Validasi Metode Mikrobiologi

VALIDASI & VERIFIKASI METODA
MIKROBIOLOGI
Intan Nurmala Dewi, STP

1
Penentu Kehandalan Analisis Mikrobiologi
Metode Analisa Peralatan Analis/Pelaksana
• Metode Standar • Neraca

• Pengetahuan
• Modifikasi • LAF
• Ketrampilan/kompeten
• Penyederhanaan • Pipet
• Ketelitian
• Inkubator
• Autoklaf
VALIDASI & VERIFIKASI TRAINING & UJI

KALIBRASI
METODE KOMPETENSI
2
Jenis Metode Uji
• Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll

• Metode Resmi : Farmakope, EPA, dll
• Metode yang dikembangkan oleh organisasi profesional
yang memiliki reputasi nasional dan internasional : AOAC
• Metode Pustaka : Journal
• In house methode
• Metode Modifikasi
3
Pemilihan Metode
Faktor yang menjadi pertimbangan :
 Status metode
 Apakah lab. menguasai teknologinya ?
 Apakah SDM/Analis kompeten ?
 Biaya & waktu yang dibutuhkan
 Metode mudah diaplikasikan
 Kondisi akomodasi & peralatan lab. memadai ?
4
Validasi
• Validasi adalah konfirmasi

melalui pengujian dan
pengadaan bukti yang
objektif bahwa metode
tersebut telah memenuhi
persyaratan yang telah
ditentukan.
5
Mengapa dilakukan Validasi ???
 Persyaratan ISO/IEC 17025-2017 klausal 7.2.2

 Banyak lab. menggunakan metode uji dari manual book/alat.
 Lab. di daerah kesulitan mendapatkan reagensia/media tertentu
sehingga lab memangkas metode standar.
 In house method sebagai alternatif yaitu dengan memodifikasi
metode standar.
6
Kapan Validasi dilakukan ???
Apabila Laboratorium menggunakan ;

 Metode tidak baku
 Metode baku yang dimodifikasi
 Metode baku yang digunakan diluar lingkup yang dimaksud
 Metode yang dikembangkan oleh Laboratorium
7
Verifikasi
• Verifikasi metode adalah

konfirmasi melalui pengujian
dan pengadaan bukti yang
obyektif bahwa persyaratan
yang ditentukan oleh metode
yang bersangkutan telah
dipenuhi
8
Kapan Verifikasi dilakukan???
 Apabila laboratorium menggunakan metode
baku yang sudah divalidasi oleh organisasi yang
berwenang.
9
Mengapa metode standar harus
diverifikasi ???
 Lab harus meyakinkan bahwa metode tsb dapat diterapkan
terhadap jenis sampel yang diuji
 Lab dapat mengetahui masalah yang timbul dalam
menerapkan metode tersebut
 Lab dapat mengetahui unjuk kerja analis dalam melakukan
pengujian dengan metode tersebut
 Lab dapat menunjukkan bahwa pengujian dilakukan
dengan benar (memenuhi persyaratan tertentu)
10
Metode pengujian
 Kualitatif : menentukan ada atau tidaknya

mikroorganisme target pada sampel uji. Hasil uji
umumnya dinyatakan sebagai positif atau negatif
 Kuantitatif : menentukan jumlah mikroorganisme pada

sampel uji baik secara langsung (jumlah koloni) atau
tidak langsung (MPN, absorbance, dll)
11
METODA PENGUJIAN
1. Kuantitatif
 Hitungan Cawan
Pour plate : TPC, Y&M, Coliform, Enterobacteriaceae,dll.
Spread Plate : Y&M, S.aureus, B.cereus, dll.
2. Semi kuantitatif
 MPN : Coliform, E.coli, dll.
3. Kualitatif
 Isolasi : Salmonella, L.monocytogenes, dll.
12
Acuan validasi metode kuantitatif
 Sac-Singlas, 2002. Guidance Notes C&B and ENV 002.
Method Validation of Microbiological methods
 ISO16140:2003 (Amd2011), Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs —Protocol for the Validation of
Alternative Methods
 AOAC, 2012, International Methods Committee
Guidelines for Validation of Microbiological Methods for
Food and Environmental surfaces
 NordVal International Protocol for the validation of
microbiological alternative (proprietary) methods,
against a reference method. 2 June 2016
13
Acuan validasi metode kualitatif
 ISO16140:2003 (Amd2011), Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs —Protocol for the Validation of
Alternative Methods
 AOAC, 2012, International Methods Committee Guidelines
for Validation of Microbiological Methods for Food and
Environmental surfaces
 US-FDA 2015, Guidelines for the Validation of Analytical
Methods for the Detection of Microbial Pathogens in Foods
in Feeds. 2nd edition
 NordVal International Protocol for the validation of
microbiological alternative (proprietary) methods, against a
reference method. 2 June 2016.
14
Validasi & Verifikasi Metode Kuantitatif
Method Validation of Microbiological Methods,

