Webinar Pengujian Salmonella Sesuai ISO 6579-1 2017 - Harsi DK - Maret 2021

3/15/2021
Department of Food Science and Technology

Food Microbiology Division
ISO 6579-1:2017/Amd.1:2020
Mikrobiologi rantai pangan –
Metode horisontal untuk deteksi,
enumerasi dan serotyping Salmonella -
Bagian 1: Deteksi Salmonella spp.
Webinar Pengujian Salmonella

sesuai ISO 6579-1:2017, 15 Maret 2021
Harsi D. Kusumaningrum
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB
Ketua Komite Teknis 19-05 Metode Pengujian Mikrobiologi, BSN
Materi Pembahasan
• Pengantar
• Ruang Lingkup
• Prinsip
• Prosedur
• Laporan hasil uji
Harsi D Kusumaningrum, 2021
1
3/15/2021
Pengantar
ISO 6579: 2002 ISO 6579: 2002 / Cor 1: 2004
ISO 6579: 2002 / Amd 1: 2007 ISO 6579-1: 2017
ISO 6579-1: 2017 / Amd 1: 2020
Pengantar
• Dokumen ini menjelaskan metode horizontal untuk

mendeteksi Salmonella spp. dalam:
• pangan (termasuk susu dan produk susu, yang semula
dijelaskan dalam ISO 6785),
• pakan ternak,
• kotoran hewan, dan
• sampel lingkungan dari tahap produksi primer
yang semula dijelaskan dalam ISO 6579: 2002 / Amd 1: 2007
• Prosedur enumerasi Salmonella spp. dijelaskan dalam ISO/ TS
6579-2.
• Panduan serotyping Salmonella spp. dijelaskan dalam ISO/ TR
6579-3.
2
3/15/2021
Pengantar
ISO 6579-1 2017 ini membatalkan dan menggantikan ISO 6579: 2002 dan
ISO 6785: 2001 yang telah direvisi secara teknis, juga menggabungkan
ISO 6579: 2002 / Amd 1: 2007 dan ISO 6579: 2002 / Cor 1: 2004.
Perubahan utama dibandingkan dengan ISO 6579: 2002:
• ISO 6785 (susu dan produk susu) telah digabungkan pada dokumen
• Sampel dari tahap produksi primer telah ditambahkan ke ruang lingkup.
• Deteksi Salmonella Typhi dan Salmonella Paratyphi dijelaskan dalam
Lampiran D.
• Deskripsi penyiapan suspensi awal telah dihapus, kemudian mengacu
pada bagian yang relevan dari ISO 6887, jika memungkinkan.
• Kisaran suhu untuk inkubasi media non-selektif dan selektif telah
diperpanjang dari 37°C ± 1°C menjadi 34°C hingga 38°C tanpa
toleransi lebih lanjut.
Pengantar
Perubahan utama dibandingkan dengan ISO 6579: 2002 (lanjutan)
• Untuk pengayaan selektif, ada pilihan antara menggunakan broth atau

medium agar semi-padat Rappaport Vassiliadis (RVS atau MSRV)
untuk pangan, sampel pakan ternak, dan untuk sampel lingkungan dari
area produksi pangan.
• Inokulasi media isolasi menjadi kurang preskriptif; tujuannya adalah
untuk mendapatkan koloni yang terisolasi dengan baik setelah inkubasi.
• Untuk konfirmasi, pengujian boleh dilakukan pada satu koloni yang
dicurigai (bukan satu koloni dari setiap kombinasi media).
Jika isolat ini negatif Salmonella, empat isolat lain yang dicurigai dari
kombinasi media yang berbeda harus diuji.
3
3/15/2021
Pengantar
Perubahan utama dibandingkan dengan ISO 6579: 2002 (lanjutan)
• Diijinkan untuk melakukan konfirmasi biokimia secara langsung pada
koloni yang dicurigai dan terisolasi dengan baik dari media selektif.
Pemeriksaan kemurnian pada media agar non-selektif kemudian dapat
dilakukan secara paralel.
• Dua uji konfirmasi menjadi opsional (tes ß-galactosidase dan reaksi
indole) dan satu uji konfirmasi telah dihapus (reaksi Voges-Proskauer).
• Dalam dokumen ini dijelaskan konfirmasi serologis (ke tingkat
serogrup). Untuk panduan serotyping (ke level serovar) merujuk pada
referensi ISO / TR 6579-3.
• Tabel 1 (Interpretasi Uji Biokimia) telah diperbaiki.
• Pengujian kinerja untuk jaminan mutu media biakan telah ditambahkan
pada Lampiran B.
• Karakteristik kinerja MSRV telah ditambahkan pada Lampiran C.
Daftar Isi
1. Ruang Lingkup
2. Acuan normatif
3. Istilah dan definisi
4. Prinsip
5. Media kultur, reagen, dan antisera
6. Peralatan dan barang habis pakai
7. Pengambilan sampel
8. Persiapan sampel uji
9. Prosedur
10. Pernyataan hasil
11. Karakteristik kinerja metode
12. Laporan Hasil Uji
4
3/15/2021
Daftar Isi
Lampiran A (normatif) Diagram prosedur

