I.

PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Perkembangan teknologi informasi dalam berbagai bidang disiplin ilmu telah
berkembang dengan sangat pesat. Perkembangan tersebut muncul dengan adanya
berbagai kajian baru yang sejalan dengan perkembangan teknologi informasi itu sendiri.
Salah satu bentuk kemajuan dalam teknologi informasi terjadi dalam bidang biologi
molekuler, peran teknologi informasi dalam biologi molekuler telah melahirkan
bioinformatika. Kajian baru Bioinformatika ini tak lepas dari perkembangan biologi
molekul modern yang ditandai dengan kemampuan manusia untuk memahami genom,
yaitu informasi genetik yang menentukan sifat setiap makhluk hidup yang disandi dalam
bentuk pita molekul DNA (asam deoksiribonukleat). Kemampuan untuk memahami dan
memanipulasi kode genetik DNA ini sangat didukung oleh TI melalui perangkat
perangkat keras maupun lunak. Bioteknologi modern ditandai dengan kemampuan pada
manipulasi DNA. Rantai atau sekuen DNA yang mengkode protein disebut gen. Gen
ditranskripsikan menjadi mRNA, kemudian mRNA ditranslasikan menjadi protein.
Protein sebagai produk akhir bertugas menunjang seluruh proses kehidupan, Jumlah
kelompok atau keluarga protein yang terjadi di alam relatif terbatas sehingga kesamaan
struktur antara dua protein dapat disimpulkan dari kemiripan sekuen. Teknik ini
kemudian dikenal luas sebagai pemodelan protein (protein modeling) dalam
perkembangan di bidang bioinformatika (Dharmayanti, 2011).
Bioinformatika adalah gabungan disiplin ilmu biologi, ilmu komputer, informatika,
matematika, dan disiplin lain yang terkait yang menjadi disiplin tersendiri. Tujuan
utamanya adalah mampu memberikan pandangan baru dalam mencapai prespektif global
yang menunjang perkembangan bioteknologi di masa depan (Narita et al., 2012). Analisis
dalam bioinformatika difokuskan pada tiga jenis dataset: urutan genom, struktur
makromolekul dan percobaan genomik fungsional. Tetapi analisis bioinformatika juga
diterapkan pada berbagai data lain, seperti pohon taksonomi, data tentang hubungan jalur
metabolik, teks artikel ilmiah dan statistik. Berbagai macam teknik yang digunakan
termasuk pencocokan sekuen, struktur protein 3D, konstruksi pohon filogenetik, prediksi
dan klasifikasi struktur protein, prediksi struktur RNA, prediksi fungsi protein, dan
ekspresi kluster data.
 Karakter morfologi telah lama digunakan dalam banyak penelitian filogenetik.
Dengan pesatnya perkembangan teknik-teknik di dalam biologi molekuler, seperti PCR
(polymerase chain reaction) dan sikuensing DNA, penggunaan sikuen DNA dalam
penelitian filogenetik telah meningkat pesat dan telah dilakukan pada semua tingkatan
taksonomi, misalnya famili, marga, dan species. Filogenetik molekuler
mengkombinasikan teknik biologi molekuler dengan statistik untuk merekonstruksi
hubungan filogenetik. Pemikiran dasar penggunaan sikuen DNA dalam studi filogenetik
adalah bahwa terjadi perubahan basa nukleotida menurut waktu, sehingga akan dapat
diperkirakan kecepatan evolusi yang terjadi dan akan dapat direkonstruksi hubungan
evolusi antara satu kelompok organisme dengan yang lainnya. Beberapa alasan mengapa
digunakan sikuen DNA: (1) DNA merupakan unit dasar informasi yang mengkode
organisme; (2) relatif lebih mudah untuk mengekstrak dan menggabungkan informasi
mengenai proses evolusi suatu kelompok organisme, sehingga mudah untuk dianalisis;
(3) peristiwa evolusi secara komparatif mudah untuk dibuat model; dan (4) menghasilkan
informasi yang banyak dan beragam, dengan demikian akan ada banyak bukti tentang
kebenaran suatu hubungan filogenetik.
1.2 TUJUAN
1. Mengetahui tahapan identifikasi dan hubungan kekerabatan dari sekuens ICBB 7654,
ICBB 7656, ICBB 7660, 16R1492.ab1, dan 16F27.ab1,
2. Membuat pohon filogenetik dari sekuens ICBB 7654, ICBB 7656, ICBB 7660,
16R1492.ab1, dan 16F27.ab1,
3. Mencari homologi dan membuat struktur 3D dari protein β lactamase.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Identifikasi Gen 16S RNA
Analisis terhadap gen penyandi 16S rRNA merupakan metode terpilih untuk
identifikasi dan melihat filogenitas bakteri. Identifikasi terhadap gen penyandi 16S rRNA
dikenal dengan sebutan ribotyping atau riboprinting. Identifikasi tersebut didasarkan pada
tingkat keasaman dalam sekuens DNA ribosomal 16S rRNA sebagai sidik jari genetik
bakteri atau disebut sebagai sekuens sidik jari (Sueprianto, 2018). Gen 16S rRNA setiap
spesies bakteri memiliki bagian yang stabil dalam sekuen dan satu sel bakteri memiliki
ribuan kopi RNA. Keuntungannya adalah RNA secara umum dimiliki oleh semua bakteri,
sedikit berubah dalam waktu tertentu, unit yang konstan dan merupakan target yang
sensitif, terdapat dalam jumlah yang banyak dalam sel yang aktif
2.2 Pohon Filogenik
Analisis phylogenetic-tree berdasarkan sekuen gen 16S rRNA sering dipakai
sebagai metode untuk mengklasifikasikan organisme. Sekuen gen rRNA pada bakteri
merupakan marker molekular universal yang baik karena (i)mengandung daerah yang
sangat stabil (conserved region) maupun daerah yang variabel (ii) jarang sekali