Guidance Note : C & B and ENV 002. Singapore
Acreditation Council,
July 2002
15
Umum
 Lingkup pedoman validasi metode mikrobiologi untuk makanan, air dan
produk farmasi, dengan penekanan khusus pada metode kuantitatif di
mana perkiraan kuantitatif didasarkan pada penghitungan partikel pada
dasar pertumbuhan (multiplikasi) menjadi koloni atau kekeruhan.
 Prinsip-prinsip dan prosedur dalam lingkup ini umumnya dikenal sebagai
jumlah total koloni, jumlah paling mungkin (MPN) dan jumlah koloni
organisme target khusus pada media selektif.
 Pedoman ini tidak berlaku untuk validasi metode cepat (rapid methods)
yang tergantung pada pengukuran produk atau perubahan karena aktivitas
mikroba tetapi tidak mengatasi deteksi partikel individu dan metode
pengujian mikrobiologi menggunakan mikroorganisme sebagai alat uji.
Singapore Acreditation
Council, July 2002. 16
 Laboratorium diharapkan menggunakan referensi/metode standar yang
dipublikasikan untuk pengujian mikrobiologi.
 Laboratorium yang menggunakan referensi/metode standar tidak
diharuskan untuk menunjukkan validasi dari metode ini, tetapi hanya perlu
menunjukkan validasi sekunder (juga disebut verifikasi).
 Verifikasi diperlukan pengguna laboratorium hanya untuk memverifikasi
bahwa metode dapat memenuhi tujuan dan persyaratan untuk aplikasi
analisis yang dimaksud.
 Dalam situasi di mana laboratorium untuk mengembangkan in-house
metode, membuat modifikasi standar metode / referensi atau
menggunakannya di luar penggunaan yang dimaksudkan, laboratorium
harus melakukan validasi metode.
 Mikroorganisme acuan yang digunakan untuk validasi harus diperiksa
kemurniannya dengan cara plating permukaan non-selektif dan selektif
media yang tepat dan pemeriksaan mikroskopis. Uji kemurnian kultur
dapat menggunakan metode konvensional atau rapid methods yang
disetujui untuk digunakan dalam referensi/metode standar jika
diperlukan.
Parameter Validasi Metode Analisis
Mikrobiologi
1. Akurasi
2. Presisi (repeatability, reproducibility, dan intermediate
precision)
3. Sensitifitas & Spesifisitas
4. Selektifitas
5. Relatif recovery rate
6. Rentang hitung yang diterima (acceptable), batas atas dan
batas bawah dari rentang perhitungan
7. Ketangguhan (Robustness)
1. Akurasi
 Akurasi adalah ketepatan/kedekatan dari suatu
metode pengujian antara nilai hasil uji yang
diukur dengan nilai benar/nilai konvensional/nilai
acuan.
 Akurasi dapat dilakukan dengan :
1. Penggunaan bahan acuan atau bahan acuan
kerja yang tertelusur.
2. Bahan in house (disiapkan oleh laboratorium).
3. Membandingkan hasil dari metode yang sedang
divalidasi dengan hasil dari metode kedua yang
telah diketahui akurasinya.
20
2. Presisi (Keseksamaan)
 Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian

individual dengan hasil rata-rata pengujian yang dilakukan
berulang pada sampel yang homogen.
 Repeatability (within lab), Reproducibility (between lab),
Intermediate precision (within laboratory variation)
Parameter :
 Relatif Standar Deviasi
 Koefisien Variasi
 Repeatability (keterulangan) : variasi dalam independent test
terhadap sampel yang sama oleh analis yang sama dengan interval
waktu yang singkat.
 Reproducibility (ketertiruan) : variasi dalam independent test
terhadap sampel yang sama namun dilakukan oleh analis dan
laboratorium yang berbeda.
 Intermediate precision (keseksamaan antara) : variasi hasil
laboratorium pada hari yang berbeda, atau analis yang berbeda,
atau alat yang berbeda di dalam laboratorium yang sama.
 Dilakukan 15 kali pada 3 level konsentrasi (rendah, sedang, tinggi).
3. SENSITIFITAS & SPESIFISITAS
1. Sensitifity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil positif
terhadap sampel presumtif positif.
2. Spesificity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil negatif
terhadap sampel presumtif negatif.
3. False positive rate : pengamatan hasil positif yang salah.
4. False negative rate : pengamatan hasil negatif yang salah.
 Karakteristik kinerja ini berlaku untuk metode selektif dan dilakukan
verifikasi dugaan koloni positif dan negatif pada cawan atau
pertumbuhan positif dan negatif pada tabung (MPN).
 Validasi : setidaknya gunakan tiga strain mikroorganisme
dalam proses spiking.
 Verifikasi : gunakan satu atau lebih mikroorganisme
dalam proses spiking.
 Validasi : semua presumtif positif dan negatif harus
dikonfirmasi.
 Verifikasi : hanya presumtif positif yang dikonfirmasi.
24
4. SELEKTIFITAS
1. Selektifitas nyata : fraksi jumlah koloni (logaritma)

yang diverifikasi dari target yang benar.
2. Selektifitas semu : fraksi dari koloni terduga (dugaan
positif) dalam logaritma diantara jumlah koloni.
25
 Relatif recovery rate : membandingkan recovery antara metode yang diuji dengan
metode standar.
 Dilakukan setidaknya 5 kali pada konsentrasi mikroba uji, dan dilakukan triplo dari
masing-masing dilusi.
Parameter :
Recovery (Perolehan Kembali)
Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan kultur acuan pada
konsentrasi tertentu dalam suatu matriks contoh.
 Sebaiknyan gunakan contoh yang tidak mengandung sample yang tidak tercemar
(jika diperlukan lakukan sterilisasi).
 Laporakan hasil rata-rata dari masing-masing metode dan hitung persentasi
antara metode uji dan metode standar. Singapore Acreditation
Contoh perhitungan akurasi & Relatif Recovery Rate
6. Rentang Hasil Pengujian
 Rentang hasil pengujian menunjukkan nilai terendah dan nilai
tertinggi dari pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat
dan seksama.
 Batas rendah (Lower limit)
Hasil pengujian terendah yang ditandai dengan galat analisis
yang diperbolehkan tidak lebih dari 20%.
 Batas tertinggi (Upper limit)
Hasil pengujian koloni tertinggi yang masih dapat dihitung
dengan cermat dan seksama, galat analisis 15%.
 Rentang hasil pengujian (lempeng agar) :
Makanan & farmasi : 25-250 koloni
Sampel air : 30-300 koloni
Kapang (A.brasilliensis) : 8-80 koloni
7. Ketangguhan (Robustness)
 Robustness adalah kemampuan metode untuk tetap tidak
berpengaruh oleh variasi/keragaman parameter metode (misal :
waktu inkubasi, suhu inkubasi) dan menunjukkan hasil yang
reliable selama metode tersebut digunakan.
 Efek waktu inkubasi pada koloni hitungan bisa ditentukan dengan
cara menghitung sama cawan sampel dua kali pada dua waktu
inkubasi ekstrem yang ditentukan oleh metode.
 Efek suhu inkubasi pada koloni hitungan bisa ditentukan dengan
menginkubasi piring duplikat dari sampel yang sama pada kedua
suhu inkubasi ekstrim ditentukan oleh metode.
 Analisis statistik seperti Student t-test dapat digunakan untuk
melihat perbandingan cawan paralel diperoleh dari dua inkubasi
ekstrem waktu atau suhu inkubasi.
Tahapan Validasi/Verifikasi
Memilih Organisme Uji

