Menjadi ciri-ciri yang paling membedakan hasil dan untuk mengidentifikasi genotipe yang paling
berbeda dalam hal keragaman genetik untuk digunakan dalam program pemuliaan yang efisien
berdasarkan enam belas hasil panen. menghubungkan sifat dengan menggunakan analisis komponen
utama.
Rao, Banavathu & Swami, D & Ashok, P & Babu, B. & Ramajayam, Devarajan & Sasikala, K. (2018).
Genetic Diversity Studies Based on Principal Component Analysis For Yield Attributes in Cassava
Genotypes. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7. 1424-1430.
10.20546/ijcmas.2018.712.170.

Markah molekuler dinilai lebih stabil sebagai penanda dan identifikasi serta dalam analisis
taksonomi, Li dan Graur (1991), mengungkapkan bahwa DNA menyediakan karakter yang lebih
berlimpah dibandingkan morfologi dan fisiologi, serta lebih cepat, praktis, dan efisien dalam
pengerjaan. Sekuen DNA memberikan banyak character state karena perbedaan laju perubahan
basa-basa nukleotida di dalam lokus yang berbeda dan lebih akurat serta menghasilkan kekerabatan
yang lebih alami. Sistematika molekuler dengan menggunakan markah molekuler pada tanaman
telah digunakan secara luas sebagaimana pada organisme lain dalam determinasi hubungan
filogenetik (Asahina, dkk. 2010). Pada sistematika Angiospermae pendekatan filogenetik dengan
karakter molekuler telah digunakan dan efektif dalam mengelompokan takson yang belum
terselesaikan dengan pendekatan fenetik (Reddy, 2009). Penggunaan sekuen DNA juga dapat
mengatasi kelemahan dari data morfologi yang diketahui memiliki keterbatasan karakter dan
cenderung dipengaruhi lingkungan. Kelebihan penggunaan markah molekuler, pertama sekuen DNA
memberikan data yang lebih akurat terhadap karakter-karakter yang ada (Hidayat 2008), kedua
sekuen DNA menyediakan banyak character state karena perbedaan laju perubahan basa-basa
nukleotida di dalam lokus yang berbeda adalah besar, ketiga sekuen DNA telah terbukti menghasilkan
sebuah hubungan kekerabatan yang lebih alami. Karakter dari markah molekuler berupa sekuen
DNA pada Langkah yang sedang dilakukan oleh para ahli molekuler ialah mencari suatu gen yang dapat
mencirikan suatu jenis sekaligus membedakan antara satu jenis dengan jenis lainnya. Gen tersebut
akan berfungsi sebagai suatu barkode sehingga lebih praktis dan efisien dalam identifikasi jenis
tumbuhan dan analisis kekerabatan dari suatu genus. Gen yang dijadikan markah molekuler pada
makhkuk hidup harus gen yang lestari moderat “moderate conserved” dan memiliki variasi yang
cukup pada tiap spesies, hal ini akan sangat bermanfaat dalam rekonstruksi filogenetik dan analisis
pada level populasi. Perbedaan laju mutasi pada kingdom hewan, tumbuhan, protista dan jamur
menyebabkan seleksi pengambilan gen penanda yang berbeda. Masing-masing gen penanda yang
dapat diajadikan rujukan dalam identifikasi dan taksonomi pada tiap kingdom ditunjukan pada Tabel.1
berikut :

Sekuen nonkoding yang banyak digunakan sebagai markah molekuler ialah ITS, “Internal Transcribed
Spacer” merupakan suatu daerah non fungsional RNA yang ada antara struktur rRNA pada prekursor
transcript umum. ITS berukuran kecil kurang lebih 700 pasang basa dan memiliki salinan yang banyak
pada genom inti. Pada kelompok jamur, ITS memperlihatkan hasil yang lebih efektif dibandingkan
dengan sekuen lain dan dierekomendasikan sebagai DNA barkode universal dalam semua kingdom
fungi pada consortium barcode of life (CBOL). Sementara kelompok protista dapat juga
menggunakan sekuen ITS. Pada kelompok tumbuhan, beberapa gen telah banyak digunakan untuk
analisis filogenetik dan identifikasi tumbuhan diantaranya mikrosatelit, ITS, gen rbcL, gapC, ndhF,
matK, dan psaA (Suparman, 2011). Mikrosatelit adalah sekuen DNA sederhana terdiri dari dua
sampai enam pasang basa berulang yang disebut pula dengan Simple Sequence Repeat (SSRs).
Penggunaan mikrosatelit banyak pada penelitian eukariotik karena terdistribusi merata pada genom
eukariotik. Markah ini bersifat kodominan dan dapat mendeteksi keragaman alel pada level tinggi.