mengalami transfer gen secara lateral dan (iii) mengalami perubahan yang sangat lambat
selama evolusi sehingga dapat digunakan untuk mengetahui hubungan filogenetik
.Klasifikasi bakteri secara filogenetik sangat dibutuhkan terutama untuk bakteri patogenik
karena bakteri yang memiliki kedekatan hubungan kekerabatan dapat dikelompokkan
sebagai suatu genus atau spesies sehingga dapat terhindar dari pengklasifikasian yang
tidak tepat dan kesalahan dalam identifikasi .Analisis filogenetik yang didasarkan atas
gen 16S rRNA dapat digunakan untuk tujuan klasifikasi maupun identifikasi mikrobia.
Terdapat beberapa metode untuk mengkonstruksi pohon filogenetika dari data molekuler
(nukleotida atau asam amino). Analisis filogenetika dari keluarga sekuen nukleotida atau
asam amino adalah analisis untuk menentukan bagaimana keluarga tersebut diturunkan
selama proses evolusi. Hubungan evolusi diantara sekuen digambarkan dengan
menempatkan sekuen sebagai cabang luar dari sebuah pohon (Dharmayanti, 2011).
2.3 Identifikasi Struktur 3D Protein
Pengetahuan dan pemahaman struktur tiga dimensi protein sangat penting karena
dapat memberikan informasi penting dalam memahami sifat dan fungsi biokimia protein
tersebut ditingkat molekular secara detil. Pada saat sekarang ini, penentuan struktur tiga
dimensi protein secara penelitian laboratorium relatif sulit karena memerlukan
instrumentasi yang canggih, waktu penelitian yang lama dan memerlukan biaya yang
cukup besar. Prediksi bentuk stuktur 3D dari protein salah satunya dapat dilakukan
dengan metode homology modeling. Homology modeling merupakan suatu metode yang
didasarkan pada hasil pengamatan yang menunjukkan bahwa semua anggota famili
protein memiliki bentuk lipatan yang sama. Penggunaan metode ini bergantung pada
struktur protein yang homolog, dimana protein tersebut sudah ditentukan bentuk
strukturnya secara eksperimen (template) dan memungkinkan pembuatan model yang
dimulai dari sekuens protein yang akan dimodelkan (target) (Kumar et al., 2016).
 III. METODE
3.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah laptop yang sudah dilengkapi
dengan softwere MEGAX dan CLUSTALX. Bahan yang digunakan adalah sekuens 16S
ribosoman RNA dengan 2 format yaitu .fasta dan .ab1. Adapun sekuens yang mempunyai
format .fasta adalah ICBB 7654, ICBB 7656, ICBB 7660, dan sekuens yang mempunyai
format .ab1 adalah 16R1492, dan 16F27. Bahan lain yang digunakan adalah sekuens
protein β lactamase dengan kode 6j8r.fasta. Adapun urutan sekuens dari masing – masing
sekuens sebagai berikut:
1. ICBB 7654
CCCCCAATCATCTATCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCCA
CCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAA
GGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCATT
CCGGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGACT
TTATCGGATTAGCTCCCTCTCGCGAGTTGGCAACCGTTTGTATCGTCCATT
GTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCAT
CCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACT
AAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTACCC
AACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGTT
GTCCCCGAAGGGAAAACCATATCTCTACAGTGGTCAACGGGATGTCAAG
ACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCG
CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACT
CCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAA
CCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTA
2. ICBB 7656
ACCCCTCAATCCATCCTGTCCCCACTCTTCAGGCGGCTGGCTCCAAAAAG
GTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGG
TGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATT
ACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACT
GAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTG
TACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGA
TTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAG
AGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCG
GGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCA
CCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAG
GATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACAT
GCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGC
GGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAG
GGCGGAAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTAC
3. ICBB 7660
GGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCG
GTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGAT
TACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAAC
 TGAGACCGGCTTTCTTAGGATTGGCTCCATCTCGCGACTTCGCTTCCCGT
TGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGAT
GATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTT
AGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAAGTTCAAGGGTTGCGCTCGTTG
CGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCAC
CACCTGTCTCCAATGCTCCGAAGAGGGGCACTATCTCTAGTGCTTTCATC
GCGATGTCAAGACCTGCTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCAAATTAAACCAA
4. 16R1492
AGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCG
ATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACA
GATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCC
ATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGT
CATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCA
ACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA
CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACT
CTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAG
ACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCG
CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACT
CCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAA
CCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC
TAATCCTGTTCGCTCCC
5. 16F27
AGAGAGCTTGCTCTCTTGGCGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATAT
CGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATA
CCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATCGCAAGACCTCTCACTA
TTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACC
AAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGA
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGG
ACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCC
TTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTATCCCCTAATAC
GGGATACTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGC
CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG
GCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGG
GCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAG
GGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGA
ATACCGATG
6. Protein β lactamase (6j8r)
EYPTVSEIPVGEVRLYQIADGVWSHIATQSFDGAVYPSNGLIVRDGDELLLID
TAWGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATY
ASPSTRRLAEVEGNEIPTHSLEGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVY
VPSASVLYGGCAIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGH
GLPGGLDLLKHTTNVVKAHTNR
 3.2 Metode Pelaksanaan
3.2.1 Pembuatan Pohon Filogenik
Dalam pembuatan pohon filogenik, sekuens sampel dengan format word
harus disimpan dulum ke dalam format fasta agar dapat dibuka di MEGAX. Format
sekuens dalam bentuk word dicopy kemudian disimpan ke dalam text document.
Setelah disimpan ke dalam text document kemudian file tersebut disimpan ke dalam
format .fasta. Sekuens dengan format .ab1 tidak perlu diubah formatnya menjadi
fasta karena sudah dapat dibuka di MEGAX. Setelah semua file disimpan sesuai
dengan file yang dikehendaki, maka langkah selanjutnya adalah membuka
MEGAX dan kemudian pilih File dan pilih Open file kemudian masukkan sekuens
yang ingin dimasukkan. Jika sekuens sudah terdapat didalam MEGAX, maka
langkah selanjutnya, sekuens – sekuens tersebut di BLAST dengan menu yang
terdapat di dalam MEGAX. Kemudian akan muncul halaman NCBI dengan
sekuens yang kita pilih dengan sekuens homologinya. Isolat yang kita masukkan
dibandingkan dengan sekuens yang ada di Gene Bank. Setelah memilih isolat
pembanding dengan karakteristik homologi yang 100 % maka langkah selanjutnya
adalah mengklik Accession dan pilih Add to Alignment. Setelah dipilih beberapa
sekuens pembanding dilakukan alignment menggunakan menubar CLUSTALW
dan MEGAX akan mengurutkan data berdasarkan persamaan setiap nukleotida
disetiap sekuens. Untuk membuat pohon filogenik maka data – data tersebut harus
dilakukan Philogeny analysys terlebih dahulu kemudian dipilih jenis pohon yang
akan dibuat dan simpan session yang telah dikerjakan sebelumnya. Setelah pohon
filogenik berhasil dibuat maka diinterpretasikan.
3.2.2 Pembuatan Struktur 3D
Pembuatan struktur 3D dari protein yang pertama dilakukan adalah dengan
mencari sekuens protein di rscb.org atau di PDB (Protein Data Bank). Setelah
menemukan file yang diinginkan maka download dalam format .fasta. Setelah itu
masukkan sekuens tersebut ke dalam BLASTp. Setelah diblast nanti akan keluar
hasil berupa homologi dari sekuens yang kita masukkan sebelumnya. Jika terdapat
kesamaan lebih dari 90 % maka untuk pembuatan struktur 3D nya menggunakan
SWISS MODEL, jika kurang dari 90 % maka pembuatan struktur 3D nya
menggunakan I-TASSER. Setelah memiliki struktur 3D nya, urutan sekuens yang
 kita miliki dilakukan analisis Proteomik dengan menggunakan Web. Web yang bisa
digunakan untuk analisis proteomic antara lain: http://web.expasy.org/protparam,
http://www.ncbi.-nlm.nih.gov/Structure-/cdd/cdd.shtml, http://prosite.expasy.org
dan Signal IP 5.0.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Ada beberapa tahap penting dalam analisis filogenetik molekuler, yaitu sequence
alignment, dan rekonstruksi pohon filogenetika. Tujuan utama dari sequence alignment
adalah untuk menentukan satu sekuen DNA atau protein sama atau homolog dengan
lainnya. Alignment akan membandingkan 2 sekuens yang homolog atau biasa disebut
dengan pairwise aslignment sedangkan yang membandingkan dengan sekuen homolog
yang jumlah nya banyak disebut dengan multiple alignment. Alignment merupakan factor
yang menentukan keberhasilan dari analisis filogenetik. Pada tahap alignment, setiap basa
nukleotida (A, C, T, G) akan menjadi site tertentu yang equivalen dengan karakter yang
sama. Dalam sekuens yang berbeda, setiap basa nukleotida akan sejajar dengan urutan