Memilih matriks sample
Melakukan pengujian sesuai prosedur
 Interpretasi hasil
31
Syarat,,,,
 Menggunakan peralatan yang terkalibrasi

 Dilakukan oleh personil yang kompeten
 Media/Reagent yang digunakan sesuai
spesifikasinya.
 Kondisi lingkungan memadai
32
Memilih Organisme Uji
Sesuai KAN-TN-LP 02
 MO acuan berasal dari koleksi yang diakui
 Menjamin ketertelusuran
 Dipelihara oleh Penanggungjawab MO acuan
 Pemeliharaan sebagai berikut :
33
Strain (ATCC, NTCC, dll)
Subkultur sekali
*
Persediaan acuan
(Liofilisasi)
Dicairkan
Kultur kerja
*
(Penggunaan rutin)
* : uji kemurnian 34
Memilih Organisme Uji
 Kultur acuan yang dinyatakan sebagai kontrol positif harus

merupakan salah satu dari strain tersebut.
 Strain yang lain dipilih dari hal berikut :
• Strain dari organisme target yang diisolasi oleh
laboratorium dari sampel terdahulu dalam matrik yang
diperiksa.
• Strain dari organisme target yang dikumpulkan oleh kultur
collection.
35
Memilih Matrik Sampel
Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih sampel yang

mewakili lingkup variasi yang akan ditemui dalam matriks yang
telah ditentukan.
Dapat menggunakan sample yang tercemari secara alami atau
dapat menggunakan sample yang dicemari (spike sample).
Perhatian harus diutamakan pada mendeteksi jumlah dan
homogenitas kontaminan.
36
Persiapan matriks contoh Validasi & Verifikasi
1. Disiapkan sampel
2. Dilakukan spiking kultur
3. Dilarutkan dengan 9 bagian pelarut
4. Dihomogenisasi
37
Metode Spike Sample
Menghitung Populasi pada Biakan Murni
Hari ke 1
1 loop Inkubasi selama

18-24jam pada
suhu 35-37 0C
Biakan murni BHI-
dalam agar miring Broth/media
lainnya 10 ml
38
Metode Spike Sample

Hari ke 2
Dst. 10-7 10-8 10-9
10-1 10-2 10-3
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
1 ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
10 ml 1 ml
Hit. Jumlah Inkubasi selama 48 jam

koloni/ml pada suhu 36±1 0C
39
Metode Spike Sample
Hari ke 4
Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri
Ulangan 10-7 10-8 10-9 Hasil
1 241 24 3
2,4 x 109 kol/ml
2 238 22 2
40
Pembuatan Spike Populasi Rendah
Dst
10-1 10-2 . 10-8
90 ml
1 ml 1 ml 10 ml sample
1 ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml Didapatkan 1 : 10 spike

10 ml sample populasi rendah
(2 kol/ml atau/gr)
41
Pembuatan Spike Populasi Sedang
Dst.
10-1 10-2 10-7
90 ml
1 ml sample
1 ml 1 ml 10 ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml

10 ml Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi sedang
(2,0 x 101 kol/ml atau/gr)
42
Pembuatan Spike Populasi Tinggi
10-1 10-2 10-6
90 ml
1 ml 1 ml 10 ml sample
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
1 ml Didapatkan 1 : 10
10 ml
spike sample
populasi tinggi
(2,0 x102 kol/ml atau /gr)
43
1. Akurasi
Kuantitatif (Hitungan Cawan)
1. Siapkan sampel yang sudah di spike dengan mikroorganisme,
lalu lakukan pengujian secara duplo, lakukan minimal 6x
ulangan.
Perhitungan
H x 100 %
A
H = Hasil pengujian dengan metode (sample + spike) -
sample
A = Hasil sebenarnya dari MO target (spike)
Catatan : Gunakan sample yang tidak mengandung MO
2. Presisi
 Siapkan sampel yang sudah di spike dengan mikroorganisme

sebanyak minimal 15 sampel (perkiraan populasi pada contoh :
rendah, sedang, tinggi).
 Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan
metode spike sample) atau tidak mengandung organisme target.
 Hitung RSD dari masing-masing populasi dan gabungan semua
populasi.
Catatan : Jika dilakukan oleh analis berbeda, dapat dihitung presisi

dari masing-masing analis untuk mengetahui kinerja analis
 Hitung presisi dari masing-masing level dan gabungan,
dengan menggunakan rumus :
 ((Log a – log b) / x1)2