Suparman, Suparman. (2012). MARKAH MOLEKULER DALAM IDENTIFIKASI DAN ANALISIS KEKERABATAN
TUMBUHAN SERTA IMPLIKASINYA BAGI MATA KULIAH GENETIKA. 1. 2301-4678.

DNA Template yaitu DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen yang akan digandakan.

DNA Template di dalam proses PCR berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru
yang sama.

Primer

Primer adalah rantai DNA pendek yang terdiri atas beberapa nukleotida. Primer yang umum digunakan
terdiri atas 10 atau lebih nukleotida (oligonukleotida).

Primer berfungsi sebagai pemula dalam proses sintesis DNA dalam PCR, atau untuk mengawali reaksi
replikasi DNA pada reaksi PCR. Primer yang dibutuhkan untuk PCR biasanya satu pasang yaitu primer
forward dan backward. Contoh primer yang digunakan misalnya TGAGCGGACA.

DNA Polimerase ( Taq Polomerase )

DNA Polimerase yaitu enzim yang mengkatalisis polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA.

DNA Polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini
diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi
dari bakteri termofilik atau hipertermofilik.
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) is a ready-to-use solution containing DreamTaq DNA
Polymerase, optimized DreamTaq Green buffer, MgCl 2, and dNTPs. The master mix retains all features of
DreamTaq DNA Polymerase. 4 x 1.25 mL DreamTaq Green PCR Master Mix (2X), which includes
DreamTaq DNA Polymerase, 2X DreamTaq Green buffer, dNTPs, and 4 mM MgCl2

• 4 x 1.25 mL Nuclease-free water

A buffer of the PCR reaction mixture serves as a chemical environment to maintain an activity and
stability of the DNA polymerase. The buffer pH is usually between 8.0 and 9.5 and is often stabilized by
Tris-HСl.

A common component of the Taq polymerase buffer is potassium ion from KCl, which promotes primer
annealing.

The buffer concentration of magnesium ions (Mg2+ from MgCl2) is another crucial factor for the proper
functioning of the DNA polymerase. Mg2+ ions serve as a cofactor for the enzyme.

In addition, magnesium ions facilitate formation of the complex between the primers and DNA
templates by stabilizing negative charges on phosphate backbones.

dNTP mix berisi basa nitrogen yang menyusun untai DNA baru. Mg2+ dalam MgCl berfungsi sebagai
kofaktor enzim polymerase.
Tan, S. C., & Yiap, B. C. (2009). DNA, RNA, and Protein Extraction : the Past and the Present. Journal of
Biomedicine & Biotechnology. Halaman 43-57

Elektroforesis gel gradien denaturasi (DGGE) adalah modifikasi elektroforesis gel yang digunakan untuk
memisahkan produk DNA yang dihasilkan PCR. PCR sampel lingkungan menghasilkan sejumlah templat
dengan urutan DNA berbeda yang mewakili populasi mikroba yang ada dalam sampel. Untuk produk
PCR dari reaksi tertentu yang berukuran serupa (200–700 bp), pemisahan konvensional dengan
elektroforesis gel agarosa hanya menghasilkan pita DNA tunggal dan sebagian besar tidak deskriptif.
Untuk mengatasi keterbatasan ini, teknik DGGE telah dikembangkan yang memanfaatkan karakteristik
denaturasi diferensial dari DNA. Oleh karena itu, metode ini digunakan untuk mendeteksi polimorfisme
non-RFLP atau perubahan nukleotida tunggal atau penyisipan atau penghapusan kecil pada DNA
berdasarkan perbedaan urutan (Myers et al., 1987).

