VALIDASI /VERIFIKASI METODE

ANALISIS MIKROBIOLOGI

R.E. PRIYONO*

*Pelatihan Validasi/verifikasi metode uji ALT PT SOHO, di PPOMN

21-24 Maret 2016
 PUSTAKA
• AOAC 2012. AOAC International Method Committee
Guidelines for Validation of Microbiological Methods
for Food and Environmental surfaces
• ISO 16140-2003, Microbiology of Food and Animal
Feeding Stuffs-Protocol for the Validation of
Alternative Methods
• Sac-singlas, 2002. Guidance Notes C & B and ENV
002. Method Validation of Microbiological Methods
• USP 37
METODE UJI ANGKA LEMPENG
TOTAL, USP
 UJI PENDAHULUAN

• Validitas hasil uji, ditentukan hal-hal sbb:

media TSA diinokulasi dg 25-250 cfu
Staphylococcus aureus, E.coli dan Bacillus
subtilis duplo, rekoveri > 70%
• dst
 MEDIA DAN PELARUT/PENGENCER
• PENGENCER
Larutan Dapar Fosfat pH 7,2
• MEDIA
 Fluid Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20
Medium
 Soybean-Casein Digest-Agar Medium (TSA)
 Fliud Soybean-Casein Digest Medium (TSB)
 Catatan : setiap bets media seharusnya diuji
fertilitasnya (GPT)
 PROSEDUR
• SAMPEL : 10 mL atau 10 g
• PROSEDUR : Siapkan sampel yg akan diuji dg perlakuan yg
sesuai dg sifat fisik sampel dan tidak mengurangi jumlah dan
macam mikroba yang ada dalam sampel
- untuk sampel padat dilarutkan sedikit demi sedikit untuk
mereduksi sampel sampai terlarut, kemudian ditambahkan
sampai 90 mL LDF pH 7,2
- untuk sampel cairan/likuid, suspensi dalam air, suspensi
dalam 30% alkohol (hydroalcoholic) langsung ditambahkan
90 mL PDF pH 7,2
- untuk sampel tidak larut air, dibantu dg sedikit emulsifier
steril (polisorbat 20), blender, dipanaskan pd < 45˚C
 PROSEDUR
Total Aerobic Microbial Count
• Sampel yang terlarut dg baik, uji dg Metode Filtrasi Membran
atau Metode Cawan (Plate Count)
• Sampel cukup terlarut atau translusen, uji dg Metode Cawan
atau Metode Tabung Ganda (MPN/APM)
• Enceran pertama timbang 10 g atau pipet 10 mL secara
akurat, bila sampel cairan tambahkan sampai 100 mL PDF pH
7,2, TSB atau FCDSLP
• Untuk cairan kental yg tidak dpt dipipet pd 1:10, lakukan
pengenceran sampel smp diperoleh suspensi, misal 1:50 atau
1:100 dst (smp dpt dipipet)
• Untuk meniadakan zat penghambat antimikroba dapat dilihat
pada Pengujian Pendahuluan.
• Penambahan media pd pada pengenceran sampel tidak boleh
lebih dari 1 jam (NMT 1 jam)
 Total Aerobic Microbial Count (TAMC)
• METODE FILTRASI MEMBRAN

Bila perlu encerkan larutan sehingga harapan diperoleh 30-300

koloni per mL
Pipet 1 mL pengenceran akhir ke dalam 5-10 mL LDF pH 7,2; TSB
atau FCDSLP
Cuci membran filter dg salah satu larutan di atas
Pindahkan membran ke permukaan media TSA dalam cawan Petri,
lakukan duplo
Inkubasi cawan Petri pada 30-35 C, selama 48-72 jam
Amati dan hitung koloni yang tumbuh, nyatakan hasil dari rata-rata
2 cawan per g atau mL sampel
Apabila tidak ada pertumbuhan koloni dari pengenceran awal ,
dinyatakan kurang dari 10 (< 10) per g atau mL sampel.
Total Aerobic Microbial Count (TAMC) ……………………..