RSD =
2n
CV (coefisien of variation) = RSD x 100%

 Keberterimaan :
RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02)
CV = max. 10 %
3. Sensitifitas, Spesifisitas, Selektifitas
Kuantitatif (Hitungan Cawan) & Tabung MPN

 Siapkan sampel yang sudah di spike dengan setidaknya 3 strain
(validasi) atau 1 strain (verifikasi) mikroorganisme.
 Buat pengenceran dua kali lipat atau sepuluh kali lipat dari
sampel alami.
 Lakukan pengujian sampel sesuai dengan metode uji.
 Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan
metode spike sample) atau tidak mengandung organisme
target.
 Hitung jumlah koloni khas dan tidak khas pada cawan atau
hitung jumlah tabung positif (MPN).
Konfirmasi
 Validasi
Semua presumptive positive dan negative harus
dikonfirmasi.
 Verifikasi
Semua presumptive positive yang dikonfirmasi.
 Hitung Sensitifity, Spesificity, False Positif, False Negatif, dan
Efficiency
Perhitungan
Confirmed Presumtive
Positif Negatif
A B
Positif (positive) (false negative)
Negatif C D
(false positive) (negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100

Spesifitas = D/(C+D) x 100
False positive rate = c/(a+c) x 100
False negatif rate = b/(b+d) x 100
Jumlah tabung : a + b + c + d = n
Efficiency = (a+d)/n x 100
1. Siapkan sampel yang sudah di spike dengan masing-masing 5

strain dan dikondisikan merusak mikroorganisme sebanyak 10
sampel, dan sampel yang sudah di spike tanpa dikondisikan
merusak mikroorganisme sebanyak 10 sampel.
2. Lakukan pengujian :
• 10 stressed sampel : masing-masing 5 sampel diuji
menggunakan metode yang diuji dan menggunakan metode
standar.
• 10 non-stressed sample : masing-masing 5 sampel diuji
menggunakan metode yang diuji dan menggunakan metode
standar.
 Hitung Relative Recovery Rate masing-masing kondisi
sampel :
Relative Recovery Rate = Test Method x 100
Reference Method
 Keberterimaan : Hasil metode uji sama dengan metode

standar atau lebih baik dari metode standar.
Contoh perhitungan Relatif Recovery Rate
5. Robusstness

 Siapkan sampel yang tercemar secara alami atau sampel yang
sudah di spike dengan mikroorganisme sebanyak 8 sampel.
 Lakukan pengujian sampel menggunakan metode uji dan
metode reference.
 Untuk melihat efek waktu : inkubasi 2 sampel (duplo) pada
waktu batas atas dan 2 sampel (duplo) pada waktu batas
bawah.
 Untuk melihat efek suhu : inkubasi 2 sampel (duplo) pada suhu
batas atas dan 2 sampel (duplo) pada suhu batas bawah.
 Hitung statistik untuk melihat beda nyata (uji t).
Validasi Metode Kualitatif
ISO 16140:2003
Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs –
Protocol for The Validation of Alternative Methods
54
Metode pengujian dalam acuan validasi
 Umumnya adalah metode cepat