Lampiran B (normatif) Media kultur dan reagen
Lampiran C (informatif) Studi validasi metode dan
karakteristik kinerja.
Lampiran D (informatif) Deteksi Salmonella enterica
subspesies enterica serovar Typhi
dan Paratyphi
Lampiran E (informatif) Contoh media pertumbuhan agar
selektif.
Bibliografi
RUANG LINGKUP
Mengapa SNI ISO 6579 ?
• Standar ini berlaku untuk:

• produk yang ditujukan untuk konsumsi manusia dan pakan hewan;
• sampel lingkungan di bidang produksi pangan dan penanganan
pangan;
• sampel dari tahap produksi primer seperti kotoran hewan, debu, dan
usap/swab.
• Dengan metode horizontal ini, sebagian besar serovar Salmonella dapat
dideteksi. Langkah-langkah tambahan mungkin diperlukan untuk deteksi
beberapa serovar tertentu. Prosedur deteksi untuk Salmonella Typhi dan
Salmonella Paratyphi dijelaskan pada Lampiran D.
• Media pengayaan selektif yang dimodifikasi, agar semi-padat Rappaport-
Vassiliadis (MSRV), dimaksudkan untuk mendeteksi Salmonella motil dan
tidak sesuai untuk mendeteksi strain Salmonella non-motil
5
3/15/2021
PRINSIP
Deteksi Salmonella dilakukan dengan empat tahap:
1. Pengayaan dalam media cair non selektif
2. Pengayaan pada/dalam media selektif
3. Penumbuhan pada media selektif padat
4. Konfirmasi
CATATAN
• Salmonella dapat ditemukan dalam jumlah rendah dan sering
disertai dengan Enterobacteriaceae lain atau bakteri dari famili
lain dalam jumlah yang jauh lebih besar .
• Pra-pengayaan digunakan untuk memungkinkan deteksi
Salmonella dengan jumlah rendah atau Salmonella yang terluka
(injury).
PRINSIP
1. Pra-pengayaan dalam media cair non-selektif
• Buffered peptone water, pada suhu kamar, diinokulasi

dengan porsi uji, kemudian diinkubasi antara 34°C dan 38°C
selama 18 jam.
• Untuk jumlah besar (misal 1 L atau lebih), disarankan untuk
menghangatkan BPW terlebih dahulu ke suhu 34°C hingga
38°C sebelum mencampurnya dengan porsi uji.
6
3/15/2021
PRINSIP
2. Pengayaan dalam/pada media selektif
• Medium Rappaport-Vassiliadis with soya (RVS broth) atau Modified
Semi-solid agar Rappaport-Vassiliadis (MSRV) dan Muller-Kauffmann
tetrathionate/novobiocin broth (MKTTn broth) diinokulasi dengan
biakan yang diperoleh dari tahap pra-pengayaan.
• RVS broth atau MSRV agar diinkubasi pada suhu 41,5°C selama 24
jam dan MKTTn broth pada suhu antara 34°C dan 38°C selama 24
jam.
• Untuk beberapa produk, medium/media pengayaan selektif mungkin
perlu diinkubasi selama 24 jam lagi
CATATAN
Media agar MSRV digunakan untuk deteksi strain Salmonella
motil dan tidak sesuai untuk deteksi strain Salmonella non-motil
PRINSIP
3. Penumbuhan pada media padat selektif
• Biakan yang diperoleh dalam pengayaan selektif diinokulasikan pada
dua media selektif padat berikut:
• Agar Xylose Lysine Deoxycholate (agar XLD);
• media selektif padat lainnya yang melengkapi agar XLD (sebagai
contoh, lihat Lampiran E).
• Agar XLD diinkubasi pada suhu antara 34°C dan 38°C, kemudian
diamati setelah 24 jam.
Agar selektif kedua diinkubasi sesuai dengan instruksi pabrikan.
4. Konfirmasi
Koloni Salmonella terduga disub-biakan dan identitasnya dikonfirmasi
dengan uji biokimia dan serologi yang sesuai.
7
3/15/2021
Pra- Sampel + Buffered peptone water (BPW):

pengayaan
pengenceran 10 kali, 18 jam±2 jam pada
suhu 34 oC hingga 38 oC
Pengayaan 0,1 ml biakan + 1 ml biakan +

selektif 10 ml RVS broth atau MSRV 10 ml MKTTn broth,
agar, 24 jam ± 3 jam pada 24 jam ± 3 jam pada suhu
suhu 41,5 oC  1 oC 34 oC hingga 38 oC
Pertumbuhan Agar XLD

selektif 24 jam±3 jam pada suhu 34 oC hingga 38 oC
+ agar isolasi kedua
Uji setidaknya 1 koloni khas atau

terduga. Jika negatif, uji 4 koloni
tambahan yang sudah ditandai
Konfirmasi
Agar non-selektif
24 jam ± 3 jam pada suhu 34 oC – 38 oC
Konfirmasi biokimia Konfirmasi serologi
Pernyataan hasil
Prosedur untuk contoh pangan, pakan hewan dan contoh lingkungan