sekuens yang urutan basa nukleotidanya sama, atau apabila ukuran sekuen DNA
sepanjang 600 pasang basa maka jumlah karakter yang digunakan adalah sebanyak 600
karakter sehingga dalam proses alignment akan dijumpai gap antar sekuens. Gap tersebut
terjadi karena adanya insersi ataupun delesi. Gap bisa dianggap sebagai data yang hilang
dan bisa dilibatkan dalam analisis karena bisa bersifat informatif.
4.1 Identifikasi Sekuen DNA
4.1.1 16F27
Sekuen 16F27 merupakan sekuen yang disimpan dalam format AB1 memiliki
panjang sekuens 1450 bp, namun tidak semua urutan nukleotida digunakan karena grafik
yang ada di MEGAX tidak rapih sehingga perlu dilakukan pemotongan guna merapikan
sekuen 16S ribosomal RNA. Urutan nukleotida yang tidak rapih terdapat di basa awal
dan di akhir basa, setelah dilakukan pemotongan maka panjang sekuens 16F27 menjadi
650 bp. Tujuan dari perapihan sekuens tersebut adalah untuk menghindari kesalahan
interpretasi sehingga menimbulkan sekuens untuk spesies atau genus baru. Selanjutnya
sekuens diinput dalam program NCBI dengan program BLAST untuk mencari sekuens
yang memiliki similaritas atau kemiripan berdasarkan proses alignment antara sekuens
16F27 dengan sekuens yang terdapat dalam gene bank dengan pilihan alignment
berdasarkan kemiripan yang tinggi (high similarity). Pemilihan sekuens pembanding
 berdasarkan nilai e-value yaitu 0 serta persentase yang mendekati 100 %. Berdasrkan
hasil pemilihan sekuens maka diperoleh lima strain dengan kekerabatan 100 % (Tabel 1).
Tabel 1. Isolat pembanding dari sekuens 16F27
Ukuran Persentase Gene Bank
No Nama Spesies dan Strain Asal Isolat
Sequens (bp) Kemiripan (%) Accesion
Alcaligenes faecalis strain Wetlands
1 1438 100 MN578054
WT14 sediment
Alcaligenes faecalis Strain
2 962 Soil 100 MN309929
Sihong_809_2
Pusillimonas caeni atrain
3 862 Ground water 100 MK583541
gw07
Paenalcaligenes
4 946 Groundwater 100 MK583954
suwonensis strain GW 06
Esherichia coli strain Homo
5 779 100 MG566068
HPCAQ7CR13 sapiens
Berdasarkan hasil yang telah didapatkan, maka sekuens 16F27 mempunyai
kemiripian dengan bakteri dari genus Alcaligenes, Pusillimonas, Paenalcaligenes serta
Esherichia coli. Menurut Bhatnagar (2011) genus bakteri Alcaligenes merupakan bakteri
gram negative dengan bentuk sel batang. bakteri tersebut merupakan mikrob
kemoorganotrof yang mampu menggunakan karbon dari berbagai sumber untuk
pertumbuhannya. Bakteri Genus Alcaligenes juga mampu melakukan biodegradasi
terhadap kontaminansi senyawa – senyawa beracun yang ada di tanah (Effendy dan
Widajatno, 2015). Sama halnya dengan Alcaligenes, bakteri genus Pusillimonas juga
mampu melakukan biodegradasi terhadap tanah yang tercemar senyawa – senyawa
beracun.
4.1.2 16R1492
Sekuen 16R1492 merupakan sekuen yang disimpan dalam format AB1 memiliki
panjang sekuens 1500 bp, namun tidak semua urutan nukleotida digunakan karena grafik
yang ada di MEGAX tidak rapih sehingga perlu dilakukan pemotongan guna merapikan
sekuen 16S ribosomal RNA. Urutan nukleotida yang tidak rapih terdapat di basa awal
dan di akhir basa, setelah dilakukan pemotongan maka panjang sekuens 16R1492 menjadi
700 bp. Selanjutnya sekuens diinput dalam program NCBI dengan program BLAST
untuk mencari sekuens yang memiliki similaritas atau kemiripan dengan alignment
kemiripan yang tinggi (high similarity). Pemilihan sekuens pembanding berdasarkan nilai
e-value yaitu 0 serta persentase yang mendekati 100 %. Berdasrkan hasil pemilihan
sekuens maka diperoleh lima strain dengan kekerabatan 100 % (Tabel 2).
 Tabel 2. Isolat pembanding dari sekuens 16R1492
Ukuran Persentase Gene Bank
No Nama Spesies dan Strain Asal Isolat
Sequens (bp) Kemiripan (%) Accesion
Bacillus velezensis strain
1 877 Sea water 100 MN714347
POCOS_12
Sheep
Bacillus subtilis strain
2 1406 manure 100 MN720161
CR1
composting
3 Bacillus sp. Strain wyh 1419 - 100 MN726623
4 Bacillus sp. Strain LRB-5 1455 Soil 100 MN726441
5 Bacillus sp. Strain HSB2 1452 Soil 100 MN726437
Berdasarkan hasil yang telah didapatkan bahwa sekuens 16S RNA dari 16R1492
mempunya kemiripan yang mempunyai nila 100 % dengan genus bakteri Bacillus.
Menutu Lestari et al. (2017) kelompok bakteri bacillus yang diisolasi dari tanah serta
kotoran hewan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan asam indol asetat yang
merupakan zat pengatur tumbuh yang sangat diperlukan oleh tumbuhan. Bacillus
velezensis merupakan salah satu bakteri yang mampu menghasilkan IAA (Lestari et al.,
2017).
4.1.3 ICBB 7654
Sekuens ICBB 7654 mempunyai panjang nukleotida 450 bp. Sekuens tersebut
merupakan sekuens dengan ukuran pendek sehingga tidak perlu dilakukan pengeditan
grafik nukleotida karena sudah sesuai urutan dan grafiknya. Sekuens ICBB 7654 harus
diubah formatnya untuk bisa dilakukan BLAST dengan menggunakan MEGAX untuk
mencari kemiripan dengan sekuens yang ada di Gene Bank. Perubahan format dari text
document menjadi format FASTA. Setelah format diubah menjadi FASTA maka
selanjutnya dicari kemiripan antara sekuens ICBB 7654 dengan sekuens yang ada di Gene