• METODE LEMPENG/CAWAN

Bila perlu encerkan larutan sehingga harapan diperoleh 30-300 koloni per
mL
Untuk pengenceran awal digunakan larutan FCDSLP untuk menetralisir
pengawet , bila ada
Buat seri pengenceran desimal 10-1, 10-2 dst dengan LDF pH 7,2
Pipet 1 mL pengenceran akhir ke dalam 2 cawan Petri steril (duplo), segera
tuang 15-20 mL media TSA cair (sekitar 45 C ), tutup cawan dan putar
dengan pelan agar merata, biarkan memadat di suhu ruang
Balik cawan dan inkubasi cawan Petri pada 30-35 C, selama 48-72 jam
Amati dan hitung koloni yang tumbuh, nyatakan hasil dari rata-rata 2 cawan
per g atau mL sampel
Apabila tidak ada pertumbuhan koloni dari pengenceran awal , dinyatakan
kurang dari 10 (< 10) per g atau mL sampel.
Total Aerobic Microbial Count (TAMC) ………………

• METODE TABUNG GANDA (MPN/APM)

Ke dalam 14 tabung reaksi isi 9 mL TSB steril, siapkan dalam 4
set @ 3 tabung, ambil 1 set (tabung) sebagai kontrol
Siapkan 3 pengenceran desimal setara dengan 100 mg atau
µL, 10 mg atau µL dan 1 mg atau µL
Pipetkan 1 mL 100 mg atau µL setiap enceran ke 3 tabung; 1
mL 10 mg atau µL setiap enceran ke 3 tabung; 1mg atau µL
setiap enceran ke 3 tabung.
Hasil positif dari 3 seri tabung dirujuk ke Tabel MPN/APM
# tabung kontrol negatif harus bersih, tidak pertumbuhan.
 Total Aerobic Microbial Count (TAMC) ………………

Total Combined Molds and Yeast Count

Prosedur:
cara sama dengan TAMC, media yang digunakan Sabouraud
Dextrose Agar – Medium (SDA)
Iinkubasi pada 20-25˚C, selama 5-7 hari
Uji ulang: untuk sampel yg hasilnya meragukan, lakukan uji ulang
dg sampel asli ( 10 g ) atau sampel baru (tentu dari batch yang
sama)
 Tabel 1. Batas mikroba yang direkomendasi untuk Produk dan
Ingredien Tumbuhan
BAHAN PERSYARATAN BATAS MIKROBA (koloni/g atau mL)
Tumbuhan serbuk atau kering ALT / TAMC < 10 5
AKK / TCYMC < 10 3
Bakteri Gram negatif Bile tolerant < 10 3
Salmonella dan E.coli Negatif per 10 g

Ekstrak tumbuhan serbuk ALT / TAMC < 10 4

AKK / TCYMC < 10 3
Salmonella dan E.coli Negatif per 10 g

Tinctures (rasa) ALT / TAMC < 10 4

AKK / TCYMC < 10 3

Ekstrak cair ALT / TAMC < 10 4

AKK / TCYMC < 10 3

Infusi/Rebusan (Infusion/Decoction) ALT / TAMC < 10 2

AKK / TCYMC < 10

Suplemen Nutrisi dengan Tumbuhan ALT / TAMC < 10 4

AKK / TCYMC < 10 3
Salmonella dan E.coli Negatif per 10 g

Tumbuhan yg diberi air mendidih sebelum ALT / TAMC < 10 6

digunakan AKK / TCYMC < 10 4
Bakteri Gram negatif Bile tolerant < 10 3
Salmonella dan E.coli Negatif per 10 g
 Tabel 2. Batas mikroba yang direkomendasi untuk
Produk dan Ingredien Suplemen Kesehatan
BAHAN PERSYARATAN BATAS MIKROBA (koloni/g atau mL)

Bahan mentah dan ingredien suplemen ALT / TAMC < 10 3

kesehatan AKK / TCYMC < 10 2

E.coli Negatif per 10 g

Suplemen kesehatan dengan ingredien ALT / TAMC < 10 3

sintetik atau halus sekali AKK / TCYMC < 10 2

E.coli Negatif per 10 g

 VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE
ANILISIS MIKROBIOLOGI
1. PENDAHULUAN
2. ISTILAH DAN DEFINISI
3. PARAMETER VALIDASI/VERIFIKASI
4. PROTOKOL
5. VALIDASI/VERIFIKASI METODE
ANALISIS MIKROBIOLOGI
6. KESALAHAN VALIDASI
 1. PENDAHULUAN
VALIDASI METODE
Konfirmasi melalui pengujian
dan pengadaan bukti yang
objektif bahwa persyaratan
tertentu untuk suatu maksud
khusus terpenuhi
(SNI ISO/IEC 17025-2008; 5.4.5.1)
 1. PENDAHULUAN …………..
Metode standar yang
dimodifikasi