Fragmen restriksi genom kecil dijalankan pada gel akrilamida gradien denaturant rendah hingga tinggi;
awalnya fragmen-fragmen tersebut bergerak sesuai dengan berat molekul, tetapi ketika mereka
berkembang ke kondisi denaturasi yang lebih tinggi, masing-masing mencapai kondisi ambang batas di
mana DNA mulai mencair, di mana migrasi melambat secara dramatis, yaitu, pergeseran mobilitas
diamati. Urutan DNA yang berbeda mengubah sifat pada konsentrasi yang berbeda dan oleh karena itu
menghasilkan pola pita yang mewakili populasi mikroba berbeda yang ada di komunitas. Setelah dibuat,
sidik jari dapat diunggah ke dalam database di mana kesamaan sidik jari dapat dinilai untuk menentukan
perbedaan struktural mikroba antara lingkungan atau perlakuan. Keuntungan utama DGGE adalah
kepekaannya yang dapat mendeteksi hampir semua mutasi pada bagian DNA tertentu. Karena itu,
sering digunakan dalam skrining genetik.

Denaturant yang umum digunakan adalah panas (suhu konstan 60 ° C) dan rasio tetap formamida (0–
40%) dan urea (0–7 M). Kadang-kadang, gradien suhu yang meningkat menggantikan gradien
denaturant kimiawi dan kemudian prosesnya disebut elektroforesis gel gradien suhu. Denaturasi DNA
harus dimulai dari salah satu ujung dupleks DGGE daripada denaturasi di tengah terlebih dahulu atau di
kedua ujungnya pada waktu yang bersamaan.

Singh, A., Singh, A. P., Sharma, V., Verma, H. N., Arora, K. (2012). Molecular Techniques. Chemical
Analysis of Food: Techniques and Applications. Pages 407-461

Elektroforesis gel gradien denaturasi (DGGE) adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan fragmen
DNA menurut mobilitasnya di bawah kondisi perubahan sifat yang semakin meningkat (biasanya
meningkatkan konsentrasi formamide / urea).

Sampel kecil DNA (atau RNA) ditambahkan ke gel elektroforesis yang mengandung agen denaturasi. Gel
denaturasi menginduksi peleburan DNA pada berbagai tahap. Sebagai hasil dari peleburan ini, DNA
menyebar melalui gel dan dapat dianalisis untuk komponen tunggal.
Analisis DGGE (Muyzer et al. 1993) digunakan untuk pemisahan fragmen DNA untai ganda yang
panjangnya identik, tetapi urutannya berbeda.

Dalam praktiknya, fragmen DNA biasanya diproduksi melalui amplifikasi PCR. Teknik DGGE
mengeksploitasi (di antara faktor-faktor lain) perbedaan stabilitas pasangan G-C (3 ikatan hidrogen per
pasangan) dibandingkan dengan pasangan A-T (2 ikatan hidrogen). Campuran fragmen DNA dengan
urutan berbeda dipisahkan dengan elektroforesis pada gel akrilamida yang mengandung gradien
denaturants DNA yang meningkat secara linier (biasanya urea dan formamida). Secara umum, fragmen
DNA yang lebih kaya GC akan lebih stabil dan tetap beruntai ganda hingga mencapai konsentrasi
denaturant yang lebih tinggi. Fragmen DNA untai ganda bermigrasi lebih baik dalam gel akrilamida,
sementara molekul DNA yang terdenaturasi melambat atau berhenti di gel. Dengan cara ini, fragmen
DNA dengan urutan berbeda dapat dipisahkan dalam gel akrilamida. DGGE biasanya dilakukan untuk
gen 16S rRNA parsial, tetapi juga gen fungsional dapat digunakan. Sekuens yang kaya GC (guanine plus
cytosine) dapat digabungkan ke dalam salah satu primer yang digunakan dalam PCR untuk memodifikasi
perilaku leleh fragmen yang diinginkan dan untuk meningkatkan pemisahan fragmen. Gel DGGE dapat
diwarnai dengan pewarna fluoresen pengikat DNA, seperti SYBR Green dan divisualisasikan di bawah
sinar UV. Standar yang diketahui dapat digunakan untuk membandingkan sampel pada gel yang
berbeda. Idealnya satu pita pada gel berhubungan dengan satu spesies, dan oleh karena itu jumlah pita
memberikan gambaran tentang keragaman sampel. Fragmen gen dapat dikeluarkan dari gel, dielusi mis.
ke dalam air steril dan diperkuat untuk pengurutan. Kelimpahan relatif berbagai mikroorganisme dapat
diperkirakan dengan mengukur intensitas pita mereka relatif terhadap intensitas semua pita dalam
sampel yang sesuai.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan
fragmen DNA pendek hingga menengah berdasarkan karakteristik lelehnya. Ini telah sering digunakan
untuk mengidentifikasi polimorfisme nukleotida tunggal tanpa perlu sekuensing DNA dan sebagai
metode sidik jari molekuler untuk komunitas ekosistem yang kompleks, khususnya dalam hubungannya
dengan amplifikasi gen mikroba 16S rRNA. Di sini, prinsip DGGE, berdasarkan pemisahan untai DNA
parsial pada posisi tertentu dalam gradien denaturant kimia, dijelaskan, dan contoh protokol,
dioptimalkan untuk sidik jari fragmen 200-300 bp dari gen 16S rRNA bakteri, diberikan.