dari area produksi pangan Harsi D Kusumaningrum, 2021
PROSEDUR
1. Porsi uji dan suspensi awal
• Untuk penyiapan suspensi awal, pada kasus umum, gunakan media
pra-pengayaan buffered peptone water (BPW) sebagai pengencer.
Hangatkan terlebih dahulu BPW ke suhu ruang sebelum digunakan.
• Umumnya, jumlah porsi uji (massa atau volume) ditambahkan ke
dalam sejumlah BPW (massa atau volume) untuk memperoleh
pengenceran 10 kali. Untuk ini, porsi uji 25 g dicampurkan dengan
225 mL BPW. Untuk beberapa jenis contoh (misal. boot socks, debu),
mungkin diperlukan rasio lainnya.
• Untuk produk spesifik, ikuti prosedur yang ditetapkan dalam ISO
6887 (semua bagian).
8
3/15/2021
PROSEDUR
1. Porsi uji dan suspensi awal (lanjutan)
• Dokumen ini sudah divalidasi untuk porsi uji 25 g.

• Porsi uji yang lebih kecil dapat digunakan tanpa perlu dilakukan
validasi/verifikasi tambahan jika rasio yang sama antara broth (pra-)
pengayaan dan porsi uji dipertahankan.
• Porsi uji yang lebih besar dapat digunakan, jika studi
validasi/verifikasi menunjukkan tidak ada pengaruh negatif pada
deteksi Salmonella spp.
CATATAN 1
• Validasi dapat dilakukan berdasarkan bagian yang sesuai dari ISO 16140.
• Verifikasi untuk penggabungan (pooling) sampel dapat dilakukan
berdasarkan protokol yang dijelaskan dalam ISO 6887-1
PROSEDUR
1. Porsi uji dan suspensi awal (lanjutan)
Untuk jumlah besar (misal 1L atau lebih), disarankan untuk

menghangatkan BPW terlebih dahulu ke suhu 34 °C hingga 38 °C
sebelum mencampurkannya dengan porsi uji.
CATATAN 2
• Jika lebih dari satu porsi uji 25 g dari lot produk yang ditentukan untuk
diuji dan jika tersedia bukti bahwa menggabungkan porsi uji tidak
mempengaruhi hasil untuk pangan tertentu, maka porsi uji dapat
digabungkan.
• Informasi lebih lanjut tentang penggabungan contoh serta prosedur
untuk menguji pengaruh penggabungan terhadap sensitivitas metode
dapat ditemukan dalam ISO 6887-1
9
3/15/2021
PROSEDUR
2. Pra-pengayaan non-selektif
• Inkubasi suspensi awal pada suhu antara 34 °C dan 38 °C (a) selama

18 jam ± 2 jam.
• Diperbolehkan untuk menyimpan contoh pra-pengayaan setelah
inkubasi pada suhu 5 °C (b) selama maksimal 72 jam
(a) Inkubator, mampu beroperasi pada kisaran suhu 34°C hingga 38°C
Catatan
kisaran suhu 34°C hingga 38°C untuk inkubasi media adalah termasuk
penggunaan inkubator yang diset pada suhu 35°C±1°C, 36°C±2°C atau
37°C±1°C.
(b) Lemari pendingin, mampu beroperasi pada suhu 5°C ± 3°C
PROSEDUR
3. Pengayaan selektif
• Biarkan media pengayaan selektif, RVS broth atau MSRV agar, dan
MKTTn broth hingga mencapai suhu ruang jika sebelumnya disimpan
pada suhu yang lebih rendah.
• Minimalkan terbawanya partikel halus dari media pra-pengayaan
ke dalam media pengayaan selektif.
• Setelah inkubasi, diperbolehkan untuk menyimpan pengayaan
selektif pada suhu 5 °C selama maksimal 72 jam
CATATAN
MSRV agar ditujukan untuk deteksi strain Salmonella motil dan tidak
sesuai untuk deteksi strain Salmonella non-motil.
10
3/15/2021
PROSEDUR
3. Pengayaan selektif (lanjutan)

dari area produksi pangan:
• Pindahkan 0,1 mL biakan yang diperoleh dari pra pengayaan non

selektif ke dalam tabung yang mengandung 10 mL RVS broth atau
ke atas permukaan cawan agar MSRV.
Inokulasi agar MSRV dengan satu hingga tiga titik dengan jarak yang
sama pada permukaan medium
• Pindahkan 1 mL biakan juga ke dalam tabung yang mengandung 10
mL MKTTn broth
PROSEDUR

• Inkubasi RVS broth yang sudah diinokulasi pada suhu 41,5 °C (c)
selama 24 jam ± 3 jam
• Inkubasi cawan agar MSRV pada suhu 41,5 °C (c) selama 24 jam ± 3
jam. Jangan membalik cawan
• Inkubasi MKTTn broth yang sudah diinokulasi pada suhu antara 34 °C
dan 38 °C selama 24 jam ± 3 jam.
(c) Inkubator, mampu beroperasi pada suhu 41,5 °C ± 1 °C , atau penangas
air yang mampu beroperasi pada suhu 41,5 °C ± 1 °C.
11
3/15/2021
PROSEDUR