Bank dengan tingkat kemiripan mendekati 100 % dan mempunyai e-value 0.setelah
dilakukan BLAST maka ditemukan lima strain yang mempunyai kemiripan 99 – 100 %/
Tabel 3. Isolat pembanding dari sekuens 7654
Ukuran Persentase Gene Bank
No Nama Spesies dan Strain Asal Isolat
Sequens (bp) Kemiripan (%) Accesion
Lysinibacillus macrolides
1 1486 Forest soil 100 MN263207
strain M7
Lysinibacillus sp. Strain
2 1493 Soil 100 MH683160
Firmi-71
Lysinibacillus xylanilytus Saffron
3 1521 100 KY933477
strain IHB B 17519 Rhizosphere
Bacillus subtilis strain
4 1500 Soil 100 KU936344
HSN-33
 Lysinibacillus fusiformis
5 1487 Soil 99 KU179364
strain L13
Berdasarkan hasil yang diperoleh jika sekuen ICBB 7654 mempunyai kemiripan
dengan genus bakteri Lysinibacillus dengan tingkat kemiripan 100 %. Bakteri dari genus
Lysinibacillus merupakan mikrob yang mempunyai sifat antagonis yang dapat
mengendalikan pathogen dengan mekanisme induksi resistensi (Hersanti et al., 2019).
Bakteri B. subtilis dan Lysinibacillus sp. mampu menekan pekermbangan penyakit
Ralstonia solacrarum secara invitro (Hersanti et al., 2019).
4.1.4 ICBB 7656
Sekuens ICBB 7656 mempunyai panjang nukleotida 550 bp. Sekuens tersebut
merupakan sekuens dengan ukuran pendek sehingga tidak perlu dilakukan pengeditan
grafik nukleotida karena sudah sesuai urutan dan grafiknya. Setelah format diubah
menjadi FASTA maka selanjutnya dicari kemiripan antara sekuens ICBB 7656 dengan
sekuens yang ada di Gene Bank dengan tingkat kemiripan mendekati 100 % dan
mempunyai e-value 0. setelah dilakukan BLAST maka ditemukan lima strain yang
mempunyai kemiripan 99 – 100 %/
Tabel 4. Isolat pembanding dari sekuens 7656
Ukuran Persentase Gene Bank
No Nama Spesies dan Strain Asal Isolat
Sequens (bp) Kemiripan (%) Accesion
Bacillus subtilis strain
1 1458 Soil 100 JQ086379
CCTCC M2011162
Bacillus thuringiensis
2 1481 Soil 100 MN203618
strain BDzG
3 Uncultured bacterium gene 782 Lake water 100 AB518232
Rhizosphere
4 Bacillus cereus strain B18 939 100 KJ874366
soil
5 Bacillus 8-gwl-9 1497 water 100 DQ990037
Berdasarkan hasil pencarian sekuens dengan kemiripan 100 %, sekuens ICBB 7656
mempunyai kemiripan dengan Bacillus thuringiensis dengan persentasi kemiripan 100 %.
B. thuringiensis merupakan bakteri gram-positif berbentuk batang yang menghasilkan
kristal protein yang bersifat membunuh serangga (insektisidal) sewaktu mengalami
proses sporulasinya (Bahagiawati, 2002)
4.1.5 ICBB 7660
Sekuens ICBB 7660 mempunyai panjang nukleotida 500 bp. Sekuens tersebut merupakan
sekuens dengan ukuran pendek sehingga tidak perlu dilakukan pengeditan grafik
nukleotida karena sudah sesuai urutan dan grafiknya. Setelah format diubah menjadi
 FASTA maka selanjutnya dicari kemiripan antara sekuens ICBB 7660 dengan sekuens
yang ada di Gene Bank dengan tingkat kemiripan mendekati 100 % dan mempunyai e-
value 0. setelah dilakukan BLAST maka ditemukan lima strain yang mempunyai
kemiripan 99 – 100 %
Tabel 5. Isolat pembanding dari sekuens 7660
Ukuran Persentase Gene Bank
No Nama Spesies dan Strain Asal Isolat
Sequens (bp) Kemiripan (%) Accesion
Paenibacillus tiamunensis
1 1554 Soil 100 NR_116788
strain B27
2 Paenibacillus sp. F6-B70 1554 Forest soil 100 GQ240305
3 Paenibacillus elgii partial 1663 Rock surface 100 LN890045
Paenibacillus eurofinensis
4 1543 Savanna soil 100 EU257517
strain AC13MSD
Paenibacillus tiamunensis
5 strain F6-B70 clone F6- 1534 Soil 100 GU647100
B70-3
Berdasarkan hasil yang telah didapatkan maka sekuens ICBB 7660 mempunyai
kemiripan dengan genus Paenibacillus dengan persentase kemiripan 100 %. Paenibacillus
merupakan bakteri yang menghasilkan berbagai enzim ekstraseluler seperti enzim dan
protease yang merendahkan polisakarida, yang dapat mengkatalisasi berbagai reaksi
sintetik di berbagai bidang mulai dari kosmetik hingga produksi biofuel. Berbagai
Paenibacillus spp. juga menghasilkan zat antimikroba yang mempengaruhi spektrum luas
mikroorganisme seperti jamur, bakteri tanah, bakteri patogen tanaman, dan bahkan
patogen anaerob penting seperti Clostridium botulinum
4.2 Pembuatan Pohon Filogenik
Setelah didapatkan sekuens dengan kemiripan yang mencapai 100 % dengan
sekuen sampel maka kelima sampel tersebut dibuat pohon filogeniknya untuk mengetahui
tingkat kekerabatan antara satu spesies dengan spesies yang lainnya. Dalam pembuatan
pohon filogenik, semua sekuens dilakukan pensejajaran atau alignment untuk
menentukan jarak antar isolat berdasarkan nukleotida yang disejajarkan. Nukleotida yang
tidak mempunyai pasangan pada sekuens lain dibirkan kosong sebeb saat proses
alignment pilihan auto-fill gaps di non aktifkan. Pohon filogeni yang dibuat untuk kelima
sekuens dengan masing-masing tiga isolat pembanding adalah Maximum likehood
method. Maximum likelihood method adalah algoritma yang digunakan untuk membuat
pohon filogeni dengan membuat model evolusi setiap sampel yang diuji dan
hubungannya dengan sampel yang lain (Tamura dan Nei, 1993). Metode ini
menggunakan kalkulasi untuk menemukan pohon yang mempunyai hitungan variasi
terbaik dalam set sekuen.