VALIDASI
Metode yang baru
PRIMER dikembangkan

Metode tidak baku

VALIDASI

VALIDASI Metode standar atau

SEKUNDER metode resmi
 PENDAHULUAN
TUJUAN
 Validasi
 Tujuan dilakukannya validasi metode adalah bahwa
metode yang digunakan harus dikarakterisasi dengan
benar untuk menetapkan dengan jelas bidang
penerapannya dan kehandalan mutlak yang diberikannya.
 Validasi metode pengujian mikrobiologi hendaknya
merefleksikan kondisi pengujian yang sebenarnya dan
dapat dicapai dengan : menggunakan produk yang
terkontaminasi alamiah atau produk yang ditambahi
(spiked) dengan organisme kontaminan yang ditetapkan
terlebih dahulu.
 Verifikasi
Tujuan dari verifikasi metode, antara lain:
• Untuk memastikan bahwa laboratorium/analis dapat
menerapkan metode tersebut dengan baik (ketersediaan
peralatan, fasilitas, pereaksi, penguji, keterampilan dan
kompetensi).
• Untuk menjamin mutu hasil pengujian.
 2. ISTILAH DAN DEFINISI
 Validasi metode analisis adalah proses pembuktian atau
konfirmasi pengujian yang obyektif di laboratorium, dan
bahwa metode itu memenuhi persyaratan yang telah
ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya.

 Validasi sekunder / verifikasi metode adalah konfirmasi

kembali melalui pengujian dan penyediaan bukti obyektif
bhw persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus
dipenuhi
Dilakukan verifikasi, jika laboratorium menggunakan atau
mengadopsi metode standar yang telah divalidasi
 ISTILAH........
• Sampel positif adalah sampel dengan penambahan
mikroba target
• Sampel negatif adalah sampel tanpa penambahan
mikroba target
• Kontrol positif adalah media dengan penambahan
mikroba target
• Limit deteksi adalah kemampuan metode untuk
mendeteksi tingkat konsentrasi terendah.
• Analit adalah komponen (dhi. Mikroba) yang diukur
atau diperiksa dengan suatu metode analisis
 ISTILAH........
 Presisi/keseksamaan adalah kemampuan metode untuk
melihat tingkat kesesuaian pengujian berulang pada
sampel yang sama dan kondisi pengujian yang sama.
 Presisi :
• Repitabilitas
• Reproduksibilitas
• Presisi intermediate
Repitabilitas, pengujian berulang yg dilakukan dlm
kondisi :
- lab, alat, metode dan penguji sama
- sampel sama
- dalam jarak waktu singkat
- hasil uji independen
 ISTILAH........
Reproduksibilitas internal, variasi hasil pengujian
berulang dg:
- lab, metode, alat sama
- sampel identik
- penguji dan waktu berbeda
Reproduksibilitas eksternal (ruggedness), presisi
antar lab (studi kolaborasi) untuk pembakuan
metode, pengujian berulang dlm kondisi pengukuran
dg:
- metode sama
- sampel identik
- lab, alat, penguji dan waktu pengujian berbeda
 Presisi
• Presisi dinyatakan :
simpangan baku = standard
deviasi (SD)
SD = √ { ∑ (Xi – X )2 } / N-1