 Diajukan untuk mendapatkan pengakuan secara
internasional
 Dapat digunakan untuk melakukan pengujian dalam
rangka pengendalian mutu (Official control)
ISO 16140:2003
55
Lingkup
 ISO 16140:2003 menetapkan prinsip-prinsip umum dan
protokol teknis untuk validasi metode alternatif di bidang
analisis mikrobiologi sampel pangan, pakan
hewan,lingkungan dan sampel ternak.
 Penetapan prinsip-prinsip umum dari sertifikasi metode
alternatif berdasarkan protokol validasi ini.
 Metode alternatif digunakan sebagai metode rutin di lab
internal tanpa harus merujuk ke persyaratan ekternal yang
lebih tinggi dari QA.
ISO 16140:2003
56
Prinsip-prinsip Umum Validasi dan
Sertifikasi Metode Alternatif
1.Protokol Validasi
Terdiri dari 2 fase :
a.Studi perbandingan metode antara metode alternatif dengan
metode acuan yang dilakukan oleh lab yang mapan.
b.Studi interlaboratorium dengan 2 metode tersebut.
2. Prinsip Sertifikasi
a.Bila metode alternatif diperlukan sertifikasi, protokol validasi harus
dipenuhi.
b.Pabrikan harus menerapkan quality sytem untuk line produksi
berdasarkan European Standar atau yang setara (contohnya ISO
9001)
c. Verifikasi reguler dari kualitas metode alternatif yang sudah
disertifikasi dapat dilakukan setelah sertifikasi diakui. Audit
dilakukan secara teratur untuk memverifikasi persyaratan QA dan
products production control.
ISO 16140:2003
57
Parameter/Karakteristik Umum Kinerja
Validasi Metode
Quantitative Qualitative
Linearity Relative accuracy
Relative accuracy Relative specificity
Accuracy Relative sensitivity

Detection limit (LOD) False positive (positive deviation)
Quantification limit (LOQ) False negative (negative deviation)
Relative sensitivity Relative detection level
Specificity Inclusivity
Inclusivity Exclusivity
Exclusivity
ISO 16140:2003 58
Istilah dan definisi
 Relative accuracy
Tingkat kesesuaian antara hasil yang didapatkan oleh metode acuan
dan hasil yang didapatkan oleh metode alternative pada sampel
yang sama
 Relative specitivity
Kemampuan metode alternative untuk tidak mendeteksi
mikroorganisme yang tidak dideteksi oleh metode acuan
 Relative sensitivity
Kemampuan metode alternative untuk mendeteksi mikroorganisme
yang dideteksi oleh metode acuan
 False positive (Positive deviation)
Metode alternative memberikan hasil positif sementara metode
acuan memberikan hasil negatif
ISO 16140:2003 59
Istilah dan definisi
 False negative (Negative deviation)
Metode alternative memberikan hasil negatif sementara metode
acuan memberikan hasil positif.
 Relative detection level
Jumlah kultur mikroorganisma terendah yang dapat dideteksi
sebanyak 50 % oleh metode alternative dan metode acuan.
 Inclusivity
Kemampuan metode alternative untuk mendeteksi mikroorganisme
target dari sejumlah besar strains.
 Exclusivity
Kurangnya gangguan dari berbagai strain non-target dari metode
alternative.
ISO 16140:2003
60
Protokol Validasi Metode Kualitatif
(Studi Banding Metode)
1. Relative accuracy, relative specificity & relative sensitivity
 Diutamakan mencari sampel yang terkontaminasi secara natural.
 Jika akan melakukan validasi terhadap seluruh pangan, uji pada 5
kategori pangan/tergantung pada kategori pangan yang
ditentukan.
 Jumlah sampel 60 sampel untuk setiap kategori pangan (pilih 3
jenis pangan yang mewakili).
 Analisa 20 porsi uji untuk setiap jenis pangan dan lakukan
pengujian menggunakan metode acuan dan metode alternative
 Untuk spike sampel, gunakan tingkat kontaminasi untuk
menghasilkan hasil uji yang positif (L0= kontrol negatif; L1 = 1 – 10
sel per 25 g sampel dan L2 = 10 – 100 sel per 25 g sampel)*
* NordVal International Protocol for the validation of microbiological alternative (proprietary) methods ISO 16140:2003 61
Food categories relevant to major foodborne pathogen
ISO 16140:2003 62
ISO 16140:2003 63
ISO 16140:2003
64
Food categories relevant to major non-pathogenic microorganisms
ISO 16140:2003
65
Peraturan Kepala BPOM RI No 16 tahun 2016
No Kategori Pangan
1 Produk-produk susu dan analognya, kecuali yang termasuk kategori pangan 02.0
2 Lemak, minyak, dan emulsi minyak
3 Es untuk dimakan (edible ice, termasuk sherbet dan sorbet)
Buah dab sayuran (termasuk jamur, umbi, kacang termasuk kacang kedelai, dan lidah buaya), rumput laut,
4
biji-bijian
5 Kembang gula/permen dan cokelat
Serealia dan produk serealia yang merupakan produk turunan dari biji serealia, akar dan umbi, kacang dan
6 empulur (bagian dalam batang tanaman), tidak termasuk produk bakeri dari kategori 07.0 dan tidak
termasuk kacang dari kategori 04.2.1 dan 04.2.2
7 Produk bakeri
8 Daging dan produk daging, termasuk daging unggas dan daging hewan buruan
9 Ikan dan produk perikanan termasuk moluska, krustase, dan ekinodermata serta amfibi dan reptil
10 Telur dan produk-produk telur
11 Pemanis, termasuk madu
12 Garam, rempah, sup, saus, salad, produk protein
13 Produk pangan untuk keperluan gizi khusus
14 Minuman tidak termasuk produk susu
15 Makanan ringan siap santap
16 Pangan campuran (komposit)
66
Penghitungan hasil validasi kualitatif
Hasil uji metode acuan dan metode alternative
ISO 16140:2003 67
Penghitungan relative accuracy, relative sensitivity dan relative specificity
ISO 16140:2003 68
2. Relative detection level
Tujuan : konsentrasi terkecil mikroorganisme yang dapat
dideteksi minimal 50% oleh alternative dan reference
methods didalam sampel
 Pilih 1 produk pangan diantara masing-masing kategori
pangan.
 Gunakan 5 target mikroorganisme yang berbeda.
 Uji minimum 3 level konsentrasi (L0= kontrol negatif;
L1 = 1 – 10 sel per 25 g sampel dan L2 = 10 – 100 sel per
25 g sampel)
 Lakukan uji sebanyak 6x ulangan dengan alternative
dan reference methods
ISO 16140:2003
69
ISO 16140:2003
70
3. Inclusivity dan Exclusivity
 Inclusivity : pilih 50 strain murni dari bakteri target

