INSTRUKSI KERJA VALIDASI METODE UJI

1. Acuan
1.1.

Eurachem (The Fitness for Purpose of Analytical Methods)

1.2.

Pedoman mutu 5.9.1

2. Tujuan
Validasi metode bertujuan untuk membuktikan melalui studi Laboratorium, bahwa unjuk
kerja karakteristik metode tersebut sesuai dengan tujuan penerapan analisisnya.

3. Ruang Lingkup
Instruksi kerja ini digunakan sebagai petunjuk teknis validasi terhadap metode tidak
baku, metode yang didesain/dikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan
di luar lingkup yang dimaksud, penguatan (amplification) serta metode baku yang
dimodifikasi untuk mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang
dimaksud Laboratorium. Tahapan dalam instruksi ini hanya sebagai petunjuk, tidak
ditekankan bahwa semua metode yang digunakan Laboratorium harus divalidasi sesuai
dengan semua tahapan dalam instruksi ini. Pemakaiannya disesuaikan dengan jenis uji
yang diaplikasikan.
4. Definisi
4.1.
Akurasi
Kedekatan antara nilai nyata, yang diterima sebagai nilai benar yang konvensional
atau nilai standar yang dapat diterima, dengan nilai hasil pengukuran dari komponen
yang sama.

4.2.

Presisi
Kedekatan antara hasil pengujian individu dalam serangkaian pengukuran
terhadap suatu contoh homogen yang dilakukan pengambilan contoh secara
berganda menurut prosedur yang telah ditetapkan.

4.2.1. Repitabilitas
Menyatakan presisi yang dilakukan pada kondisi yang telah ditentukan di
Laboratorium yang sama dalam interval waktu yang pendek oleh analis yang
sama dengan menggunakan peralatan dan pereaksi yang sama.
4.2.2. Presisi Intermediet

Menyatakan presisi yang dilakukan pada kondisi yang telah ditentukan di

Laboratorium yang sama pada hari yang berbeda oleh analis yang berbeda dengan
menggunakan peralatan dan pereaksi yang berbeda.
4.2.3. Reproduksibilitas
Menyatakan presisi yang dilakukan pada kondisi yang dilakukan di laboratorioum
yang berbeda pada hari yang berbeda, oleh analis yang berbeda, dengan
menggunakan peralatan dan pereaksi yang berbeda.
4.3.

Limit Deteksi
Konsentrasi analit terendah dalam contoh yang dapat dideteksi, akan tetapi tidak
perlu ditentukan secara kuantitatif hingga didapatkan nilai yang persis.

4.3.1. Limit Deteksi Terendah

Adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi oleh metode dan secara
statistik berbeda dari sinyal latar belakang (noise) blangko pelarut sebesar 2 x
1,645 x Sdblangko.
4.3.2. Limit Deteksi Instrumen
Adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi oleh instrumen (alat ukur)
dan secara statistik berbeda dari sinyal latar belakang (noise) instrumen.
4.3.3. Limit Deteksi Metode
Merupakan konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi oleh metode dan
secara statistik berbeda terhadap sinyal dari blangko pelarut yang diperlakukan
melalui keseluruhan metode, termasuk ekstraksi kimia, dan atau persiapan contoh.
4.4.

Linieritas
Adalah kemampuan (dalam rentang tertentu) suatu penetapan kadar untuk
memperoleh hasil uji (respon analitik) yang sebanding dengan konsentrasi analit
dalam contoh.
4.5.

Limit Linieritas
Yaitu nilai ukur tertinggi yang masih memiliki hubungan linier antara skala ukur
dengan satuan yang diukur.

4.6.

Rentang
Merupakan interval di antara konsentrasi analit tertinggi (limit linieritas) dan
terendah (limit kuantitasi) dalam contoh yang dapat ditetapkan dengan akurasi,
presisi dan linieritas yang dapat diterima menggunakan metode pengujian
tersebut.

4.7.

Selektifitas
Merupakan kemampuan metode untuk dapat mendiferensiasi analit dari
konkomitan lain dalam matrik contoh.

4.8.

Limit Kuantitasi
Konsentrasi analit terendah dalam contoh yang dapat diukur secara kuantitatif
dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima.

4.9.

Robustness (Ketegaran)
Merupakan kapasitas suatu prosedur analitik untuk tidak terpengaruh oleh variasi
kecil dalam parameter metode

4.10.

Matriks
Merupakan suatu kesatuan system dalam contoh.

4.11.

Konkomitan
Adalah zat ikutan / zat selain analit dalam contoh.

4.12.