• Cawan MSRV terduga akan menunjukkan zona keruh berwarna putih
keabuan, yang melebar dari tetesan inokulasi.
• Dalam produk susu kering dan keju, Salmonella mungkin dalam
kondisi terluka dan hampir mati (sublethally injured). Inkubasi media
pengayaan selektif dari produk ini dengan tambahan waktu 24 jam ±
3 jam
• Untuk beberapa produk lainnya, misal ketika
melakukan investigasi sampel dari kasus saat
terjadi wabah (outbreak), waktu inkubasi
tambahan ini mungkin juga bermanfaat.
PROSEDUR
4. Penumbuhan pada media agar selektif
• Dari biakan pengayaan selektif, inokulasi dua media agar isolasi

selektif: medium isolasi pertama adalah Xylose Lysine Deoxycholate
(XLD) agar, medium isolasi kedua dipilih oleh laboratorium penguji
• Pilih medium penumbuhan selektif kedua yang komplementer
dengan agar XLD dan berdasarkan pada karakteristik diagnostik yang
berbeda terhadap agar XLD untuk memfasilitasi deteksi dari,
misalnya, Salmonella positif laktosa atau negatif H2S. Untuk contoh
media isolasi, lihat Lampiran E.
• Biarkan cawan agar XLD dan media penumbuhan selektif kedua
untuk mencapai suhu ruang jika sebelumnya disimpan pada suhu
yang lebih rendah. Jika diperlukan, keringkan permukaan cawan
sebelum digunakan (lihat ISO 11133).
12
3/15/2021
PROSEDUR
4. Penumbuhan pada media agar selektif (lanjutan)
• Dari biakan yang diperoleh dari RVS broth, gores permukaan cawan
XLD dengan jarum Ose 10 µl (diameter 3 mm) sehingga diperoleh
koloni yang terpisah dengan baik. Lakukan dengan cara yang sama
dengan media penumbuhan selektif kedua.
• Dari pertumbuhan positif pada MSRV agar, tentukan titik terjauh
pertumbuhan opak (opaque) dari titik inokulasi dan tusukkan jarum
Ose 1 µl ke dalam batas pertumbuhan opak.
Tarik Ose dan pastikan tidak ada gumpalan besar MSRV agar yang
terbawa. Inokulasikan permukaan cawan XLD sehingga diperoleh
koloni yang terpisah dengan baik. Lakukan cara yang sama untuk
media penumbuhan selektif kedua.
PROSEDUR
• Dari biakan yang diperoleh dari MKTTn broth, inokulasi permukaan
cawan agar XLD dengan jarum Ose 10 µl (diameter 3 mm) sehingga
diperoleh koloni yang terpisah dengan baik. Lakukan cara yang sama
untuk media penumbuhan selektif kedua.
CATATAN 1
Untuk memperoleh koloni yang terpisah dengan baik dapat digunakan
cawan Petri berukuran besar (diameter kira-kira 140 mm) atau dua cawan
berukuran normal (diameter kira-kira 90 mm).
• Inkubasi cawan XLD yang dibalik pada suhu antara 34°C sampai 38°C
selama 24 jam ± 3 jam
• Inkubasi medium penumbuhan selektif kedua berdasarkan instruksi
pabrikan.
13
3/15/2021
PROSEDUR
• Koloni khas Salmonella pada agar XLD memiliki bagian tengah yang
hitam dan zona agak transparan berwarna kemerahan disebabkan
perubahan warna dari indikator.
CATATAN 2
Variasi Salmonella negatif H2S yang tumbuh pada agar XLD berwarna
merah muda dengan bagian tengah warna merah muda yang lebih gelap.
Salmonella positif laktosa yang tumbuh pada agar XLD berwarna kuning
dengan atau tanpa penghitaman. Munculnya fenotip ini dirangkum dalam
Tabel 1.
• Amati media penumbuhan selektif kedua setelah waktu inkubasi
yang sesuai untuk keberadaan koloni yang dari karakteristiknya,
diperhitungkan sebagai Salmonella terduga.
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Umum
• Kombinasi hasil uji biokimia dan serologi menunjukkan apakah suatu
isolat termasuk ke dalam genus Salmonella.
Untuk karakterisasi strain Salmonella diperlukan serotyping. Panduan
untuk serotyping dijelaskan dalam ISO/TR 6579-3
• Untuk beberapa media konfirmasi tersedia formulasi alternatif
(komersial), yang juga dapat digunakan untuk konfirmasi biokimia
pada Salmonella. Formulasi alternatif ini diperbolehkan, jika kinerja
konfirmasi biokimia terhadap Salmonella diverifikasi sebelum
digunakan.
14
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Umum
• Untuk pembedaan yang jelas antara reaksi biokimia positif dan
negatif, akan sangat membantu untuk melakukan verifikasi reaksi
media pada masing-masing uji biokimia dengan strain kontrol positif
dan negatif yang dikarakterisasi dengan baik.
CATATAN 1 Pengenalan koloni Salmonella sebagian besar merupakan
masalah pengalaman, dan kenampakan koloni dapat bervariasi, tidak hanya
dari serovar ke serovar, tetapi juga dari batch ke batch medium biakan
selektif yang digunakan.