(untuk Salmonella pilih minimal 30 strain). Inokulasikan
kedalam sampel 10 – 100 kali lebih besar dari batas
deteksi.
 Exclusivity : pilih 30 strain murni dari bakteri non target.

Inokulasikan kedalam sampel dengan tingkat kontaminasi
yang tingginya diperkirakan sering terdapat pada sampel
ISO 16140:2003
71
ISO 16140:2003 72
Verifikasi Metode Kualitatif
73
Prosedur
 Sampel: sesuai kategori pangan atau sampel yang biasa diuji di
laboratorium.
 Untuk setiap sampel, siapkan sampel tanpa spike bakteri (kontrol),
siapkan sampel spike bakteri target (dapat menggunakan satu atau
lebih bakteri), dan siapkan sampel spike bakteri non target.
 Spike sampel dengan tingkat kontaminasi rendah (1-10 sel per 25 g
sampel dan kontaminasi tinggi (10-100 sel per 25 g sampel)*
 Lakukan enam kali ulangan masing-masing level.
 Uji sesuai prosedur yang tertera pada metode.
 Konfirmasi sampel presumtif positif dengan uji biokimia dan
serologi, presumptive negative tidak dikonfirmasi.
* NordVal International protocol for the validation of microbiological alternative (proprietary) methods
74
Penghitungan
Konfirmasi Presumptif
positif negatif
a b
positif (positive) (false negative)
c d
negatif (false positive) (negative)
Sensitifitas (%) = a/(a + b) x 100

Spesifisitas (%) = d/(c + d) x 100
False positive rate (%) = c/(a + c) x 100
False negative rate (%) = b/(b+d) x 100
Jumlah contoh: a + b + c + d = n
75
Contoh
Konfirmasi Presumtif
positif negatif
a b
positif (11) (0)
c d
negatif (1) (6)
Sensitifitas = a/(a + b) x 100 = 11/11 x 100 = 100