Gambar 1. Pohon filogenik sekuens gabungan dengan metode Msximum Likehood dan
analisis Boostrap (1000 replikasi)
Berdasarkan hasil pohon filogenik maka dapat dilihat jika terdapat 2 klade yang
terbentuk dimana pada klade yang pertama merupakan data pembanding dari sekuens
yang menjadi sampel. Sedangkan pada klade yang kedua semua sampel berkumpul
menjadi satu. Berdasarkan hal tersebut menandakan jika sekuens yang dijadikan sampel
seperti ICBB 7660, ICBB 7664, ICBB 7656 dan 16R1492 mempunyai tingkat
kekerabatan yang dekat. Sedangkan sekuens 16F27 mempunyai kekerabatan dengan
sekuens homoliginya yang didapatkan dari Gene Bank. Berdasarkan pohon filogenik,
pada klade yang pertama dibagi menjadi dua bagian, dimana sekuens yang mempunyai
genus bacillus mempunyai kekerabatan yang dekat seperti Bacillus velezensis,
 Paenibacillus, setra Lysinibacillus. Hal tersebut sesuai dengan pendapat Hersanti et al.,
(2019) yang mengatakan jika bakteri genus Bacillus mempunyai kemampuan sebagai
antagonis terhadap bakteri yang bersifat pathogen. Dalam pembuatan pohon filogenik
data sekuens dianalisis dengan metode bootstrap, data dilakukan resampled, dengan
secara random memilih kolom vertikal dari sekuen yang dijejerkan untuk menghasilkan
penjejeran, dan dalam pengaruh sebuah penjejeran baru dengan panjang yang sama.
Masing - masing kolom digunakan lebih dari satu kali dan beberapa kolom mungkin tidak
digunakan pada semua penjejeran yang baru.
4.3 Struktur 3D
Salah satu fungsi lain dari NCBI selain mencari kemiripan dari sekuens nukleotida
tapi juga dapat mencari kemiripan dari sekuen protein dengan memanfaatkan BLASTp.
Untuk mendapatkan sekuens protein bisa siperoleh dari PDB (Protein Data Bank) yang
kemudian dicari kemiripan dengan sekuens yang lainnya dengan menggunakan BLASTp.
Berikut merupakan homolog dari sekuens protein 6j8r
Tabel 6. Homologi dari sekuens protein 6j8r
Persentase
NO. Identitas Protein Sumber Query Cover PDB Accesion
Kemiripan (%)
Chain A. Beta-lactamase Pseudomonas
1 100 100 5YD7_A
class B VIM-2 aeruginosa
Berdasarkan hasil dari yang sudah didapatkan, maka sekuen 6j8r mempunyai
kemiripan yang mencapai 100 % dengan protein Beta-lactamase yang dihasilkan oleh
bakteri Pseudomonas aeruginosa. Protein beta alctam merupakan protein yang dihasilkan
oleh bakteri salah satunya adalah Pseudomonas aeruginosa. Protein tersebut merupakan
antibiotic yang masuk ke dalam antibiotic peptide dengan asam amino yang memiliki
cincin beta lactam. Antibiotic ini banyak digunakan karena spectrum yang luas dan
bersifat selektif yaitu menghambat pertumbuhan bakteri target tanpa membahayakan sel
inang. Analisis sekuens protein 6j8r mendapatkan percent identity 100 %, sehingga
permodelan struktur proteinnya menggunakan metodek Homology Modelling
menggunakan Swiss Model. Selain bentuk 3D dari protein juga diperoleh Ramachandran
plots. Menurut Mannige et al. (2016) struktur sekunder dicirikan oleh keadaan rotasi
lokal dari tulang punggung protein, dikuantifikasi oleh dua sudut dihedral yang disebut ϕ
dan ψ Ramachandran menyediakan representasi grafis dua dimensi sederhana dari semua
struktur protein yang mungkin dalam hal sudut puntir (Wijaya dan Hasanah, 2016).
Ramachandran plots merupakan metode yang digunakan untuk menilai penempatan torsi
protein.