Blangko Matriks
Suatu preparat koreksi latar belakang yang terdiri dari semua zat dalam contoh,
atau setidaknya mendekati contoh, tanpa analit.

4.13.

Blangko Pereaksi
Suatu preparat koreksi latar belakang yang terdiri dari pelarut analit dan semua
pereaksi yang digunakan dalam metode pengujian.

4.14.

Blangko Pelarut
Suatu preparat koreksi latar belakang yang terdiri dari hanya pelarut yang
digunakan dalam preparat uji akhir.

4.15.

Konsentrasi Uji
Merupakan konsentrasi analit yang dijadikan patokan dalam pengujian. Pada
produk-produk hasil buatan, konsentrasi uji sama dengan konsentrasi analit yuang
tertera pada etiket/label produk. Pada kasus tidak ditemui label Nilai kandungan
analit yang yang menjadi syarat keberterimaan objek uji berdasar standar yang
berlaku (misal : SNI)
5. Cara Kerja
5.1.

Akurasi
Terdapat sedikitnya empat macam metode untuk mengevaluasi akurasi suatu metode
uji, harus dipilih salah satunya sesuai dengan ketersediaan prasyarat dan metode uji.

5.1.1. Analisis Reference Material (RM)

Metode ini hanya dilakukan jika tersedia RM yang sesuai.
5.1.1.1 Lakukan analisis berulang sebanyak minimal dua kali ulangan terhadap RM.
5.1.1.2 Reratakan kadar hasil uji, lalu bandingkan terhadap rentang keberterimaan nilai
acuan RM.
5.1.1.3 Metode uji terbukti akurat jika rerata hasil uji masuk ke dalam rentang
keberterimaan nilai acuan RM
5.1.2.
5.1.2.1.

Spike Recovery
Buat preparat contoh uji dengan konsentrasi 50, 100, dan 150% dari konsentrasi
uji melalui penambahan analit standar terhadap blangko matriks dengan
konsentrasi yang terukur secara pasti.

5.1.2.2.

Lakukan analisis berulang dengan jumlah pengulangan tiga kali untuk tiap-tiap
preparat menggunakan metode yang akan divalidasi bersamaan dengan
pengukuran standar.

5.1.2.3.

Hitung kadar analit dalam contoh yang kemudian dibandingkan terhadap kadar yang
didapat dari perhitungan teoretis, nyatakan sebagai % recovery untuk akurasi.

5.1.2.4.

Metode terbukti akurat jika kisaran % recovery

sesuai syarat keberterimaan yang

bergantung pada jenis dan konsentrasi analit.

5.1.2.5.

Perhitungan:

Level
Konsentrasi
50%

Konsentrasi Teoretis
Replika
t
1
2
3

100%

1
2
3

150%

1
2
3

Konsentrasi Praktis
Analit dalam

Analit dalam Contoh (

Contoh ( )

Akurasi dinyatakan sebagai rentang % recovery

Rumus perhitungan % recovery

x
x
x
x
x
x
x
x

%R
% Recovery (

%1
1

%2
2

%3
3

%4
4

%5
5

%6
6

%7
7

%8
8

%9
9

%terkecil s.d. %terbesar

% Re cov ery

x
x100%

Keterangan :

= Konsentrasi Teoretis Analit dalam Contoh

x
( )

= Konsentrasi Praktis Analit dalam Contoh

5.1.3. Uji Komparatif

Metode ini dilakukan jika tersedia data akurat dan lengkap tentang data validasi
metode yang akan dijadikan pembanding.
5.1.3.1.

Lakukan analisis berulang dengan sedikitnya tiga kali ulangan terhadap satu
contoh QC dengan konsentrasi uji 100% menggunakan metode yang telah
diketahui pasti validitasnya.

5.1.3.2.

Lakukan pula minimal tiga kali ulangan analisis terthadap contoh QC yang sama
menggunakan metode uji yang akan divalidasi.

5.1.3.3.

Lakukan perhitungan uji F yang dilanjutkan dengan uji t student terhadap rerata
masing-masing hasil uji metode dengan tingkat keyakinan 95%.

5.1.3.4.

Metode uji valid jika memberikan hasil uji yang tidak berbeda nyata dengan
hasil uji metode yang telah diketahui validitasnya.

5.2.

Presisi
5.2.1. Repitabilitas
Evaluasi repitabilitas dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu pengukuran
berulang pada 100% konsentrasi uji produk/objek uji, dan pengukuran berulang
pada tiga level konsentrasi uji produk/objek uji (20, 50, dan 100%). Metode
evaluasi yang digunakan dipilih berdasar kesesuaian dengan sistem.