• Jika terbukti handal, galeri miniatur untuk identifikasi biokimia
Salmonella dapat digunakan (lihat ISO 7218).
CATATAN 2 Prosedur alternatif dapat digunakan untuk mengonfirmasi
isolat sebagai Salmonella spp. jika kesesuaian prosedur alternatif tersebut
sudah diverifikasi (lihat ISO 7218).
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pemilihan koloni untuk konfirmasi
• Tandai koloni terduga pada masing-masing cawan media selektif.
Pilih setidaknya satu koloni khas atau koloni terduga untuk disub-
biakan dan konfirmasi.
Jika negatif, pilih hingga empat koloni lagi untuk memastikan bahwa
koloni-koloni ini disub-biakan dari berbagai kombinasi media
pengayaan/isolasi yang menunjukkan pertumbuhan yang dicurigai.
• Gores koloni yang dipilih pada permukaan media agar non-selektif
yang sudah dikeringkan (misal Nutrient agar) sehingga dapat
diperoleh koloni yang terpisah dengan baik.
Inkubasi cawan yang diinokulasi pada suhu antara 34°C dan 38°C
selama 24 jam ± 3 jam.
15
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pemilihan koloni untuk konfirmasi
• Sebagai alternatif, jika koloni yang terpisah dengan baik dan murni
terdapat pada media penumbuhan selektif, konfirmasi biokimia
dapat dilakukan langsung dari koloni terduga tersebut. Tahap
pembiakan pada medium agar non-selektif kemudian dapat
dilakukan secara paralel dengan uji biokimia untuk memeriksa
kemurnian koloni yang diambil dari medium agar selektif.
• Gunakan biakan murni untuk konfirmasi biokimia dan serologi
CATATAN
Untuk tujuan epidemiologi atau selama investigasi wabah, konfirmasi koloni
tambahan, misal lima koloni khas atau terduga dari masing-masing
kombinasi medium pengayaan/isolasi, akan bermanfaat.
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian biokimia
• Inokulasikan media konfirmasi biokimia dengan masing-masing
biakan yang diperoleh dari koloni yang dipilih pada media selektif
(lihat dokumen butir 9.4) atau koloni yang dipilih untuk konfirmasi
(lihat dokumen butir 9.5.2).
• Untuk konfirmasi Salmonella spp., setidaknya harus dilakukan uji TSI
agar, Urea Agar dan medium L-Lysine decarboxylation.
• Uji deteksi β -galactosidase dan reaksi indol juga dapat dilakukan,
jika hasil uji konfirmasi lainnya tidak memberikan identifikasi yang
jelas
16
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian biokimia: TSI agar
• Gores permukaan agar miring dan tusuk bagian tegak (butt).
Inkubasi pada suhu antara 34°C hingga 38°C selama 24 jam±3 jam.
• Interpretasikan perubahannya pada medium sebagai berikut:
a) bagian tegak
₋ kuning : positif glukosa (penggunaan glukosa)
₋ merah atau tidak berubah: negatif glukosa (tidak ada
penggunaan glukosa)
₋ hitam : pembentukan hidrogen sulfida
₋ gelembung atau retak : pembentukan gas dari glukosa
PROSEDUR
5. Konfirmasi
• Interpretasikan perubahannya pada medium sebagai berikut:
b) bagian permukaan miring
₋ kuning : positif laktosa dan/atau sukrosa (penggunaan laktosa
dan/atau sukrosa)
₋ merah atau tidak berubah : negatif laktosa dan/atau sukrosa
(tidak ada penggunaan laktosa atau sukrosa)
17
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
• Sebagian besar biakan Salmonella khas menunjukkan alkalin pada
agar miring (merah) dan asam (kuning) pada bagian tegak dengan
pembentukan gas (gelembung) dan (pada sekitar 90% kasus)
pembentukan hidrogen sulfida (penghitaman agar) (lihat Tabel 1).
• Ketika Salmonella positif laktosa diisolasi, permukaan miring TSI
berwarna kuning. Sehingga, konfirmasi pendahuluan pada biakan
Salmonella tidak harus berdasarkan pada hasil dari uji TSI agar saja
(lihat 9.5.3.1).
CATATAN
Medium Kligler-Hajna memberikan hasil yang serupa dengan TSI agar
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian biokimia: Urea agar
• Gores permukaan agar miring. Inkubasi pada suhu antara 34°C dan
38°C selama 24 jam±3 jam.
• Jika reaksi positif, urea akan dihidrolisis melepaskan ammonia. Ini
merubah warna phenol red menjadi pink-rose dan selanjutnya
menjadi lebih gelap (deep cerise). Reaksi tersebut seringkali muncul
setelah 2 jam hingga 4 jam.
• Biakan Salmonella khas tidak menghidrolisis urea sehingga warna
urea agar tidak berubah (lihat Tabel 1.)
18
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian biokimia: Medium L-Lysine decarboxylation (LDC)
• Inokulasi tepat di bawah permukaan media cair.