simpangan baku relatif = rsd =

relative standard deviation = cv
RSD = { SD / X } x 100%
 ISTILAH........
• Akurasi adalah kemampuan metode untuk
mendeteksi dan mengukur nilai aktual atau nilai
sebenarnya dari mikroba target pada suatu sampel
 Akurasi relatif adalah tingkat kesesuaian antara
respons yg didapat dari metode alternatif dg metode
acuan thd sampel yg dispike
 Cara penetapan
o Recovery analit  sampel produk ditambah analit
pd rentang konsentrasi yg sesuai
o Pembandingan hasil uji dr metode analisis yang
sedang divalidasi dg metode baku
 akurasi
Catatan:
• Bobot analit atau baku pembanding atau
konsentrasi inokulum mikroba yg ditambahkan =
nilai sebenarnya
• Akurasi dinyatakan dg
% Recovery = %ase nilai terukur thd nilai
sebenarnya
% RECOVERY ( R ) = (A/B) 100%
RECOVERY RELATIF = (A/X) 100%
GALAT RELATIF = {(A-B)/B} 100%
Dimana
A = hasil pengujian dg metode yg digunakan
B = hasil pengujian sebenarnya dari mikroba target
X = hasil pengujian metode baku
 ISTILAH -----------
 Sensitivitas/kepekaan adalah kemampuan metode untuk
mendeteksi/mengukur mikroba target dalam jumlah sekecil
mungkin.
Cara penetapan: fraksi koloni/biakan yg positif pd uji
konfirmasi thd pengujian presumtif
 Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi/
mengukur mikroba target secara cermat dan seksama dengan
adanya mikroba lain dalam bahan/matriks lain
Cara penetapan : fraksi koloni/biakan yg negatif pd uji
konfirmasi thd pengujian presumtif
 Linearitas adalah kemampuan metode untuk memberikan
hasil yang sebanding dengan jumlah analit yang ada dalam
sampel atau
kemampuan metode analisis untuk menunjukkan bhw larutan
sampel yg berada didalam rentang konsentrasi memiliki
respon analit yg proporsional dg konsentrasi
 ISTILAH -----------

 Robustness / ketangguhan ukuran kemampuan

metode analisis untuk tidak terpengaruh oleh perub
atau variasi kecil dr parameter metode analisis yg
sengaja dibuat dan memberikan indikasi dlm
penggunaan normal
 Robustness diterapkan pada saat pembuatan atau
pengembangan metode analisis, dg melihat faktor-
faktor yg mempengaruhi hasil pengujian
 Pengujian yg sangat peka thd perubahan kondisi
analisis harus mendapat perhatian
 ISTILAH........

• Studi/uji kolaborasi adalah mempelajari kinerja

metode alternatif dg menggunakan sampel biasa dg
mengikut sertakan beberapa lab dan diawasi oleh lab
yang dipercaya/expert lab.
• Studi/uji banding metode adalah membandingkan
metode alternaf dengan metode acuan dan
dilakukan oleh lab yg dipercaya
 ISTILAH........
 Deviasi negatif/negatif palsu adalah metode alternatif
memberikan hasil deviasi negatif, artinya hasil uji negatif,
sedangkan metode acuan memberikan hasil positif
 Deviasi positif/positif palsu adalah metode alternatif
memberikan hasil deviasi positif, artinya hasil uji positif,
sedangkan metode acuan memberikan hasil negatif
 Metode kualitatif adalah metode analisis yg merespon
ada dan tidaknya analit didalam sejumlah tertentu
sampel
 Metode kuantitatif adalah metode analisis yg merespons
sejumlah analit yang diukur secara langsung atau tidak
langsung didalam sejumlah tertentu sampel
 Metode acuan adalah metode yg diakui dan diterima
secara internasional
 ISTILAH........

• Selektifitas: inklusifitas dan eksklusifitas

inklusifitas adalah deteksi mikroba target didalam
kisaran strain yang luas
eksklusifitas adalah tidak adanya gangguan dari
kisaran yg relevan dari mikroba non target
• Selektifitas relatif adalah kemampuan metode
alternatif mendeteksi analit dibandingkan dg
metode acuan
• Spesifisitas relatif adalah kemampuan metode
alternatif tidak mendeteksi adanya mikroba
target apabila tidak terdeteksi oleh metode acuan
 ISTILAH........

• Batas repitabilitas (r) adalah kurang dari nilai

atau sama, yg mana perbedaan absolut antara
2 hasil uji diperoleh dalam kondisi repitabilitas
yg diharapkan pada probabilitas 95%
• Batas reproduksibilitas (R) adalah kurang dari
nilai atau sama, yg mana perbedaan absolut
antara 2 hasil uji diperoleh dalam kondisi
reproduksibilitas yg diharapkan pada
probabilitas 95%
 TUJUAN
• Mendapatkan hasil analisis yang
absah/valid
• Dapat dipercaya
• Dapat dipertanggungjawabkan secara
ilmiah
• Sesuai tujuannya
 PRESISI DAN AKURASI