5.2.1.1.

Pengukuran berulang pada 100% konsentrasi uji

5.2.1.1.1. Lakukan analisis berulang terhadap produk atau contoh QC dengan

konsentrasi analit 100% konsentrasi yang tertera pada etiket produk yang
sama dengan jumlah ulangan minimal sebanyak enam kali.
5.2.1.1.2. Lakukan pula pengukuran standar.
5.2.1.1.3. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang tidak berjauhan (hari
yang sama) dan oleh analis yang sama.

5.2.1.1.4. Hitung nilai repitabilitas sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasilhasil kadar yang didapat.
5.2.1.1.5. Repitabilitas metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai % SBR batas
keberterimaan pada konsentrasi uji.

5.2.1.1.6. Perhitungan:
Replikat
(n)

Respon
Analitik

Faktor
Konsentrasi
Analit

( y)

Contoh
y

(f)

Respon
Analitik
ys
Standar ( )

ys

f
2

f
3

f
4

f
5

f
6

ys
ys
ys
ys
ys

Faktor
Konsentrasi
Standar
fs

)
fs

fs
2

fs
3

fs
4

fs
5

fs
6

Kadar Analit
dalam
x
Contoh ( )
x
1

x
2

x
3

x
4

x
5

x
6

Jumlah

Rerata

Simpangan Baku

Rumus perhitungan rerata

x
x
n
Rumus perhitungan simpangan baku

x x

n 1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR 100%
x
Keterangan :
x
= Rerata

= Jumlah kadar analit dalam contoh

(n)

= Jumlah replikat

5.2.1.2.

= Simpangan baku

Pengukuran berulang pada tiga level konsentrasi uji

2.2.1.2.1. Lakukan analisis berulang terhadap produk atau contoh QC dengan

konsentrasi analit 80, 100, dan 120% konsentrasi yang tertera pada etiket
produk yang sama dengan jumlah ulangan minimal sebanyak tiga kali untuk
masing-masing level konsentrasi.
2.2.1.2.2. Lakukan pula pengukuran standar.
2.2.1.2.3. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang tidak berjauhan (hari
yang sama) dan oleh analis yang sama.
2.2.1.2.4. Hitung nilai repitabilitas sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasilhasil % recovery yang didapat.
2.2.1.2.5. Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas
keberterimaan.

2.2.1.2.6. Perhitungan ;
Level
Konsentrasi

Replika
t
(n)

80%

1
2
3

Respon
Analitik
Contoh

Faktor
Konsentrasi
Analit

( y)

(f)

y
y

f
2

f
3

Respon
Analitik
Standar (
ys
)
ys
ys
ys

Faktor
Konsentrasi
Standar
fs

)
fs

fs
2

fs
3

Kadar Analit
dalam
x
Contoh ( )
x
1

x
2

x
3

Jumlah

Rerata

Simpangan baku

%SBR

100%

ys

f
1

f
2

f
3

ys
ys

fs
2

fs
3

fs

x
2

x
3

Jumlah

Rerata

Simpangan baku

%SBR
120%

ys

f
1

f
2

f
3

ys
ys

%
x

fs
1

fs
2

fs
3

x
2

x
3

Jumlah

Rerata

Simpangan baku

%SBR
Presisi dinyatakan sebagai rentang %SBR

Rumus perhitungan rerata

x
x
n
Rumus perhitungan simpangan baku

x x

n 1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR 100%
x
Keterangan :
x
= Rerata
x
= Jumlah kadar analit dalam contoh

%
%terkecil s.d.
%terbesar

2.2.2.

= Jumlah replikat

= Simpangan baku

Presisi intermediet
Evaluasi presisi intermediet dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu pengukuran
berulang pada 100% konsentrasi uji produk/objek uji, dan pengukuran berulang
pada tiga level konsentrasi uji produk/objek uji (80, 100, dan 120%). Metode
evaluasi yang digunakan dipilih berdasar kesesuaian dengan sistem.

5.2.2.1.

Pengukuran berulang pada 100% konsentrasi uji

5.2.1.2.1. Buat objek uji atau contoh QC dengan konsentrasi analit 100% konsentrasi
yang tertera pada etiket produk.
5.2.1.2.2. Objek uji atau contoh QC tersebut didistribusikan minimal kepada dua
orang analis.
5.2.1.2.3. Lakukan analisis berulang menggunakan metode yang akan divalidasi
terhadap produk atau contoh QC tersebut dengan jumlah ulangan masingmasing analis minimal sebanyak enam kali.
5.2.1.2.4. Lakukan pula pengukuran standar.
5.2.1.2.5. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang berjauhan (hari yang
berbeda) dan lebih baik menggunakan peralatan berbeda.
5.2.1.2.6. Hitung nilai presisi intermediet sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari
hasil-hasil kadar yang didapat dari pengulangan analisis yang dilakukan
oleh para analis tersebut.
5.2.1.2.7. Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas
keberterimaan.

