BAB I

PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan uji laboratorium. Penilaian bertujuan untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan
mengkonfirmasi bahwa metode analisis sudah sesuai dengan tujuannya
(Gandjar & Rohman, 2007).
Obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan berupa bahan
tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan galenik, atau campuran dari
bahan tersebut, yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan
berdasarkan pengalaman (BPOM, 2004). Bahan-bahan tersebut berisiko
terkena cemaran selama proses pembuatannya menjadi sebuah sediaan, yaitu
pada saat pemanenan, pencucian, perajangan, pengeringan, atau saat
penyimpanan. Mikroorganisme mampu akan merusak zat aktif tanaman
sehingga menurunkan kadarnya, bahkan mampu mengubah khasiatnya.
Konsumen akan dirugikan karena tidak mendapatkan khasiat yang
diinginkan. Maka, untuk menjamin mutu produk dilakukan pengujian
mikrobiologi sebagai salah satu parameter jaminan mutu produk.
B. RUMUSAN MASALAH
Rumusan masalahnya adalah bagaimana cara melakukan validasi
metode analisis uji Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir
(AKK).
C. TUJUAN
Mengetahui cara validasi metode analisis uji Angka Lempeng Total
(ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK).

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)
Uji Angka Lempeng Total (ALT) merupakan metode kuantitatif yang
digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba pada suatu sampel. Uji ALT
menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat
diamati secara visual dan dihitung. Interpretasi hasil berupa angka dalam
koloni (cfu) dalam mL atau g. Cara yang digunakan yaitu cara tuang (pour
plate), cara sebar (spread plate) dan cara tetes. Prinsip metode ini adalah jika
sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar, sel tersebut
akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dengan mata telanjang (Betsy & Keogh, 2012),
Sampel dari bahan atau produk yang sudah dihomogenkan, diinokulasi
pada media Plate Count Agar (PCA). Setelah diinkubasi, koloni mikroba yang
tumbuh dihitung sebagai jumlah mikoba. Proses inokulasi sampel ke media
agar dapat dilakukan dengan cara penuangan, penyebaran dan penetesan.
Untuk mencegah kematian mikroba sampel, suhu media agar cair yang
dituangkan berkisar 45-50C. Bila suhunya terlalu rendah akan menyulitkan
karena sudah mulai mengental. Jumlah koloni yang dipersyaratkan adalah 30300 cfu (Feldsine, dkk., 2002).
B. UJI ANGKA KAPANG / KHAMIR (AKK)
Kapang adalah mikroorganisme yang termasuk dalan anggota Kingdom
Fungi yang membentuk hifa. Kapang memiliki lebih dari satu sel, sedangkan
khamir adalah mikroba bersel tunggal (Betsy & Keogh, 2012). Kapang dan
khamir mampu mencemari bahan tanaman yang tidak diproses dengan baik.
Kapang mampu tumbuh dengan baik pada suhu ruang dengan kelembaban
tinggi.
Prosedur pengujian Angka Kapang / Khamir (AKK) menggunakan
media Potato Dextrose Agar (PDA) yang ditambah dengan kloramfenikol

(BPOM, 2006). Pemberian kloramfenikol bertujuan untuk mencegah

pertumbuhan bakteri pada media, sehingga mengganggu pengamatan.
Pengujian dilakukan dengan suhu inkubasi 20-25C. Koloni kapang
berbentuk seperti kapas atau bulat dengan berbagai warna dan permukaan
kasar, sedangkan khamir berbentuk bulat kecil putih hampir menyerupai
bakteri. Jumlah koloni yang diamati dan sesuai persyaratan adalah cawan
dengan seri pengenceran yang menghasilkan 50-150 koloni (Feldsine, dkk.,
2002).
C. VALIDASI METODE
Validasi metode adalah suatu proses dalam menentukan kesesuaian
metode untuk tujuan tertentu. Validasi dapat diklasifikasikan menjadi validasi
primer dan sekunder berdasarkan tujuan validasi. Validasi primer adalah
proses penelitian untuk mengembangkan limit operasional dan karakteristik
performa dari metode baru, perubahan metode atau metode yang inadekuat.
Validasi