Gambar 2. Model struktur 3D dan Ramachandran plots protein 6j8r

Plot Ramachandran merupakan plot dua dimensi yang menggambarkan residu asam
amino pada struktur enzim, dimana sudut φ (phi) sebagai sumbu x dan ψ (psi) sebagai
sumbu y dibagi kedalam empat kuadran (Laskowski dkk, 1993). Kombinasi dari sudut φ
(phi) dan ψ (psi) dapat dijadikan dasar didalam menilai kualitas stereokimia suatu model
protein atau enzim. Penilaian tersebut didasarkan pada persentase residu asam amino
yang berada pada wilayah yang sangat disukai (most favoured regions) dan daerah yang
tidak diizinkan (disallowed regions) dari plot Ramachandran. Setelah didapatkan struktur
3D nya maka dilakukan analisis proteomic menggunakan ExsPASy yang menunjukkan
sekuan 6j8r mempunyai asam amino sebanyak 231 dengan jumlah asam amino alanin
yang merupakan asam amino yang paling banyak dengan 10,8 %. Berikut merupakan
komposisi dari asam amino yang terdapat di protein 6j8r.

V. KESIMPULAN

Berdasarkan pohon filogenik yang sudah dibuat maka sekuens 16F27 mempunyai
kemiripan dengan Alcaligenes faecalis, sekuens 16R1492 mempunyai kemiripan dengan
Bacillus velezensis, sekuens ICBB mempunyai kekerabatan yang dekat dengan
Lysinibacillus sp., sekuens ICBB 7654 mempunyai kemiripan dengan Bacillus
thuringiensis, dan sekuens ICBB 7660 mempunyai kemiripan dengan Paenibacillus
tiamunensis. Sedangkan sekuens protein 6j8r mempunyai kemiripan dengan protein beta-
lactamase yang dihasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa.