5.2.1.2.8. Perhitungan:
Replika
t

Respon
Analitik

Faktor
Konsentrasi

Respon
Analitik

Faktor
Konsentrasi

Kadar Analit
dalam Contoh (

(n)

( y)

Analit

Contoh

ys

(f)

Standar (

Analis 1
ys

Standar
(

f
2

f
3

f
4

f
5

f
6

ys
ys
ys
ys

f
2

f
3

f
4

f
5

f
6

ys
ys
ys
ys
ys

fs

fs
2

fs
3

fs
4

fs
5

fs

Analis 2
ys

ys

x
2

x
3

x
4

x
5

x
6

fs

fs
2

fs
3

fs
4

fs
5

fs
6

fs

x
2

x
3

x
4

x
5

x
6

Jumlah

Rerata

Simpangan Baku

Rumus perhitungan rerata

x
x
n

Rumus perhitungan simpangan baku

x x

n 1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR 100%
x

Keterangan :
x
= Rerata
x
= Jumlah kadar analit dalam contoh
(n)

= Jumlah replikat

= Simpangan baku

2.2.2.2. Pengukuran berulang pada tiga level konsentrasi uji

5.2.1.2.1. Buat objek uji atau contoh QC dengan konsentrasi analit 80, 100, dan 120%
konsentrasi yang tertera pada etiket produk.
5.2.1.2.2. Objek uji atau contoh QC tersebut didistribusikan minimal kepada dua orang
analis.
5.2.1.2.3. Lakukan analisis berulang menggunakan metode yang akan divalidasi
terhadap produk atau contoh QC tersebut dengan jumlah ulangan masingmasing analis minimal sebanyak tiga kali.
5.2.1.2.4. Lakukan pula pengukuran standar.
5.2.1.2.5. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang berjauhan (hari yang
berbeda) dan lebih baik menggunakan peralatan berbeda.
5.2.1.2.6. Hitung % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasil-hasil kadar yang didapat
dari pengulangan analisis yang dilakukan oleh para analis tersebut.
5.2.1.2.7. Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas
keberterimaan.
5.2.1.2.8. Perhitungan:
Rumus perhitungan rerata
x
x
n
Rumus perhitungan simpangan baku

n 1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR 100%
x
Keterangan :
x
= Rerata

= Jumlah kadar analit dalam contoh

(n)

= Jumlah replikat
= Simpangan baku

2.2.3.

Reproduksibilitas

5.2.3.1

Buat objek uji atau contoh QC dengan konsentrasi analit 100% konsentrasi yang

5.2.3.2

tertera pada etiket produk.

Objek uji atau contoh QC tersebut didistribusikan minimal kepada dua

5.2.3.3

laboratorium berbeda.
Lakukan analisis berulang menggunakan metode yang akan divalidasi terhadap
produk atau contoh QC tersebut dengan jumlah ulangan masing-masing

5.2.3.4
5.2.3.5

laboratorium minimal sebanyak enam kali.

Lakukan pula pengukuran standar.
Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang berjauhan (hari yang

5.2.3.6

berbeda).
Hitung nilai reproduksibilitas sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasilhasil kadar yang didapat dari pengulangan analisis yang dilakukan di

5.2.3.7

dua

laboratorium berbeda tersebut.

Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas
keberterimaan.

2.2.4.

Linieritas

5.2.4.1

Buat preparat deret standar menggunakan plasebo yang ke dalamnya ditambahkan

5.2.4.2

secara kuantitatif analit standar yang diketahui konsentrasinya secara pasti.

Konsentrasi preparat yang dibuat minimal enam level konsentrasi yang
melingkupi konsentrasi uji contoh seperti yang tertera pada etiket (0, 60, 80, 100,

5.2.4.3

120, dan 150%).

Lakukan analisis pada masing-masing preparat menggunakan metode yang akan

5.2.4.4

divalidasi dengan jumlah pengulangan sebanyak dua kali.

Hitung korelasi antara respon analitik yang didapat dengan konsentrasi teoretis

5.2.4.5

analit dalam preparat.

Linieritas metode memenuhi syarat jika nilai koefisien korelasi (r) 0,99.

