Laporan Ujian Tengah Semester Praktikum Teknik Analisa DNA Desember 2016

Analisis Hubungan Kekerabatan Sampel Bakteri Berdasarkan Informasi

Sekuens Nukleotida dengan Pendekatan Filogenetik Molekuler
Dicky Kurniawan1, Maroloan Aruan2

1 Mahasiswa Program Studi Bioteknologi dan Neurosains, Fakultas Ilmu Hayati, Universitas Surya
2 Dosen Pengampu Praktikum Teknik Analisa DNA, Universitas Surya

Abstrak

Filogeni sangat fundamental dalam menunjukkan hubungan kekerabatan dan menggambarkan

garis evolusi antar organisme. Filogeni merupakan hasil analisis dari filogenetik, dalam hal ini
filogenetik molekuler yang menganalisis sekuens molekuler biologis dengan metode statistika.
Tulisan ini bertujuan untuk menganalisis hubungan kekerabatan sampel bakteri yang belum
teridentifikasi, berdasarkan informasi sekuens genetiknya dengan pendekatan filogenetik
molekuler. Untuk mencapai hal itu, dilakukan proses penyejajaran lokal sekuens sampel terhadap
sekuens database menggunakan BLAST untuk mendapatkan sekuens referensi, penyejajaran
sekuens sampel dan referensi diikuti pengeditan hasil penyejajarannya dengan BioEdit, dan
konstruksi filogeni dengan metode statistik Maximum Likelihood menggunakan MEGA. Hasil yang
didapatkan menunjukkan sampel bakteri memiliki hubungan kekerabatan terdekat dengan
Pseudomonas putida strain HR5,1 dengan tingkat kepercayaan tinggi (nilai bootstrap: 98%).

