VERIFIKASI METODE ANALISIS TOTAL PLATE COUNT (TPC)

1. TUJUAN mengonfirmasi unjuk kerja metode analisis TPC menggunakan larutan

pengencer fisiologis.
2. ACUAN Metode yang digunakan mengacu pada Standar Nasional Indonesia (SNI)
01-2970-2006 tentang Susu Bubuk dan metode verifikasi mengacu pada SAC-
SINGLAS (2002).
3. BAHAN yang digunakan pada percobaan ini terdiri dari bahan uji, kultur mikroba,
bahan kimia, dan media mikroorganisme. Bahan uji yang digunakan berupa susu
bubuk full cream. Kultur mikrob yang digunakan berupa Escherichia coli ATCC
25922. Bahan kimia yang digunakan yaitu air demineralisasi dan alkohol 70%.
Media mikroorganisme yang digunakan adalah buffered peptone water (BPW),
larutan pengencer fisiologis (larutan NaCl 0,85%), nutrient agar (NA), plate count
agar (PCA), TBX agar (tryptone bile x-glucuronide agar).
4. CARA KERJA
a. Penyegaran Kultur, Penyegaran kultur dilakukan dengan cara kultur murni
Escherichia coli ATCC 25922 digores pada media NA, kemudian diinkubasi
selama kurang lebih 24 jam pada suhu 35° C. Koloni tunggal yang tumbuh
diambil secara aseptik menggunakan ose yang kemudian dimasukkan dalam
BPW 45 mL setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35° C. Setelah
diinkubasi suspensi kultur disimpan dalam kulkas pada suhu 4 – 8° C
(suspensi bakteri dapat disimpan selama kurang lebih 2 minggu).
b. Uji Pendahuluan (Screening), Kultur mikroba Escherichia coli yang telah
diinkubasi pada suhu 35° C dipipet sebanyak 1,0 mL, kemudian dilarutkan ke
9 mL BPW. Pengenceran dilakukan sampai dengan tingkat pengenceran ke-
10. Setiap tingkat pengenceran dipipet sebanyak 1,0 mL secara duplo ke
cawan petri menggunakan 15 mL media PCA, kemudian ditunggu hingga
memadat. Media yang sudah memadat diinkubasi secara terbalik pada suhu
35° C selama 48 jam. Jumlah koloni dalam colony forming unit/mL (cfu/mL)
yang tumbuh pada setiap cawan petri dihitung menggunakan colony counter.
Menurut SAC-SINGLAS (2002), Jumlah koloni yang masuk rentang 25
sampai 250 koloni ditetapkan sebagai tingkat pengenceran sedang bakteri
(PSB). Satu tingkat pengenceran diatasnya ditetapkan sebagai pengenceran
 tinggi bakteri (PTB). Satu tingkat pengenceran di bawahnya ditetapkan
sebagai pengenceran rendah bakteri (PRB).
c. Pra Verifikasi, Pra verifikasi bertujuan membandingkan data teoritis yang

didapat dari screening dengan data yang didapat saat analisis pada tahap pra

verifikasi. Tahap pra verifikasi terdiri dari sampel only , pembuatan larutan

spike only dari tiga tingkat pengenceran (tinggi, sedang, dan rendah) dan

larutan sampel ditambahkan spike dari tiga tingkat pengenceran dengan

pengulangan masing-masing tingkat pengenceran tiga kali.

Sampel Only

Sampel susu bubuk full cream ditimbang 10 gram pada larutan pengencer fisiologis 90
mL dalam botol schott (disebut sebagai sampel only), kemudian dihomogenkan menggunakan
magnetic stirrer. Dipipet 1,0 mL dari botol schott sampel only ke dalam cawan petri dan
ditambahkan media PCA sebanyak 15 – 20 mL, kemudian dihomogenkan dengan metode tuang
dan didiamkan hingga media memadat kemudian diinkubasi secara terbalik pada suhu 35° C
selama 48 jam.
Spike Only