Relationship between accuracy and

precision

Inaccurate &
imprecise

Accurate but Accurate AND Precise

Inaccurate but
precise imprecise
 PERSYARATAN LAB

• PERSONEL YANG KOMPETEN

• METODE STANDAR ATAU IN-HOUSE METHODS
• PERALATAN & INSTRUMEN TERKALIBRASI
• BAHAN ACUAN/MIKROBA ACUAN
• PROGRAM STATISTIK UNTUK MENGHITUNG,
MENGEVALUASI DAN
MENGINTERPRETASIKAN HASIL PENGUJIAN
• LAB TERAKREDITASI ISO 17025 ATAU BELUM ?
 Metode tervalidasi dapat mendeteksi dan
mengidentifikasi analit :

 Dalam 1 atau lebih matriks yang dianalisis

 Pada 1 atau lebih instrumen
 Dengan mempertunjukkan sensitifitas, spesifisitas,
akurasi, kebenaran, reproduksibilitas, ruggedness
dan presisi untuk menjamin hasil ujinya penuh arti
dan sesuai untuk membuat keputusan
 dll
 3. PARAMETER VALIDASI

MENURUT : NORDVAL/NMKL

METODE KUALITATIF METODE KUANTITATIF

• Selektifitas • Selektifitas
• Akurasi relatif • Repitabilitas
• Tingkat deteksi • Reproduksibilitas
• Sensitifitas relatif • Ketidak-pastian pengukuran
• Spesifisitas relatif • Tingkat validasi terendah dg
• Kesesuaian antar metode presisi terbaik
USP (1225)
 Keterangan :

• Kategori I : Assay (akurasi, presisi, spesifisitas,

lineraritas dan range)
• Kategori II : Impurities test
• Kategori III : Performance test
• Kategori IV : Identification test (spesifisitas)
Parameter validasi untuk metode uji mikrobiologi kualitatif
dan kuantitatif ISO 16140
Uji banding metoda (Methods Comparison Study)
KUALITATIF KUANTITATIF
Akurasi Relatif Linearitas
Sensitivitas Relatif Presisi
Spesifisitas Relatif Akurasi Relatif
Tingkat Positif Palsu Akurasi
Tingkat Negatif Palsu Limit deteksi
Limit Deteksi Limit kuantifikasi
Selektivitas (Inclusivity/Eksclusivity) Sensitivitas Relatif

Spesifisitas
Selektivitas (Inclusivity/Eksclusivity)
Parameter validasi/verifikasi dan syarat keberterimaan
metode uji Angka Paling Mungkin (APM)
menurut SAC SINGLAS

1. Sensitivitas
Syarat Keberterimaan ≥70 %
2. Spesifisitas
Syarat Keberterimaan ≥70 %
3. Tingkat Positif Palsu
Syarat Keberterimaan ≤ 30 %
4. Tingkat Negatif Palsu
Syarat Keberterimaan ≤ 30 %
 Parameter verifikasi dan batas keberterimaan
metode uji mikrobiologi kuantitatif
menurut ISO 16140

1. Presisi
Presisi untuk konsentrasi < 100 koloni/g  CV% < 35 %
Presisi untuk konsentrasi > 100 koloni/g  CV% ≤ 10 %

2. Linearitas  Syarat keberterimaan R2 ≥ 0,950

3. Akurasi relatif  Syarat keberterimaan Recovery

70 – 130 %
 4. PROTOKOL VALIDASI

Protokol validasi merupakan prosedur teknis untuk

melakukan validasi metode mikrobiologi, meliputi:
- Metode analisis
- Perlakuan (treatment)
- Jumlah sampel
- Prosedur
- Interpretasi hasil
- Pelaporan/dokumentasi
Metode pengujian mikrobiologi

KUALITATIF
Kuantitatif

Kualitatif
SEMI-KUANTITATIF

KUANTITATIF
 Metode Analisis Mikrobiologi
Kualitatif :
 Uji langsung terhadap mikroba indikator
 Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan
mikroskopik
 Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya
(metode biologi molekuler)
Kuantitatif :
 Angka Lempeng Total (Total Plate Count)
 Uji potensi antibiotik
 Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)
 Uji efektivitas pengawet
Semi kuantitatif:
• MPN (Most Probable Number)
 PENERAPAN