Latar Belakang berupa pohon yang menunjukkan garis evolusi

dari spesies, organisme, atau gen berbeda dari
Filogenetik molekuler merupakan cabang
suatu nenek moyang bersama. Filogeni sangat
ilmu yang sedang sangat berkembang, digunakan
bermanfaat dalam mengetahui diversitas
pada hampir seluruh cabang ilmu biologi (Yang
biologis, menyusun klasifikasi, dan menjelaskan
dan Rannala, 2012). Filogenetik molekuler
fenomena yang terjadi selama proses evolusi
merupakan teknik yang mengkombinasikan
(Baum, 2008). Hubungan kekerabatan antar
metode molekuler dan statistik dalam
spesies atau gen dapat dijelaskan dengan filogeni
menentukan hubungan kekerabatan secara
yang merupakan hasil analisis filogenetik
evolusi antar organisme atau gen menggunakan
molekuler (Yang dan Rannala, 2012). Oleh karena
struktur dan fungsi molekul beserta informasi
itu, filogenetik molekuler digunakan sebagai
perubahannya terhadap waktu. Kemajuan
pendekatan untuk membandingkan susunan gen
teknologi dan algoritma-algoritma statistik yang
atau genom antar organisme, dalam percobaan
telah diciptakan membuat proses sekuensing
ini adalah bakteri yang belum teridentifikasi.
genom menjadi lebih cepat, murah, dan efektif.
Informasi yang tersedia merupakan sekuens
Dengan banyaknya data genom yang
nukleotida gen hasil sekuensing DNA dari suatu
dipublikasikan, hal ini membuat filogenetik
sampel bakteri.
molekuler terus berkembang dan memberikan
banyak aplikasi. Tujuan utama analisis filogenetik Pada percobaan ini, hubungan
molekuler adalah menganalisis adanya proses kekerabatan yang ditentukan merupakan bakteri
evolusi dan menyajikannya dalam bentuk pohon yang belum diketahui jenisnya, terhadap spesies
filogenetik yang secara grafis menunjukkan atau strain bakteri lainnya. Tujuan dari penulisan
kekerabatan antar spesies atau gen terhadap artikel ini adalah menganalisis hubungan
waktu (Dowell, 2008). kekerabatan sampel bakteri yang belum
teridentifikasi berdasarkan sekuens genetiknya,
Pohon filogenetik dikenal pula dengan
dengan menggunakan pendekatan filogenetik
istilah filogeni. Filogeni merupakan diagram
Laporan Ujian Tengah Semester Praktikum Teknik Analisa DNA
molekuler. Dengan demikian, identitas sampel
bakteri tersebut dapat diketahui melalui
hubungan kekerabatannya. Identifikasi beserta
karakterisasi dan klasifikasi bakteri sangat
fundamental terhadap banyak bidang, seperti
kesehatan publik, diagnosis klinis, monitoring
lingkungan, keamanan pangan, identifikasi agen
biologis yang membahayakan, dan berbagai
pemanfaatan lainnya dalam bidang bioteknologi
(Emerson et al., 2008).
Dalam mengidentifikasi dan mencari
hubungan kekerabatan bakteri, dilakukan proses
penyejajaran sekuens antar bakteri yang
digunakan. Proses tersebut dikenal dengan
multiple sequence alignment, yaitu penyejajaran
3 atau lebih sekuens biologis dengan panjang
yang sama. Sekuens dapat berupa protein atau
asam nukleat (EMBL-EBI, 2016). Data sekuens
yang terkumpul diuji kesamaannya untuk melihat
kedekatannya satu sama lain. Hasil penyejajaran
sekuens menggunakan algoritma komputasional
dapat digunakan sebagai data untuk membentuk
pohon filogenetik (Emerson et al., 2008).
Untuk mencapai seluruh rangkaian proses
yang dijabarkan, digunakan aplikasi-aplikasi
berupa BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool), BioEdit, dan MEGA (Molecular Evolutionary
Genetics Analysis). BLAST merupakan program
online yang menemukan daerah lokal yang sama
antara sekuens biologis (dalam hal ini nukleotida)
dengan sekuens database untuk mengidentifikasi
kelompok gen tertentu dan menunjukkan
kekerabatan evolusi antar sekuens setelah
memperhitungkan signifikansi statistik (NCBI,
2016). BioEdit merupakan aplikasi yang secara
mudah dapat digunakan untuk menganalisis dan
memanipulasi atau mengedit sekuens biologis
yang disejajarkan (Informer Technologies, Inc.,
2016). Aplikasi terakhir, yaitu MEGA merupakan
perangkat lunak yang dapat digunakan untuk
menganalisis sekuens biologis secara komparatif,
menjalankan proses penyejajaran, mengestimasi
laju dan pola evolusi molekuler, menguji
hipotesis evolusioner, dan membuat pohon
filogenetik (Kumar et al., 2008).
Desember 2016
Metodologi
1. Pencarian Sekuens Referensi dengan BLAST
Sampel yang digunakan adalah sekuens
genetik bakteri yang belum terindentifikasi,