2.2.5.

Limit Deteksi
Limit deteksi dapat ditentukan dengan setidaknya tiga cara, yang harus dipilih
salah satu berdasar kesesuaian dengan sistem.

2.2.5.2. Berdasar Simpangan Baku Blangko

2.2.5.2.1. Lakukan analisis berulang terhadap plasebo sebanyak minimal lima kali
ulangan.
2.2.5.2.2. Lakukan pula pengukuran deret standar.
2.2.5.2.3. Hitung standar deviasi dari data analisis plasebo (blangko matriks) dan slope
dari data deret standar yang didapat.
2.2.5.2.4. Hitung nilai limit deteksi sebagai sinyal analitik rerata blangko ditambah tiga
kali standar deviasinya.

2.2.6.

Limit Kuantitasi
Limit kuantisasi dapat ditentukan dengan setidaknya tiga cara, yang harus dipilih
salah satu berdasar kesesuaian dengan sistem.

5.6.2.1.

Berdasar Simpangan Baku Blangko

5.6.2.1.1. Lakukan analisis berulang terhadap plasebo sebanyak minimal lima kali
ulangan.
5.6.2.1.2. Lakukan pula pengukuran deret standar.
5.6.2.1.3. Hitung standar deviasi dari data analisis plasebo (blangko matriks) dan slope
dari data deret standar yang didapat.
5.6.2.1.4. Hitung nilai limit kuantitasi sebagai respon analitik blangko matriks ditambah
sepuluh kali standar deviasi.

2.2.7.

Spesifitas

5.2.8.1. Lakukan minimum tiga kali analisis terhadap contoh QC dengan konsentrasi 100
% konsentrasi uji.
5.2.8.2. Buat preparat spesifitas dengan menambahkan senyawa pengotor yang memiliki
kemiripan rumus molekul dan atau sifat-sifat fisika-kimia yang diduga kuat dapat
terkandung dalam produk dan atau dapat mengganggu analisis.
5.2.8.3.

Lakukan minimum tiga kali analisis terhadap preparat spesifitas tersebut di atas.
5.2.8.4. Lakukan uji beda nyata terhadap rerata hasil uji kedua objek uji tersebut.
5.2.8.5. Metode dapat dikatakan spesifik bila tidak memberikan hasil uji yang berbeda
nyata.
2.2.8.

Robustness

5.2.9.1. Tentukan satu atau lebih faktor yang akan diteliti efeknya terhadap hasil analisis
(suhu, waktu, dan atau salah satu kemungkinan variasi kecil yang dapat terjadi
dalam analisis rutin).
5.2.9.2. Buat preparat yang memadai untuk tiap percobaan.
5.2.9.3. Lakukan sedikitnya dua kali pengukuran untuk tiap preparat sesuai dengan
kondisi yang dipersyaratkan dalam percobaan.
5.2.9.4. Lakukan pula pengukuran standar fresh untuk tiap-tiap pengukuran preparat.
5.2.9.5. Bandingkan hasil yang didapat pada tiap eskalasi percobaan dengan kontrol.
5.2.9.6. Metode dapat dikatakan Robust jika tidak terdapat perbedaan yang nyata antara
perlakuan tervariasi dengan perlakuan kontrol pada taraf kepercayaan 95%.
2.3.

Evaluasi
5.3.1. Lampirkan semua catatan data dan grafik, kromatogram, dan atau spektrogram bila ada.
5.3.2. Lakukan semua perhitungan sebelum, selama, dan setelah pelaksanaan evaluasi serta
analisis statistik.
5.3.3. Bandingkan hasil yang diperoleh terhadap kriteria penerimaan tiap parameter validasi.
5.3.4. Bila terdapat penyimpangan siapkan laporan termasuk justifikasi dan dampaknya
terhadap validitas metode uji.

2.4.Dokumentasi dan Laporan Validasi

Buat laporan atas validasi yang telah dilaksanakan, mencakup :

2.5.

Tanggal mulai dan selesainya validasi

Identitas metode dan objek uji

Hasil pengamatan

Hasil perhitungan dan analisis statistik

Simpulan atas validitas metode uji

Informasi lainnya yang relevan dengan pelaksanaan validasi.

Serahkan laporan validasi pada yang berwenang untuk memperoleh persetujuan

akhir dan pengesahan.

Dokumen Terkait
PR-5.4. Prosedur Pengujian dan Validasi Metode
-FF-

Formulir Rencana Kerja Validasi Metode

Formulir Akuisisi Data Validasi Metode

F-

Formulir Laporan Validasi Metode