ALFI DATIN ZAUQIAH (21109018) PROSES PEMBENTUKAN DAN MEKANISME SILENCING miRNAs DAN siRNAs

1. Carthew R.W., Sontheimer E.J., (2009) : Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs, Cell, 136, 642-655. 2. Xu J., Zeng J.Q., Wan G., Hu G.B., Yan H.,Ma L.X. (2009) : Construction of siRNAs/miRNAs expression vectors based on a one step PCR process, BMC biotechnology, 9 (53).

Terdapat mekanisme lain pada pengaturan posttranskripsi yang berperan dalam meregulasi ekspresi beberapa gen. Mekanisme ini terjadi di sitoplasma berfungsi untuk mengontrol stabilitas atau lokalisasi dari mRNA atau translasi mRNA menjadi protein. Mekanisme ini dikontrol oleh ssRNA yang berukuran pendek (20-30 nukleotida) yang disebut micro RNAs (miRNAs) dan short interfering RNAs (siRNAs). Fragmen miRNAs berperan sebagai regulator gen-gen endogen sedangkan siRNAs dapat mendegradasi mRNA. siRNA terlibat dalam proses yang disebut RNAi (RNA interference) yakni proses pertahanan seluler yang penting untuk melawan infeksi virus dan transposisi yang berlebihan dari transposon. Perbedaan yang signifikan antara miRNAs dan siRNAs adalah: 1. miRNAs : - endogen dan mengekspresikan produk genom itu sendiri - berasal dari prekursor stem loop dengan karakter rantai ganda yang kurang lengkap 2. siRNAs : - eksogen dan muncul karena diinduksi oleh virus atau transposon - berasal dari potongan segmen dsRNAs yang panjang dan lengkap. RNAi merupakan mekanisme yang potensial untuk silencing ekspresi gen target pada sel mamalia dan diharapkan dapat digunakan sebagai terapi untuk pengobatan penyakit. Penelitian mengenai pembuatan vektor ekspresi siRNAs dan miRNAs membutuhkan sintesis oligonukleotida yang panjang, sehingga mahal dan rentan terhadap kemungkinan mutasi. Oleh karena itu, pada jurnal kedua dijelaskan mengenai pembuatan vektor ekspresi siRNA dan miRNA dengan satu tahap PCR. Pertama pembuatan primer yang lebih pendek untuk menghasilkan struktur ekspresi linear oleh PCR. Kemudian produk PCR ditransformasi ke E.coli dan diubah menjadi vektor fungsional secara in vivo dengan rekombinasi homolog. Metode ini berhasil membuat lebih dari 500 vektor ekspresi siRNA/miRNA yang fungsional. A. Jalur umum untuk semua miRNAs dan siRNAs. Prekursor dsRNA dipotong oleh enzim Dicer menjadi fragmen pendek dan rantai tunggal. Rantai tunggal akan mengikat Argounate untuk proses pengenalan target. Setelah target RNA dikenali, akan mengekspresikan mekanisme yang berbeda-beda. B. Struktur dan domain pada enzim Dicer. C. Struktur dan domain pada protein Argounate (Ago).

Proses pembentukan siRNAs

Beberapa transkrip yang berbeda dapat membuat dsRNA, yang kemudian akan dipotong oleh Dicer menjadi siRNAs. Si RNAs terdiri atas guide strand (merah) yang akan bergabung dengan siRISC dan passenger strand (biru) yang akan didegradasi. Semua siRISC mengandung siRNA yang terikat dengan protein Ago. Target RNA kemudian dikenali oleh pasangan basa siRNAs dan terjadi proses gene silencing.

Mekanisme silencing oleh siRNA

~Selama proses RNAi, siRISC akan mengenali mRNA komplementer secara keseluruhan (kanan bawah) atau sebagian (tengah atas). Pada komplementer yang sempurna, Ago mengkatalisis pemotongan mRNA. Setelah pemotongan, siRNAs disintesis kembali sedangkan mRNA akan didegradasi. ~Mekanisme lain untuk silencing gene dengan proses menghambat translasi dan degradasi eksonuklease seperti yang dilakukan miRNAs. ~Selain itu siRISC dapat berasosiasi dengan hasil transkripsi dan RNA polimerase untuk membentuk heterokromatin. Pembentukan kromatin ini pada tanaman diinduksi oleh aktivasi DMT (DNA metiltransferase) sedangkan pada hewan diaktivasi oleh HMT (Histon metiltransferase) ~Pada eukaryot selain mamalia dan insekta, pengenalan target oleh siRISC menginduksi sintesis dsRNA dan siRNA skunder oleh enzim RdRP (tengah bawah). dsRNAs akan diproses oleh Dicer menjadi siRNAs yang kemudian dapat berasosiasi kembali dengan siRISC.

Pembentukan miRNAs pada tanaman dan hewan

Pada tanaman. Terbentuk capped dan poliadenilasi pada primiRNAs, Dcl 1 memproses pri-miRNAs berturutturut. Bagian yang pertama dipotong bisa loop terminal atau segmen flanking. Kemudian miRNAs dimetilasi dan dikeluarkan dari nukleus. Pada hewan. Pri-miRNAs diproses oleh Drosha dengan bantuan DGCR8 untuk menghasilkan premiRNAs. Pre-miRNAs kemudian ditranspor keluar inti, hairpin loop akan dipotong oleh Dicer untuk membentuk ds miRNA, dan berikatan dengan miSIRC. Hanya satu rantai yang akan stabil berasosiasi dengan kompleks miRISC.

Mekanisme silencing oleh miRNAs

mRNA membutuhkan faktor inisiasi dan unit ribosomal serta akan membentuk struktur sirkular untuk meningkatkan translasi (atas). Ketika miRISC terikat dengan mRNA maka berbagai mekanisme penghambatan yang mungkin terjadi: ~ menghambat pembentukan cap (kiri atas). ~ menghambat pengikatan 60S (kiri bawah). ~ menginduksi deadenilasi dan menghambat sirkulisasi mRNA. ~ menginduksi terlepasnya ribosom sebelum proses selesai. ~ meningkatkan degradasi DNA dengan menginduksi deadenilasi.