dengan nama Bakteri Kelompok 1 Pagi
Biobrain14. Aplikasi BLAST nukelotida
(nucleotide BLAST) dibuka melalui situs NCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekuens bakteri dimasukkan pada kolom fasta
dan dijalankan proses BLAST. Kemudian dipilih 10
sekuens spesies atau strain bakteri pembanding
berbeda dengan persentase identity tertinggi dan
jenis gen yang sama dari hasil BLAST. Mengunduh
keseluruhan sekuens dalam format fasta (aligned
sequences), diikuti pemilihan 1 sekuens
outgroup. Keseluruhan sekuens (1 sampel, 10
pembanding, 1 outgroup) dimasukkan dalam 1
notepad dan disimpan dalam bentuk fasta (.fas).
2. Penyejajaran (Multiple Sequence Alignment)
dan Pengeditan Sekuens dengan BioEdit.
Aplikasi yang digunakan berupa BioEdit
7.2. Dokumen dalam bentuk fasta yang telah
dibuat sebelumnya dibuka dengan aplikasi
BioEdit dan proses penyejajaran sekuens
dijalankan (Accesorry Application > ClustalW
Multiple alignment). Hasil penyejajaran sekuens
dipotong bagian depan dan belakang (blok dan
klik backspace) dengan mengubah mode menjadi
edit. Dokumen berisi hasil penyejajaran sekuens
yang telah diedit, disimpan dalam bentuk fasta.
3. Pembuatan Pohon Filogenetik dengan MEGA.
Aplikasi yang digunakan berupa MEGA6.
Dokumen yang telah diedit sebelumnya dibuka
dengan aplikasi MEGA (Align > Edit/Build
Alignment > Retrieve sequences from a File) dan
konfirmasi pembuatan pohon filogenetik
dilakukan (Data > Phylogenetic Analysis).
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan
metode statistik Maximum Likelihood (Phylogeny
> Construct/Test Maximum Likelihood Tree).
Digunakan tes filogeni berupa metode bootstrap
(jumlah replikasi sebanyak 500x) dan model
substitusi Tamura-Nei. Pohon filogenetik
dievaluasi dan disimpan dalam format gambar.
Laporan Ujian Tengah Semester Praktikum Teknik Analisa DNA
Hasil
Figur 1. Pohon filogenetik yang menunjukkan kekerabatan sampel bakteri dengan bakteri lainnya
berdasarkan analisis filogenetik molekuler menggunakan metode Maximum Likelihood.
Pembahasan
Proses awal yang dilakukan adalah
memasukkan sekuens genetik bakteri Kelompok
1 Pagi Biobrain14 ke kolom program BLAST
Nukleotida. BLAST Nukleotida digunakan untuk
melakukan penyejajaran lokal sekuens
nukleotida sampel terhadap database di NCBI
untuk mendapatkan sekuens referensi yang
dapat digunakan, berdasarkan similaritas antar
sekuens (NCBI, 2016). Proses tersebut
memberikan hasil berupa banyak jenis sekuens
gen atau genom bakteri dengan genus
Pseudomonas. Dengan demikian, diperoleh
informasi awal bahwa sampel dalam percobaan
merupakan bakteri bergenus Pseudomonas.
Teknik dalam mengidentifikasi bakteri
berbasis sekuens, umumnya menggunakan
informasi berupa gen pengkode spesifik
(Emerson et al., 2008). Untuk itu, dipilih 10
sekuens gen pengkode 16S rRNA bakteri berbeda
dengan nilai identitas tertinggi, yaitu 99% (9
bakteri) dan 100% (1 bakteri). Dalam analisis
filogenetik bakteri, gen 16S rRNA paling sering
digunakan karena secara universal ditemukan
pada setiap bakteri, fungsi biologisnya yang
diketahui, dan memiliki laju evolusi lambat (Liu,
2011). Satu buah outgroup digunakan sebagai
pembanding, dengan ketentuan berbeda genus
dalam 1 famili. Famili dari Pseudomonas adalah
pseudomonadaceae, dengan salah satu genus
Desember 2016
lainnya adalah Azotobacter (GBIF Secretariat,
2016). Sekuens gen 16S rRNA Azotobacter
tropicalis strain KBS digunakan sebagai outgroup.
Kesebelah sekuens diunduh dan dimasukkan
dalam 1 dokumen notepad yang sama dengan
sekuens sampel. Dokumen disimpan dalam
format fasta agar dapat dibaca melalui BioEdit.
Proses selanjutnya adalah penyejajaran
keduabelas sekuens. Dokumen fasta sebelumnya
dibuka pada BioEdit. Proses penyejajaran
dilakukan dengan mengklik Accesorry Application
kemudian ClustalW Multiple alignment. ClustalW
merupakan sistem yang digunakan secara luas
dalam meyejajarkan sekuens nukleotida dengan
metode progresif. Sekuens homolog dengan nilai
terbaik disejajarkan terlebih dahulu, diikuti
sekuens yang berjarak kemiripan lebih jauh
hingga penyejajaran global diperoleh (Tamura et
al., 2011). Hasilnya menunjukkan tidak terlalu
banyak perbedaan antara 10 sekuens bakteri
Pseudomonas dan sampel. Perbedaan lebih
mencolok terlihat pada sekuens Azotobacter
tropicalis. Sekuens yang telah disejajarkan,