Strathdee F, Free A. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Methods Mol Biol.
2013;1054:145-57. doi: 10.1007/978-1-62703-565-1_9. PMID: 23913290.

Diamond ™ Nucleic Acid Dye adalah pewarna fluorescent sensitif yang mengikat DNA untai tunggal, DNA
untai ganda, dan RNA, dan dapat digunakan untuk mewarnai dan memvisualisasikan asam nukleat
dalam gel. Diamond ™ Nucleic Acid Dye kompatibel dengan denaturasi dan gel agarosa dan
poliakrilamida asli dan dapat dicitrakan dengan sistem pencitraan standar apa pun, seperti dengan
transiluminasi UV dengan Polaroid® atau kamera digital, GE ImageQuant ™ atau sistem Bio-Rad Gel Doc
™.
Pewarna pekat stabil hingga 90 hari pada suhu kamar. Pewarna Asam Nukleat Diamond ™ tidak
memerlukan pencucian awal atau penghancuran gel. Ini jauh lebih sensitif daripada etidium bromida,
jadi lebih sedikit sampel asam nukleat dan penanda asam nukleat yang diperlukan untuk visualisasi,
menghasilkan penghematan yang meningkat dengan setiap gel yang Anda jalankan.

DD adalah pewarna pengikat alur eksternal, yang berarti DNA tidak perlu untai ganda agar pewarna
dapat mengikat. Struktur molekul DD adalah hak milik, yang membatasi komentar lebih lanjut tentang
mekanisme. Sebagai perbandingan, SG, yang melakukan interkalasi antara pasangan basa DNA dan
memiliki interaksi elektrostatis, hanya mengikat DNA untai ganda (dsDNA) (3). Ini akan menjadi
penjelasan yang masuk akal mengapa DD menghasilkan sinyal di NTC dan dalam pengenceran yang
terlalu rendah untuk amplifikasi yang dapat dideteksi.

Diamond Nucleic Acid Dye (DD) adalah pewarna pengikat alur eksternal yang terbukti memiliki kepekaan
yang sama dengan SG dan batas deteksi 0,5 ng saat mendeteksi DNA dalam gel agarosa (10). DD dapat
menembus membran sel, menyebabkan interaksi dengan DNA genom (10); Namun, penelitian telah
menunjukkan bahwa DD kurang mutagenik dan genotoksik bila dibandingkan dengan EtBr (11).
Penurunan toksisitas ini mungkin disebabkan oleh mekanisme pengikatan DD yang berbeda dengan DNA
dibandingkan dengan pewarna interkalasi lainnya, karena DD tidak mengikat antara pasangan basa DNA
melainkan mengikat secara eksternal (10). Saat ini, DD belum dievaluasi untuk digunakan dalam aplikasi
qPCR. EEG telah ditetapkan untuk digunakan dengan qPCR dan dengan analisis kurva lebur resolusi
tinggi (HRM), karena telah terbukti stabil di PCR (5). SG diketahui menghambat PCR pada konsentrasi
tinggi dan, dengan 25 ng DNA, terbukti menghambat reaksi pada konsentrasi> 1x. Sebagai
perbandingan, EG masih menunjukkan amplifikasi pada konsentrasi 2,5 ×, menunjukkan bahwa EG
menghambat PCR kurang dari SG (12]. Di sini, kami menyelidiki penggunaan DD dalam qPCR dan
membandingkan efektivitas DD dengan pewarna qPCR fluoresen lainnya: SG , EG, dan BG. Kami
menentukan konsentrasi optimal DD dalam reaksi, tingkat penghambatan amplifikasi, dan sensitivitas
serta efisiensi reaksi. Untuk menentukan seberapa kuat DD, berbagai primer dipilih yang menghasilkan
panjang produk yang berbeda. Karena DD adalah pewarna yang jauh lebih murah daripada SG (~ 5 kali
lipat lebih murah) dan dinyatakan lebih tidak beracun dan mutagenik daripada EtBr