Inkubasi pada suhu antara 34°C dan 38°C selama 24 jam±3 jam.
• Kekeruhan dan warna ungu setelah inkubasi menunjukkan reaksi
positif. Warna kuning menunjukkan reaksi negatif.
• Sebagian besar biakan Salmonella khas menunjukkan reaksi positif
pada LDC (lihat Tabel 1.)
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian biokimia: Deteksi β -galactosidase (opsional)
• Uji β-galactosidase dapat digunakan untuk membedakan Salmonella

enterica subspesies arizonae dan diarizonae dan anggota
Enterobacteriaceae lainnya (semua memberikan reaksi positif), dari
subspesies Salmonella enterica lainnya (umumnya memberikan
reaksi negatif, lihat Tabel 1).
• Ada beberapa prosedur untuk melakukan uji β-galactosidase.
Contoh diberikan dibawah ini.
• Masukkan satu jarum Ose koloni terduga ke dalam tabung
mengandung 0,25 mL larutan garam (0.85%).
19
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
• Tambahkan 1 tetes toluene dan kocok tabung. Tempatkan tabung
dalam penangas air dan inkubasi pada suhu antara 34°C dan 38°C(d)
beberapa menit (sekitar 5 menit).
Tambahkan 0,25 mL pereaksi untuk deteksi β-galactosidase (larutan
ONPG dalam larutan buffer), kemudian campurkan.
(d) Penangas air, mampu beroperasi pada kisaran suhu 34°C hingga 38°C
Catatan kisaran suhu 34°C hingga 38°C untuk inkubasi media adalah
termasuk penggunaan penangas air yang diset pada suhu 35°C±1°C,
36°C±2°C atau 37°C±1°C.
PROSEDUR
5. Konfirmasi
• Tempatkan kembali tabung ke dalam penangas air dan inkubasi pada
suhu antara 34°C dan 38°C (d) selama 24 jam.
• Warna kuning menunjukkan reaksi positif. Reaksi seringkali muncul
setelah 20 menit.
• Jika menggunakan kertas cakram (paper disc) siap pakai untuk
deteksi β-galactosidase, ikuti instruksi pabrikan.
(d) Penangas air, mampu beroperasi pada kisaran suhu 34°C hingga 38°C
Catatan kisaran suhu 34°C hingga 38°C untuk inkubasi media adalah
termasuk penggunaan penangas air yang diset pada suhu 35°C±1°C,
36°C±2°C atau 37°C±1°C.
20
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian biokimia: Reaksi indol (opsional)
• Uji indol dapat digunakan jika diperlukan untuk membedakan
Salmonella (umumnya negatif indol, lihat Tabel 1) dari Escherichia
coli dan Citrobacter (keduanya positif indol), karena organisme ini
dapat memberikan reaksi khas pada beberapa media isolasi
Salmonella.
• Inokulasi tabung yang mengandung 5 mL medium tryptone/
tryptophan menggunakan koloni terduga.
• Inkubasi pada inkubator suhu antara 34°C dan 38°C selama 24 jam±3
jam. Setelah inkubasi, tambahkan 1 mL pereaksi Kovacs.
• Pembentukan cincin merah (lapisan permukaan) menunjukkan reaksi
positif. Cincin kuning kecoklatan (lapisan permukaan) menunjukkan
reaksi negatif.
Tabel 1 — Interpretasi uji biokimia