sekunder

adalah

proses

pengumpulan

bukti

bahwa

suatu

laboratorium mampu memenuhi persyaratan yang dibentuk oleh validasi

primer (ICH, 1995).
Tujuan validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi kinerja metode,
menguji faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode dan
melakukan verifikasi bahwa kinerja metode analisis yang digunakan valid.
Persyaratan dari validasi metode analisis adalah menggunakan instrumen dan
peralatan yang terkalibrasi dan dilaksanakan oleh personnel yang kompeten.
Salah satu metode analisis yang divalidasi adalah metode analisis
mikrobiologi.
Untuk memenuhi persyaratan validitas metode analisis mikrobiologi,
dibutuhkan parameter-parameter tertentu yang harus dipenuhi. Beberapa
parameter tersebut antara lain:
1. Akurasi
Kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai actual
dari mikroorganisme target dalam sampel. Akurasi merupakan ukuran

ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya.

Nilai akurasi dilihat dari persen recovery atau perolehan kembali dari
hasil pengujian.
2. Presisi
Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual
dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen.
Kondisi pengujian dipersyaratkan harus sama. Nilai presisi dilihat dari
Relative Standarad Deviation (RSD) hasil pengujian.
3. Kepekaan (Sensitivitas) dan Spesifisitas
Sensitivitas

adalah

kemampuan

metode

untuk

mendeteksi

mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin. Spesifisitas adalah

kemampuan metode untuk mendeteksi mikroorganisme tertentu secara
cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan
lain.
4. Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi
Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit
dalam sampel yang dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai
dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi adalah jumlah analit terkecil
dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat
ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit deteksi dan limit kuantitasi
dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva
standar yang diperoleh (ICH, 1995).
5. Linieritas dan Rentang
Linieritas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk
memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam
sampel pada kisaran konsentrasi tertentu. Rentang dapat dilakukan
dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set larutan standar
yang telah diketahui konsentrasinya (Ermer & Miller, 2005). Kriteria
keberterimaan dari linieritas adalah r2 > 0,999 (BPOM, 2013).

BAB III

METODE PENELITIAN
A. ALAT DAN BAHAN
1. Autoclave
2. Waterbath
3. Laminair Air Flow (LAF) merk Envair C-Flow
4. Oven merk Memmert
5. Neraca analitik
6. Inkubator merk Memmert
7. Colony counter
8. Bunsen burner
9. Beaker glass
10. Alat-alat gelas
11. Ball pump
12. Kapas, aluminium foil, tali, label
13. Sampel
14. Media PCA (untuk ALT)
15. Media PDA (untuk AKK)
16. Kloramfenikol
17. Air RO
18. Alkohol 90%
B. CARA KERJA VALIDASI METODE ANALISIS MIKROBIOLOGI UJI
ALT DAN AKK
1. Sterilisasi alat
a. Cawan petri yang telah dicuci bersih dibungkus dengan kertas (4
petri dalam 1 bungkus) (A)
b. Bungkus pipet volume dengan kertas (B)
c. Botol tempat sampel yang telah dicuci bersih direndam dengan air
panas (C)
d. Masukkan B dalam autoclave dengan mode ster pada suhu 121C
selama 30 menit. Lanjutkan dengan mode dry pada autoclave
selama 15 menit.
e. A dan C disterilisasi dengan oven pada suhu 160-180C selama 2
jam
2. Persiapan media PCA
a. Cuci / semprot tangan dengan alkohol 90%
b. Media PCA ditimbang sesuai kebutuhan
c. Dalam Erlenmeyer yang telah berisi air RO setengah dari volume
yang diperlukan, dimasukkan media PCA
d. Sisa air RO ditambahkan

e. Erlenmeyer dimasukkan dalam waterbath sambil terus diaduk

f. Pemanasan dihentikan bila media sudah jernih
g. Erlenmeyer disumbat dengan kapas, kemudian ditutup dengan
aluminium foil dan diikat
3. Persiapan media PDA
a. Media PDA ditimbang sesuai kebutuhan
b. Dalam Erlenmeyer yang telah berisi air RO setengah dari volume
c.
d.
e.
f.

