Validasi Metode Mikrobiologi

A. Akurasi (Kecermatan)
1. Definisi:
a. Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur dan
mendeteksi nilai aktual atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme
target dalam sampel.
b. Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil
pengujian dengan hasil yang sebenarnya.
2. Perhitungan
a. Recovery (Persen perolehan kembali)
H
Recovery = 100
A
b. Galat Reatif
Recovery =

( H A)
100
A

c. Recovery Relatif
H
Recovery = 100
B
Keterangan:
H = Hasil metode uji
A = Hasil teoritis
B = Hasil metode baku
3. Cara Pengujian
a. Spiked-Placebo Recovery Method
b. Standard Addition Method
Menggunakan 9 kali pengukuran (3 level konsentrasi dengan 3
replikasi)

Tabel 1. Contoh Perhitungan Akurasi dan Recovery Metode

Galur Baku
I
II
III
IV
V
Rata-rata

Jumlah Angka Lempeng Total

Teoritis
Metode Uji
Metode Baku
125
126
127
125
120
11
125
120
118
125
120
128
125
132
131
125
125
125

B. Presisi (Keseksamaan)
1. Definisi:
a. Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual
dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang
homogeny dengan kondisi pengujian yang sama.
b. Presisi: keterulangan (repeatability), ketertiruan (reproducibility),
kesekasamaan antara (intermediate precision)
2. Cara Perhitungan
Simpangan baku relative (Relative Standard Deviation=RSD) untuk
intermediate precision

RSD=

( logailog bi )
xi
2P

Keterangan:
ai dan bi

= hasil pengujian I (1,2,3,,n)

xi

= rata-rata = 1/n (log ai+log bi)

= jumlah sampel yang diuji

No

ALT (cfu/mL)

logaritma

Ratarata

Selisih
(II)

(II/I)2

(I)
a

93

86

34

30

98

73

89

83

116

104

168

156

62

56

38

28

330

300

10

2300

2040

RSD =
KV

a
1,968
5
1,531
5
1,991
2
1,949
4
2,064
5
2,225
3
1,792
4
1,579
8
2,518
5
3,361
7

B
1,934
5
1,477
1
1,863
3
1,919
1
2,017
0
2,193
1
1,748
2
1,447
2
2,477
1
3,309
6

1,951
5
1,504
3
1,927
3
1,934
2
2,040
7
2,209
2
1,770
3
1,513
5
2,497
8
3,335
7

0,034
0
0,054
4
0,127
9
0,030
3
0,047
5
0,032
2
0,044
2
0,132
6
0,041
4
0,005
21

0,0003
03
0,0013
06
0,0044
04
0,0002
46
0,0005
40
0,0002
12
0,0006
23
0,0076
79
0,0002
75
0,0002
44
0,0158
32

0,015832/210 = 0,0281

= 100 x RSD = 2,81 %

C. Sensitifitas dan Spesifisitas

1. Definisi
a. Sensitifitas (Kepekaan)
:
Kemampuan
metode
untuk
mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil
mungkin.
b. Spesifisitas (Kemenjenisan)
:
Kemampuan
metode
untuk
mendeteksi/mengukur mikroorganisme tertentu secara cermat dan
seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan/matriks
lain.

2. Cara Perhitungan
a. Sensitifitas
: Fraksi koloni/kultur yang positif pada uji konfirmasi
terhadap pengujian presumtif.
b. Spesifisitas
: Fraksi koloni/kultur yang negatif pada uji konfirmasi
terhadap pengujian presumtif.
c. Selektifitas: Logaritma fraksi koloni/kultur yang positif pada uji
konfirmasi terhadap jumlah pengujian

Uji Konfirmatif
Positif (+)
Negatif (-)
Jumlah uji

Uji Presumtif
Positif (+)
Negatif (-)
a
b
c
d
a+c
b+d

Sensitifitas = a/(a+b)
Spesifisitas = d/(c+d)
Rasio positif palsu
Rasio negative palsu
Efisiensi
= (a+d)/n
Selektifitas absolut
Selektifitas apparent

Uji Konfirmatif
Positif (+)
Negatif (-)
Jumlah uji

Jumlah
a+b
c+d
a+b+c+d=n

= c/(a+c)
= b/(b+d)
= RS = log (a/n)
= F = log [(a+c)/n)]

Uji Presumtif
Positif (+)
Negatif (-)
250
8
20
120
270
128

Jumlah
258
140
398

Sensitifitas = 250/258= 0,97

Spesifisitas = 120/140= 0,86
Rasio positif palsu
= 20/270= 0,07
Rasio negative palsu
= 8/128= 0,06
Efisiensi
= 370/398= 0,93
Selektifitas absolut
= RS = log (250/398)=
Selektifitas apparent
= F = log [270/398]= 0,1685
D. Rentang Hasil Pengujian
1. Rentang menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian
yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama.

2. Batas Terendah (Lower Limit) adalah hasil analisis/pengujian terendah

yang ditandai dengan galat analisis 20,0% dari rata-rata (pengukuran
minimal 3 kali)

ALT (cfu/lempeng)
10
15
20
25
27
29
30

Galat Baku
3,16
3,87
4,47
5,00
5,20
5,39
5,48

Galat relative (%)

31,6
25,8
22,8
20,0
19,2
18,6
18,3

3. Batas Tertinggi (Upper Limit) adalah hasil analisis/pengujian koloni

tertinggi yang masih dapat dihitung dengan cermat dan seksama
ditandai dengan galat analisis 15,0% dari rata-rata (pengukuran
minimal 3 kali)
|2. LCHC 1|
1,96
1

|2. LC HC|2
4. Rentang Hasil Pengujian (Lempeng Agar)
a. Sampel makanan dan obat-obatan: 25-250 cfu/lempeng
b. Sampel air: 30-300 cfu/lempeng
c. Kapang: 8-80 koloni/lempeng
E. Robustness (Ketangguhan)
1. Pengujian ketangguhan sebenarnya harus dilakukan pada saat fase
pengembangan metode dan tergantung pada factor-faktor yang
berpengaruh pada pengujian.
2. Jika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalam kondisi analisis,
maka kondisi pengujian hendaknya dikendalikan atau dilakukan
dengan penuh kehati-hatian.
3. Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus diperhatikan:
a. Stabilitas sampel
b. Pengaruh suhu inkubasi
c. Pengaruh waktu inkubasi
d. Kondisi aerobic atau anaerobic (untuk pengujianmkroba tertentu)
e. Pengaruh jenis media (nutrisi), dll
4. Hasil pngujian dievaluasi secara statistika menggunakan ANOVA atau
Algoritma dari Yate

F. Syarat Sampel untuk Uji Validasi

1. Untuk metode analisis kualitatif, sampel yang digunakan terdiri dari 3
macam sampel: sampel yang tidak dikontaminasi, sampel yang
sengaja dikontaminasi pada jumlah yang mendekati batas limit deteksi
(low contamination level), sampel yang sengaja dikontaminasi pada
jumlah yang tinggi (high contamination level). Low contamination level
berkisar 1-5 cfu/25g sampel sedangkan high contamination level 10-50
cfu/25 g sampel.
2. Untuk metode analisis kuantitatif, maka sampek dibagi 4, yaitu 1
sampel tanpa inokulasi, dan 3 sampel masing-masing dengan low,
medium, dan hig contamination level. Low contamination level berada
pada batas limit deteksi, medium contamination level kira-kira dengan
jumlah 1 log lebih tinggi, dan high contamination level kira-kira dengan
jumlah log lebih tinggi.