Ujia Strain Salmonella
S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C S. Gallinarum S. Gallinarum Strain lainnyag
biovar biovar
gallinarumb pullorumb
Reaksi %+c Reaksi %+c Reaksi %+d Reaksi %+d Reaksi %+c Reaksi %+c Reaksi %+c
TSI asam dari
glukosa + 100 + 100 + 100 + 100 + 100 + 100 + 100
TSI gas dari
glukosa −e 0 + 96,1 + 96,1 + 96,1 - 0 + 95,1 + 92
TSI asam dari
laktosa − 2 − 0 − 0 − 0 − 0 − 0 − 1h
TSI asam dari
sukrosa − 0 − 0,6 − 0,6 − 0,6 − 0,6 − 0,6 − 1
TSI produksi
hidrogen + 97 − 10 + 100 + 100 Vf Vf + 92
sulfida
Hidrolisis urea − 0 − 0 − 0 − 0 − 0 − 0 − 1
Dekarboksilasi
lysine + 98 − 0 + 95 + 100 + 95 + 95 + 95
Reaksi β-
Galactosidase − 0 − 0 − − − <10 − <10 − 2h
Produksi indol − 0 − 1,2 − 1,2 − 1,2 − 1,2 − 1,2 − 1
a Dari Acuan [13] and [14].
b Dari Acuan [11],[13] and [14].
c Persentase menunjukkan bahwa tidak semua isolat serovar Salmonella menunjukkan reaksi yang ditandai + atau −. Reaksi dapat bervariasi
antara dan dalam serovar
d Kolom kosong: Persentase tidak diketahui dari literatur yang tersedia
e Salmonella Typhi bersifat anaerogenik [tidak menghasilkan (menekan pembentukan) udara atau gas)
f V = Hasil variabel.
g Untuk pembedaan lebih lanjut antara spesies dan subspesies Salmonella, lihat ISO/TR 6579-3.[24]
h Salmonella enterica subspesies arizonae dan diarizonae selalu memberikan hasil positif pada reaksi β-galactosidase. Beberapa strain
subspesies arizonae dan diarizonae dapat menggunakan laktosa.
21
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian serologis: Umum
• Koloni murni yang menunjukkan reaksi biokimia khas untuk
Salmonella juga diuji untuk keberadaan Salmonella antigen-O dan -H
(dan, jika Salmonella Typhi diperkirakan ada di dalam suplai pangan,
juga untuk antigen-Vi) dengan slide agglutination menggunakan
antisera polyvalent.
• Koloni murni dibiakkan di medium agar non selektif dan diuji untuk
auto-aglutinasi.
• Strain yang auto-agglutinable tidak dapat diuji untuk keberadaan
antigen Salmonella.
• Gunakan antisera berdasarkan instruksi pabrikan jika berbeda
dengan metode yang dijelaskan di bawah ini untuk mendeteksi
keberadaan Salmonella antigen-O dan -H (dan jika diperlukan, juga
untuk antigen -Vi).
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian serologis: Umum
• Uji berikut (eliminasi strain auto-agglutinable, pengujian antigen-O,
antigen-H dan antigen-Vi (opsional) ) merupakan persyaratan
minimum untuk pengujian serologis pada Salmonella spp.
• Panduan lebih lanjut untuk konfirmasi serologis dan serotyping
dijelaskan dalam ISO/TR 6579-3
22
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian serologis: Eliminasi strain auto-agglutinable
• Teteskan satu tetes larutan garam (0,85%) pada gelas obyek yang
bersih. Campurkan bagian dari koloni yang akan diuji ke dalam
tetesan tersebut menggunakan jarum Ose, untuk mendapatkan
suspensi yang homogen dan keruh.
• Goyangkan gelas obyek dengan perlahan selama 5 detik hingga 60
detik (tergantung pada instruksi pabrikan). Amati suspensi, lebih baik
dengan latar yang gelap.
• Jika bakteri membentuk granula (butiran) dalam suspensi, hal ini
menunjukkan auto-aglutinasi dan konfirmasi serologis akan menjadi
rumit.
• Informasi tambahan pada perlakuan strain auto-aglutinasi dapat
ditemukan dalam ISO/TR 6579-3
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian serologis: Pengujian antigen-O
• Dengan menggunakan koloni murni non-auto-aglutinasi, lakukan
berdasarkan uji auto-aglutinasi, menggunakan satu tetes sera anti-O
menggantikan larutan garam.
• Jika terjadi aglutinasi, reaksi dianggap positif.
Pengujian serologis: Pengujian antigen-Vi (opsional)

berdasarkan uji auto-aglutinasi, menggunakan satu tetes sera anti-Vi
23
3/15/2021
PROSEDUR
5. Konfirmasi
Pengujian serologis: Pengujian antigen-H
berdasarkan uji auto-aglutinasi, menggunakan satu tetes sera anti-H
Interpretasi hasil reaksi biokimia dan serologis

• Tabel 2 memberikan interpretasi uji konfirmasi yang dilakukan
terhadap koloni yang digunakan
Tabel 2 — Interpretasi uji konfirmasi
Reaksi biokimia Auto-aglutinasi Reaksi serologi Interpretasi

Positif antigen-O Strain
dan -H dipertimbangkan
Khas Tidak
(dan positif Vi jika sebagai
diuji ) Salmonella
Negatif antigen-O
Khas Tidak
dan/atau -H
Salmonella
Tidak diuji karena
terduga
Khas Ya auto-aglutinasi
(lihat 9.5.4.2)
Tidak
Tidak ada reaksi dipertimbangkan
— —
khas sebagai
Salmonella
24
3/15/2021
PROSEDUR
6. Serotyping
• Strain yang dikonfirmasi sebagai Salmonella spp. (Tabel 2) dapat di
typing lebih lanjut hingga tingkat serovar. Panduan untuk serotyping
dijelaskan dalam ISO/TR 6579-3
• Jika diperlukan, strain terkonfirmasi dapat dikirim ke pusat acuan
Salmonella yang diakui untuk typing definitif (serotyping, phage
typing, molecular typing). Jika strain dikirim ke pusat acuan,
sebaiknya disertai dengan semua informasi yang relevan seperti hasil
konfirmasi, sumber dari mana strain diisolasi, dan apakah isolat
terkait dengan suatu wabah/outbreak.
Pernyataan hasil
• Sesuai dengan interpretasi hasil, menunjukkan Salmonella

terdeteksi atau tidak terdeteksi pada porsi uji x g atau x mL
dari produk (lihat ISO 7218), atau pada area permukaan, atau
pada suatu objek (misal. boot socks).
25
3/15/2021
Laporan hasil uji
Laporan uji harus mencantumkan hal-hal berikut ini :