Uji kualitatif
• Analit:
 Bakteri: Bakteri patogen
 Toksin Mikroba (endotoksin)
 Virus: Hepatitis A, Norovirus, Enterovirus
 Parasit protozoa: Cryptosporodium, Cyclospora, dll
• Analit Rekayasa Genetika : Produk GMO
• Dll
Uji MPN atau APM : koliform, E.coli. Dll
Uji kuantitatif : Angka Lempeng Total, Angka kapang dan
Khamir, Angka Koliform, E.coli, Angka bakteri patogen
lainnya
 Verifikasi Metode Kuantitatif
• Gunakan sampel yang terkontaminasi secara alami
dengan analit yang diuji
• Jika tidak mungkin mendapatkan jumlah yang cukup
untuk sampel yang terkontaminasi secara alami pada
tingkat yang diperlukan, diperbolehkan untuk
mencemari secara artificial (spike)
• Pengujian dilakukan dengan 5 tingkat analit target
 TAHAP PELAKSANAAN
• Uji Pendahuluan untuk pembuatan
inokulum
• Menumbuhkan mikroba target pada
media BHIB atau TSB atau TSA,
inkubasi 24 jam
• Inokulum pada media BHIB/TSB
dihitung dengan metode ALT, data
volume BHIB/TSB, lama inkubasi dan
ALT dicatat
• Penghitungan jumlah mikroba target
dari TSA dibuat suspensi sesuai
standard Mc Farland dan dihitung
metode ALT, data no Mc Farland dan
hasil ALT dicatat
 Konsentrasi inokulum dihitung terhadap
berat atau volume sampel
 Sampel disiapkan sebanyak 5 kemasan
 Kelompok perlakuan untuk setiap
kemasan :
i. Sampel tanpa cemaran
ii. Sampel dengan penambahan
mikroba target terdiri 5 tingkat
konsentrasi sesuai syarat mutu
iii. Kontrol positif yaitu menggunakan
media dengan penambahan mikroba
target
 Verifikasi metode kualitatif

• Gunakan sampel yang terkontaminasi secara alami

dengan analit yang diuji
• Jika tidak mungkin mendapatkan jumlah yang cukup
untuk sampel yang terkontaminasi secara alami pada
tingkat yang diperlukan, diperbolehkan untuk
mencemari secara artificial (spike)
• Pengujian dilakukan dengan tingkat limit deteksi
target
 Tahapan Pelaksanaan
• Masing-masing kelompok
perlakuan dilakukan 5 ulangan
• Seluruh data didokumentasikan (
nama sampel, penimbangan atau
pemipetan sampel, mikroba
target, konsentrasi inokulum)
• Untuk mendapatkan distribusi
yang simetris atau yang
mendekati, data penghitungan
sering ditransformasi menjadi
logaritma
 Uji Pendahuluan untuk pembuatan
inokulum
 Menumbuhkan mikroba target dan
non target pada media BHIB atau TSB
atau TSA, inkubasi 24 jam
 Inokulum pada media BHIB/TSB
dihitung dengan metode ALT, data
volume BHIB/TSB, lama inkubasi dan
ALT dicatat
 Penghitungan jumlah mikroba target
dan non target dari TSA dibuat
suspensi sesuai standard Mc Farland
dan dihitung dengan metode ALT,
data no Mc Farland dan hasil ALT
dicatat
 Penentuan limit deteksi

Kelompok perlakuan :
1. Sampel tanpa cemaran (6x ulangan)
2. Sampel dengan penambahan mikroba
target dengan konsentrasi rendah (6x
ulangan)
3. limit deteksi didapat bila dari 6 ulangan
memberikan hasil minimal 50%
 INTERPRETASI HASIL
• Bila hasil tidak sesuai dengan batas
keberterimaan dari parameter verifikasi maka
metode tidak dapat digunakan untuk
pengujian dan perlu diinvestigasi penyebab
kegagalan untuk dilakukan pengujian ulang

50
 CARA UJI PENDAHULUAN
• Penghitungan jumlah bakteri (contoh E. coli)
Inokulasikan bakteri kedalam 10 ml BHIB
Inkubasi 24 jam atau Mc Farland 1

1. ml 1. ml 1. ml 1. ml 1. ml

Pengenceran
9ml PDF

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1. ml
1. ml

Lempeng
1 ml 1 ml

Masing-masing Petri dituangkan PCA (± 20 mL)

Lakukan penghitungan koloni….