dipotong bagian depan dan belakang agar
memiliki panjang yang sama untuk kemudian
dapat dikonstruksi filogeninya, setelah
mengubah mode menjadi edit. Hasil akhir
pengeditan sekuens disimpan untuk proses
selanjutnya.
Proses terakhir yang dilakukan adalah
konstruksi pohon filogenetik. Dokumen yang
Laporan Ujian Tengah Semester Praktikum Teknik Analisa DNA
telah diedit sebelumnya dibuka dengan aplikasi
MEGA. Data tersebut dianalisis filogenetiknya
dengan mengklik tab Data kemudian
Phylogenetic Analysis. Pembuatan pohon
dilakukan pada jendela utama dengan mengklik
simbol Phylogeny kemudian memilih
Construct/Test Maximum Likelihood Tree.
Maximum Likelihood merupakan metode
statistik berbasis karakter yang membandingkan
seluruh sekuens dalam penyejajaran untuk
memperhitungkan nilai kemungkinan pada setiap
pohon (Yang dan Rannala, 2012). Metode ini
mempertimbangkan semua kemungkinan jumlah
perubahan/mutasi pada sekuens untuk setiap
pohon, oleh sebab itu cocok dalam
mengkonstruksi filogeni dengan sekuens
berjumlah kecil. Digunakan tes filogeni berupa
metode bootstrap yang melakukan resampling
berulang kali untuk melihat tingkat validitas
susunan pohon, dengan jumlah replikasi
sebanyak 500x agar mempersingkat waktu
konstruksi (Dharmayanti, 2011).
Pohon filogenetik yang diperoleh
menunjukkan dekatnya kekerabatan antar
bakteri Pseudomonas. Azotobacter tropicalis
memiliki kekerabatan terjauh karena merupakan
outgroup dalam filogeni. Terlihat pola yang
sangat jelas di mana sampel bakteri Kelompok 1
Pagi Biobrain14 membentuk grup monofiletik
dengan Pseudomonas putida strain HR5,1. Nilai
bootstrap menunjukkan angka sebesar 98%,
mengindikasikan reliabilitas kekerabatan yang
sangat dekat antar kedua bakteri tersebut yang
berasal dari nenek moyang yang sama.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil analisis filogenetik
molekuler menggunakan data sekuens
nukleotida, sampel bakteri Kelompok 1 Pagi
Biobrain14 memiliki hubungan kekerabatan
terdekat terhadap Pseudomonas putida strain
HR5,1 dengan tingkat reliabilitas yang sangat
tinggi (nilai bootstrap: 98%).
Referensi
Baum, David. 2008. Reading a Phylogenetic
Tree: The Meaning of Monophyletic
Groups. Nature Education 1 (1): 190.
Desember 2016
Dharmayanti, N.L.P. Indi. 2011. Filogenetika
Molekuler: Metode Taksonomi Organisme
Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa 21
(1): 1-10.
Dowell, Karen. 2008. Molecular Phylogenetics: An
Introduction to Computational Methods and
Tools for Analyzing Evolutionary
Relationships. Orono: University of Maine.
EMBL-EBI. 2016. Multiple Sequence Alignment.
[online]. Tersedia:
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/. Diakses
7 Desember 2016.
Emerson, David, Liane Agulto, Henry Liu, dan
Liping Liu. 2008. Identifying and
Characterizing Bacteria in an Era of
Genomics and Proteomics. BioScience
58 (10): 925-936.
GBIF Secretariat. 2016. GBIF Backbone
Taxonomy. [online].
Tersedia: http://www.gbif.org/species/560
7. Diakses 8 Desember 2016.
Informer Technologies, Inc., 2016. BioEdit 7.2:
Publishers Description. [online]. Tersedia:
http://bioedit.software.informer.com/7.2/.
Diakses 7 Desember 2016.
Kumar, S., M. Nei, J. Dudley, dan K. Tamura. 2008.
MEGA: A Biologist-Centric Software for
Evolutionary Analysis of DNA and Protein
Sequences. Briefings in Bioinformatics 9
(4):299-306.
Liu, Dongyu (ed.). 2011. Molecular Detection of
Human Bacterial Pathogens. CRC Press.
National Centre for Biotechnology Information
(NCBI). 2016. Basic Local Alignment Search
Tool. [online]. Tersedia:
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
Diakses 7 Desember 2016.
Tamura, Koichiro, Daniel Peterson, Nicholas
Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei, dan
Sudhir Kumar. 2011. MEGA: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis. [online].
Tersedia:
http://www.megasoftware.net/manual.pdf.
Diakses 6 Desember 2016.
Yang, Ziheng dan Bruce Rannala. 2012.
Molecular Phylogenetics: Principles and
Practice. Nature Reviews Genetics 13: 303-
314.
Laporan Ujian Tengah Semester Praktikum Teknik Analisa DNA Desember 2016

Lampiran

Figur 1. Hasil penyejajaran (multiple sequence alignment) keseluruhan sekuens nukleotida bakteri
yang digunakan.

Figur 2. Pohon konsensus yang terbentuk dengan analisis filogenetik molekuler.