yang diperlukan, dimasukkan media PDA & kloramfenikol

Sisa air RO ditambahkan
Erlenmeyer dimasukkan dalam waterbath sambil terus diaduk
Pemanasan dihentikan bila media sudah jernih
Erlenmeyer disumbat dengan kapas, kemudian ditutup dengan

aluminium foil dan diikat

4. Persiapan air untuk pengenceran
a. Tabung reaksi disiapkan sesuai keperluan
b. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan 9 mL air RO
c. Tabung reaksi disumbat dengan kapas & dimasukkan dalam
wadah
d. Wadah ditutup dengan aluminium foil
5. Sterilisasi larutan pengencer dan media
a. Erlenmeyer berisi media dan tabung reaksi berisi larutan
pengencer dimasukkan dalam autoclave
b. Dilakukan sterilisasi dengan suhu 121C selama 20 menit
6. Penimbangan sampel
a. Sampel ditimbang sebanyak 1 g untuk masing-masing uji &
dimasukkan dalam botol kaca
b. Disiapkan label sebanyak 11 untuk masing-masing uji
7. Persiapan sampel
a. Persiapan sampel dilakukan dalam LAF yang telah disterilisasi
(UV pada LAF dan pensteril ruangan dinyalakan sebelum
ruangan digunakan)
b. Masing-masing uji dibutuhkan 9 sampel (digunakan 3 tingkat
konsentrasi, masing-masing 2 replikasi), 1 media blangko
(kontrol negatif) dan 1 media dengan air RO (kontrol positif)
c. Air RO dimasukkan dalam botol sampel dan digojog. Didapatkan
pengenceran sebanyak 1 kali (10-1)
d. Untuk pengenceran berikutnya, diambil 1 mL air sampel dan
dimasukkan dalam air RO pada tabung reaksi yang telah

disiapkan. Gojog tabung reaksi dan didapatkan pengenceran 2

kali (10-2).
e. Untuk pengenceran berikutnya diulang tahap d
f. Sampel dari masing-masing pengenceran direplikasi sebanyak 2
kali
g. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan dalam cawan petri (diberi
label ALT A1-A3, ALT B1-B3, ALT C1-C3, Blanko ALT, Air RO
ALT; AKK A1-A3, AKK B1-B3, AKK C1-C3, Blangko AKK, Air
RO AKK
h. Saat berganti sampel tangan disemprot dengan alkohol 90%. Tiap
membuka tutup cawan petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, dan botol
didekatkan dengan Bunsen burner dengan jarak 10 cm.
8. Penambahan media
a. Media PCA dan PDA dituang secukupnya 0,5 cm. Cawan petri
digoyang-goyangkan agar sampel dan media homogen
b. Cawan petri dikelompokkan berdasarkan uji
9. Inkubasi
a. Media PCA yang telah memadat dimasukkan dalam inkubator
pada suhu 37C selama 24 jam, dalam posisi terbalik
b. Media PDA yang telah memadat diinkubasi dalam tempat gelap
pada suhu ruang (25C) selama 72 jam
10. Perhitungan jumlah koloni
a. Cawan diletakkan dengan posisi terbalik pada colony counter
b. Jumlah koloni pada cawan dihitung dan dicatat hasilnya
C. PARAMETER VALIDASI
1. Akurasi (Kecermatan)
Recovery=

H
100
A

Keterangan:
H = Hasil pengujian dengan metode
A = Hasil sebenarnya
* Range recovery adalah 80-120% (Feldsine, dkk., 2002)
2. Presisi

RSD=

SD
100
x

Keterangan:
SD = Standard deviation
x

= Rata-rata log

*Range RSD (Relative Standard Deviation) adalah 5-15% (Feldsine, dkk.,

2002)

DAFTAR PUSTAKA
Betsy, Tom & Jim Keogh, 2012, Microbiology Demystified, 2nd Edition, McGraw
and Hill Professional, New York.
BPOM, 2004, Pedoman Cara Pembuatan Obat Tradisional yang Baik, Badan
Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta
BPOM, 2006, Metode Analisis Mikrobiologi Suplemen 2000, Badan Pengawas
Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta.
BPOM, 2013, Petunjuk Operasional Penerapan Pedoman Cara Pembuatan Obat
yang Baik 2012, Jilid I, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik
Indonesia, Jakarta.
Ermer, J.H. dan McB. Miller, 2005, Method Validation in Pharmaceutical
Analysis: A Guide to Best Practice, Wiley-Vch. Verlag GmbH & Co,
Weinheim.
Feldsine, dkk., 2002, AOAC International Method Committee Guidelines for
Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official
Method Analysis, Journal of AOAC International, Vol. 85, No. 5.
Gandjar, I.G. & A. Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Belajar,
Yogyakarta.
ICH, 1995, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology,Q2 (R1).