Suspensi atau spike bakteri dibuat seri pengenceran sesuai dengan hasil uji pendahuluan
yang telah ditentukan. Sebanyak 1,0 mL dari tingkat pengenceran 10-4 dipipet ke dalam 100 mL
larutan pengencer fisiologis disebut sebagai spike only tingkat pengenceran tinggi bakteri (PTB),
tingkat pengenceran 10-5 dipipet ke dalam 100 mL larutan pengencer fisiologis disebut sebagai
spike only tingkat pengenceran sedang bakteri (PSB), tingkat pengenceran 10 -6 dipipet ke dalam
100 mL larutan pengencer fisiologis disebut sebagai spike only tingkat pengenceran rendah
bakteri (PRB). Masing – masing spike only dari tingkat pengenceran dihomogenkan
menggunakan magnetic stirrer dan dipipet sebanyak 1,0 mL secara duplo ke cawan petri,
kemudian ditambahkan 15-20 mL media PCA, kemudian dihomogenkan dan didiamkan hingga
media memadat kemudian diinkubasi secara terbalik pada suhu 35° C selama 48 jam.

Sampel dan Spike

Sampel sebanyak 10 gram ditimbang langsung pada botol schott yang berisi larutan
pengencer fisiologis 90 mL. Cara kerja tersebut dilakukan pada sembilan botol schott. Larutan
sampel ditambahkan spike sebesar 1,0 mL dari masing-masing tingkat pengenceran (tinggi,
sedang, dan rendah) disebut sebagai sampel+spike. Setiap tingkat pengenceran dimasukkan ke
dalam tiga botol yang berbeda, kemudian dihomogenkan dengan magnetic stirrer. Masing-
masing larutan sample+spike dipipet sebanyak 1,0 mL secara duplo ke dalam cawan petri dan
ditambahkan 15-20 mL media PCA, kemudian dihomogenkan dan ditunggu hingga media
memadat. Diinkubasi secara terbalik pada suhu 35° C selama 48 jam. Pengamatan dilakukan
dengan menghitung jumlah bakteri menggunakan colony counter.

d. Verifikasi, Pada tahap verifikasi dilakukan perlakuan yang sama seperti

tahap pra verifikasi. Tahap verifikasi terdiri dari pembuatan sampel only ,
pembuatan spike only dari tingkat pengenceran yang masuk syarat
keberterimaan 25-250 koloni, dan larutan sampel yang ditambahkan spike dari
tingkat pengenceran yang masuk syarat keberterimaan 25-250 koloni dengan
pengulangan sebanyak 15 kali ulangan. Tingkat pengenceran yang digunakan
yaitu pengenceran 10-5 karena pada tingkat pengenceran tersebut bakteri yang
tumbuh memenuhi syarat keberterimaan yaitu 25-250 koloni (BADAN
STANDARDISASI NASIONAL, 2006).
e. Tahap Pengolahan Data

Presisi
Menurut SAC-SINGLAS (2002), nilai presisi ditentukan dengan menghitung
persentase KV dari hasil perhitungan jumlah koloni yang tumbuh pada setiap
pengulangan. Sampel dapat dikatakan presisi apabila memenuhi syarat keberterimaan
presisi yaitu %KV < 10%. Perhitungan untuk mencari nilai %KV adalah sebagai berikut :

n
%KV = √ ∑ ¿¿¿¿
i=1

Keterangan :
Aᵢ = pengulangan simplo
Bᵢ = pengulangan duplo
¿ = simpangan baku antar pengulangan dalam persamaan logaritma
x̅ = rata-rata simplo-duplo dalam persamaan logaritma
i = 1, 2, ..., n
p = jumlah pengulangan
 Akurasi

Menurut SAC-SINGLAS (2002), nilai akurasi ditentukan dengan menghitung

%recovery dari hasil perhitungan jumlah koloni pada sampel yang di spike, jumlah
koloni sampel tanpa spike, dan jumlah koloni bakteri spike.
5. Hasil pengujian dapat dikatakan akurasi apabila memenuhi syarat keberterimaan akurasi
yaitu %recovery berada pada rentang 80-120 %. Adapun perhitungan untuk mencari
%recovery adalah sebagai berikut :

Ns−Nu
%Recovery= x 100 %
Nd

Keterangan :
Ns = log jumlah koloni sampel+spike
Nu = log jumlah koloni sampel only
Nd = log jumlah koloni spike only