Spesifisitas = d/(c + d) x 100 = 6/7 x 100 = 85.7
False positive rate = c/(a + c) x 100 = 1/11 x 100 = 9.1
False negative rate = b/(b+d) x 100 = 0/6 x 100 =-
Jumlah contoh: a + b + c + d = n = 11+0+1+6 = 18
76
Materi pelatihan MJ MC Nerney : Method validation
techniques 19 – 22 August 2014
77
78
79
80
81
82
Laporan validasi/verifikasi metode
83
 Latar belakang/alasan melakukan validasi/verifikasi

 Acuan metode validasi
 Waktu dan analis yang melaksanakan
 Uraian tatacara pelaksanaan
 Metode uji yang digunakan
 Uraian sampel yang digunakan
 Uraian mikroba yang digunakan dan sumber/asalnya
 Tingkat kontaminasi (spike)
84
 Analisa data
 Kriteria yang digunakan dalam validasi/verifikasi
 Laporkan semua hasil uji (lampirkan data mentah)
 Bedakan hasil yang diperoleh dari sampel alami dan
kontaminasi (spike)
 Kesimpulan tentang kesesuaian metode tersebut
terhadap persyaratan laboratorium
85
The N
86

Validasi Metode Mikrobiologi

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Validasi Metode Mikrobiologi

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

VALIDASI & VERIFIKASI METODA

Intan Nurmala Dewi, STP

Metode Analisa Peralatan Analis/Pelaksana

• Metode Standar • Neraca

VALIDASI & VERIFIKASI TRAINING & UJI

• Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll

• Validasi adalah konfirmasi

 Persyaratan ISO/IEC 17025-2017 klausal 7.2.2

Apabila Laboratorium menggunakan ;

• Verifikasi metode adalah

 Kualitatif : menentukan ada atau tidaknya

 Kuantitatif : menentukan jumlah mikroorganisme pada

Method Validation of Microbiological Methods,

dipublikasikan untuk pengujian mikrobiologi.

 Laboratorium yang menggunakan referensi/metode standar tidak

menunjukkan validasi sekunder (juga disebut verifikasi).

 Verifikasi diperlukan pengguna laboratorium hanya untuk memverifikasi

bahwa metode dapat memenuhi tujuan dan persyaratan untuk aplikasi

analisis yang dimaksud.

metode, membuat modifikasi standar metode / referensi atau

menggunakannya di luar penggunaan yang dimaksudkan, laboratorium

harus melakukan validasi metode.

 Mikroorganisme acuan yang digunakan untuk validasi harus diperiksa

kemurniannya dengan cara plating permukaan non-selektif dan selektif

media yang tepat dan pemeriksaan mikroskopis. Uji kemurnian kultur

dapat menggunakan metode konvensional atau rapid methods yang

disetujui untuk digunakan dalam referensi/metode standar jika

 Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian

1. Selektifitas nyata : fraksi jumlah koloni (logaritma)

Memilih Organisme Uji

 Menggunakan peralatan yang terkalibrasi

 Kultur acuan yang dinyatakan sebagai kontrol positif harus

Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih sampel yang

1 loop Inkubasi selama

Menghitung Populasi pada Biakan Murni

Hit. Jumlah Inkubasi selama 48 jam

Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri

Ulangan 10-7 10-8 10-9 Hasil

BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml Didapatkan 1 : 10 spike

BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml

10-1 10-2 10-6

 Siapkan sampel yang sudah di spike dengan mikroorganisme

Catatan : Jika dilakukan oleh analis berbeda, dapat dihitung presisi

 ((Log a – log b) / x1)2

CV (coefisien of variation) = RSD x 100%

Kuantitatif (Hitungan Cawan) & Tabung MPN

Sensitifitas = A/(A+B) x 100

1. Siapkan sampel yang sudah di spike dengan masing-masing 5

 Keberterimaan : Hasil metode uji sama dengan metode

Kuantitatif (Hitungan Cawan)

 Umumnya adalah metode cepat

Accuracy Relative sensitivity

 Inclusivity : pilih 50 strain murni dari bakteri target

 Exclusivity : pilih 30 strain murni dari bakteri non target.

Sensitifitas (%) = a/(a + b) x 100

Sensitifitas = a/(a + b) x 100 = 11/11 x 100 = 100

 Latar belakang/alasan melakukan validasi/verifikasi

Anda mungkin juga menyukai