DAFTAR PUSTAKA

Bahagiawati. 2002. Penggunaan Bacillus thuringiensis sebagai Bioinsektisida. Buletin

AgroBio Vol. 5(1):21-28.
Dharmayanti, N. L. P. I. 2011 Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi Organisme
Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa Vol. 21(1). 1 – 10.
Effendy, E., dan R. L. Widajatno. 2015. Biodegradasi 2,4-Diklorofenol Oleh Bakteri
Alcaligenes sp dan Bacillus sp. Jurnal Ilmiah Teknik Lingkungan Vol. 1(2):41-48.
Hersanti., Sudarjat., dan A. damayanti. 2019 Kemampuan Bacillus subtilis dan
Lysinibacillus sp. Dalam Silikat Nano dan Serat Karbon untuk Menginduksi
Ketahanan Bawang Merah terhadap Penyakit Bercak Ungu (Alternaria porri(Ell.)
Cif). Jurnal Agrikultura Vol. 30(1):8 – 16.
Junaidin, S. Chaerani., N. H. Fadia. 2019. Study Homology Modeling Enzim Tirosinase
dengan Menggunakan Swiss-Model. Farmagazine Vol. 6(1): 1 – 8.
Kumar S., Stecher G., and Tamura K. 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary
GeneticsAnalysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution
33:187-1874.
Lestrari, P., D. N. Susilowati, I. M. Samudra, T. P. Proyatno K. Nugroho, dan W. Nurarfa.
2017. Keragaman Genetik Rizobakteri Penghasil Asam Indol Asetat Berdasarkan
16S rRna dan Amplifies Ribosoman DNA Restriction Analysis. Jurnal AgroBiogen
Vol. 13(1):25-34.
MCDONALD, J.H and M. KREITMAN. 1991. Adaptive protein evolution at the Adh
locus in Drosophila. Nature Vol. 351: 652 – 654.
Narita, V. A. L. Arum. S. Isnaeni, dan N. Y. Fawzya. 2012. Analisis Bioinformatika
Berbasis WEB untuk Eksplorasi Enzim Kitonase Berdasarkan Kemiripan Sekuens.
Jurnal AL-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi Vol. 1(4): 197 -204.
Rianda, T. 2011. Analisis Sekuensing 16S rRna di Bidang Mikrobiologi. Jurnal
Kedokteran Syiah Kuala Vol. 11(1): 172 – 178.
Seprianto., dan F. D. Wahyuni. 2018. Analisis Bioinformatika Gen Potensial Penyandi
Halichondrinb dari Spons Laut Sebagai Kandidat Anti Kanker. IJOBB Vol. 2(2):
57 – 67.
Tamura K. and M. Nei. 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular
Biology and Evolution. 10 (3) :512 – 526.
Wijaya, H. dan F. Hasanah. 2016. Prediksi Struktur Tida Dimensi Protein Alergen Pangan
dengan Metode Homologi Menggunakan Program Swiss-Model. Biopropal
Industri Vol. 7(2): 83 – 94.
IDENTIFIKASI DAN ANALISIS POHON FILOGENETIK DARI SEKUENS 16S
RIBOSOMAL RNA SERTA PEMBENTUKAN STRUKTUR 3D DARI SEKUENS
PROTEIN MENGGUNAKAN APLIKASI BIOINFORMATIKA

BIOINFORMATIKA

GURUH MAYKA PUTRA

(A154190081)

BIOTEKNOLOGI TANAH DAN LINGKUNGAN

DEPARTEMEN ILMU TANAH DAN SUMBERDAYA LAHAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

DAFTAR ISI ............................................................................................................ ii
DAFTAR TABEL .................................................................................................... ii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................... ii
I. PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ........................................................................................... 1
1.2 Tujuan ........................................................................................................ 2
II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 2
2.1 Identifikasi Gen 16S Ribosomal RNA ....................................................... 2
2.2 Pohon Filogenetik ...................................................................................... 3
2.3 Identifikasi Struktur 3D Protein ................................................................. 3
III. METODE ........................................................................................................ 4
3.1 Alat dan Bahan ........................................................................................... 4
3.2 Metode Pelaksanaan ................................................................................... 6
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 7
4.1 Identifikasi Sekuens DNA ......................................................................... 7
4.2 Pembuatan Pohon Filogenetik.................................................................... 11
4.3 Struktur 3D ................................................................................................. 13
V. KESIMPULAN ............................................................................................... 14
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 15
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Isolat pembanding dari sekuens 16F27 ....................................................... 8
Tabel 2. Isolat pembanding dari sekuens 16R1492 ................................................... 9
Tabel 3. Isolat pembanding dari sekuens 7654.......................................................... 9
Tabel 4. Isolat pembanding dari sekuens 7656.......................................................... 10
Tabel 5. Isolat pembanding dari sekuens 7660.......................................................... 11
Tabel 6. Homologi dari sekuens protein 6j8r ............................................................ 13
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Pohon filogenik sekuens gabungan ......................................................... 12
Gambar 2. Model struktur 3D dan Ramachandran plots protein 6j8r ....................... 13