• metode pengambilan sampel yang digunakan, jika diketahui;
• ukuran porsi uji dan/atau sifat objek yang diperiksa;
• metode uji yang digunakan, dengan acuan terhadap dokumen
ini, misal. ISO 6579-1;
• setiap penyimpangan dalam media pengayaan atau kondisi
inkubasi yang digunakan;
• semua kondisi operasional yang tidak dijelaskan dalam
dokumen ini, atau dianggap sebagai pilihan, bersama dengan
rincian setiap kejadian yang mungkin mempengaruhi hasil;
• hasil yang diperoleh.
Selengkapnya lihat
ISO 6579-1:2017
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 1: Detection of Salmonella spp.
ISO 6579-1:2017/Amd.1:2020
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 1: Detection of Salmonella spp.
26
3/15/2021
Mengenal spesies dan subspesies Salmonella
MLEE: Multilocus enzyme

electrophoresis analysis
MLST: Multilocus Sequence Typing
Achtman et al., 2012

doi: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002776.g001 Harsi D Kusumaningrum, 2021
27
3/15/2021
Terima kasih
h_kusumaningrum@apps.ipb.ac.id
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian, IPB
Kampus IPB Darmaga, Telp. 02518626725
Acuan Penyiapan contoh
• SNI ISO 6887-1 (rev 2017) Aturan umum untuk penyiapan

suspensi awal dan pengenceran desimal
• SNI ISO 6887-2 (rev 2017) Aturan khusus untuk penyiapan daging
dan produk daging
• SNI ISO 6887-3 (rev 2017) Aturan khusus untuk penyiapan ikan
dan produk perikanan
• SNI ISO 6887-4 Aturan khusus untuk produk selain susu dan
produk susu, daging dan produk daging, ikan dan produk
perikanan
• SNI ISO 6887-5 Aturan khusus untuk penyiapan susu dan produk
susu
• SNI ISO 6887-6 Aturan spesifik penyiapan contoh uji yang diambil
56
pada tahap produksi utama

28
3/15/2021
Penanganan Contoh sebelum Analisis

Produk yang bersifat asam
• Ketika menggunakan larutan suspensi produk yang bersifat asam, penting
untuk memastikan bahwa pH tersebut kembali netral.
• Penggunaan pengencer dengan penambahan indikator pH; dapat
menghindari keperluan untuk penggunaan dan mensterilkan probe pH;
tambahkan natrium hidroksida (NaOH) sampai indikator mulai berubah
untuk mengembalikan warna dari suspensi.
• Bila menggunakan pengencer bufer, penambahan NaOH seringkali
diperlukan untuk meningkatkan kapasitas bufer/penyangga komponen
alkali. Konsentrasi NaOH yang ditambahkan tergantung pada keasaman
produk. Konsentrasi yang paling sesuai (misalnya 0,1 mol/L atau 1 mol/L)
adalah konsentrasi yang mendekati perbandingan 1 : 9 dengan pengencer
SNI ISO 6887-2/3/4/5

29

Webinar Pengujian Salmonella Sesuai ISO 6579-1 2017 - Harsi DK - Maret 2021

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Webinar Pengujian Salmonella Sesuai ISO 6579-1 2017 - Harsi DK - Maret 2021

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

3/15/2021

Department of Food Science and Technology

Webinar Pengujian Salmonella

Harsi D Kusumaningrum, 2021

ISO 6579: 2002 / Amd 1: 2007 ISO 6579-1: 2017

ISO 6579-1: 2017 / Amd 1: 2020

Harsi D Kusumaningrum, 2021

• Dokumen ini menjelaskan metode horizontal untuk

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

• Untuk pengayaan selektif, ada pilihan antara menggunakan broth atau

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Lampiran A (normatif) Diagram prosedur

Harsi D Kusumaningrum, 2021

• Standar ini berlaku untuk:

Harsi D Kusumaningrum, 2021

1. Pra-pengayaan dalam media cair non-selektif

• Buffered peptone water, pada suhu kamar, diinokulasi

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Pra- Sampel + Buffered peptone water (BPW):

Pengayaan 0,1 ml biakan + 1 ml biakan +

Pertumbuhan Agar XLD

Uji setidaknya 1 koloni khas atau

Konfirmasi biokimia Konfirmasi serologi

Prosedur untuk contoh pangan, pakan hewan dan contoh lingkungan

Harsi D Kusumaningrum, 2021

• Dokumen ini sudah divalidasi untuk porsi uji 25 g.

Untuk jumlah besar (misal 1L atau lebih), disarankan untuk

Harsi D Kusumaningrum, 2021

• Inkubasi suspensi awal pada suhu antara 34 °C dan 38 °C (a) selama

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Prosedur untuk contoh pangan, pakan hewan dan contoh lingkungan

• Pindahkan 0,1 mL biakan yang diperoleh dari pra pengayaan non

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Prosedur untuk contoh pangan, pakan hewan dan contoh lingkungan

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Prosedur untuk contoh pangan, pakan hewan dan contoh lingkungan

• Dari biakan pengayaan selektif, inokulasi dua media agar isolasi

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

• Inokulasi tepat di bawah permukaan media cair.

Harsi D Kusumaningrum, 2021

• Uji β-galactosidase dapat digunakan untuk membedakan Salmonella

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Tabel 1 — Interpretasi uji biokimia

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Pengujian serologis: Pengujian antigen-Vi (opsional)

Harsi D Kusumaningrum, 2021

Interpretasi hasil reaksi biokimia dan serologis

Harsi D Kusumaningrum, 2021