51
 Lanjutan…
• Dari hasil uji pendahuluan (penghitungan E.
coli) misal didapat:

Plate Pengenceran (kol/ml)

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Plate 1    250 3 1
Plate 2    248 4 0

ALT = 250 + 248 x 10 4 = 25 x 105 kol/ml

2
eni- 2015 52
 Lanjutan..Cara penambahan
cemaran

Contoh: didapat stok inokulum 25 x 105 koloni/mL

Penambahan inokulum sebagai cemaran ( kons 10 kol/g
sampel)
Cara memberi cemaran: penimbangan sampel 25 g
maka 10 x 25 = 250 kol/mL

Maka cemaran diambil dari pengenceran 10-4 sebanyak 1 mL

eni- 2015 53
CONTOH VALIDASI/VERIFIKASI
METODE MIKROBIOLOGI
ANGKA LEMPENG
VALIDASI TOTAL (ALT)
ANGKA LEMPENG
TOTAL, contoh

CONTOH
 ALT ………linearitas
UJI ANGKA LEMPENG TOTAL
jumlah koloni (cfu/mL)
7

PENGEN JML KOLONI 10- 6

NO.
CERAN (CFU/ML)
10- 5
1 10^-1 6500000
10- 4
2 10^-2 560000
3 jumlah
10-
3 10^-3 57000 koloni
(cfu)
2
10-
4 10^-4 4800
1
10-
5 10^-5 630
0
6 10^-6 70
 LINIERITAS

PENGENCERAN CFU

-6 7x10

-5 6,9x10^2

-4 6,5x10^3

-3 5,9x10^4

-2 6,5x10^5

-1 6,8x10^6

10^1 10^2 10^3 10^4 10^5 10^6

 LINIERITAS

1 70

2 690

3 6490

4 59076

5 654850

6 6755600
 ANGKA LEMPENG TOTAL

RSD = SD/Rata2 Log ALT

CV = RSD x 100 %
% Recovery = Rata2 Log ALT konsentrasi Sampel Positif x 100%
Rata2 Log ALT konsentrasi Kontrol Positif
APM E. coli
contoh
 PERLAKUAN SAMPEL

1. Sampel apapun (konsentrasi 0 koloni/mL).

2. Sampel Positif: Sampel ditambah inokulum suspensi
bakteri target
3. Kontrol Positif: Pengencer ditambah inokulum
suspensi bakteri target
4. Sampel Non target: Pengencer ditambah inokulum
suspensi bakteri non target

Masing-masing kelompok dikerjakan sebanyak 10 x ulangan

 9 mL 9 mL

1 mL 1 mL

10-1 10-2 10-3

@ 1 mL @ 1 mL @ 1 mL

MCB/LST
Inkubasi suhu 37° C, 24 – 48 jam

@ perlakuan dikerjakan
sebanyak 10 x ulangan
Transfer 1 sengkelit dari uji +

ECB

Inkubasi suhu (44 ± 0,5) 0C, 24 – 48 jam

@ terduga positif diinokulasikan ke dalam Rujuk pada tabel APM 3 tabung

pepton water, inkubasi suhu 44 0C 48 jam
 Jumlah presumptive

+ -

Terkonfirmasi + a b a+b

Terkonfirmasi - c d c+d

a+c b+d n

Keterangan :
a = Jumlah presumptive positif terkonfirmasi positif
b = Jumlah presumptive negative terkonfirmasi positif
c = Jumlah presumptive positif terkonfirmasi negative
d = Jumlah presumptive negative terkonfirmasi negative
n = Jumlah keseluruhan uji
 Jumlah presumptive
Konfirmasi Total
Positif Negatif
Positif 35 0 35
Negatif 0 325 325
Total 35 325 360

% Sensitivitas = a/(a+b) x 100% = 35/35 x 100% = 100 %  > 70%

% Spesifisitas = d/(c+d) x 100% = 325/325 x 100% = 100 %  > 70%

% Tingkat positif palsu = c/(a+c) x 100% = 0/35 x 100% = 0 %  < 30%

% Tingkat negatif palsu = b/(b+d) x 100% = 0/325 x 100% = 0 %  <30%

Ada pertanyaan……..?

MATUR NUWUN