Verifikasi Metode Pengujian Angka Lempeng Total dalam

Susu

1. Ruang lingkup
Standar ini menetapakn metode pengujian cemaran mikroba Angka Lempeng
Total secara kuantitatif pada susu serta hasil olahannya.
Jenis metode uji : Pengujian metode SNI 2897:2008

2. Cara Kerja
2.1 Prinsip
Total Plate Count ( TPC ) dimaksudkan untuk menunjukan jumlah mikroba
yang terdapat dalam suatu produk dengan cara menghitung koloni bakteri yang
ditumbuhkan pada media agar.

2.2 Media dan reagen

a) PCA
b) BPW 0.1 % ( Pengencer )

2.3 Peralatan
Cawan petri; pH meter;
tabung reaksi; timbangan;
pipet volumetrik; magnetic stirer
botol media; vortex
penghitung koloni; inkubator;
gunting; penangas air;
pinset; autoclaf
jarum inokulasi ( ose ); lemari steril ( clean bench );
pembakar bunsen; lemari pendingin;
stomacher; freezer;
 2.4 Persiapan contoh
a) Dipipet contoh sebanyak 25 mL secara aseptik, kemudian masukan dalam
wadah steril.
b) Tambahkan 225 mL larutan BPW 0.1% steril kedalam kantong steril yang
berisi contoh, homogenkan selama 1-2 menit.
*ini merupakan larutan dengan pengenceran 10-1.

2.5 Persiapan kultur uji

Kultur stok yang berasal dari agar miring sebelum digunakan disegarkan terlebih
dahulu dengan menumbuhkan 1 ose kultur ke dalam 50 mL media lalu di
inkubasi pada suhu 350C selama 24 jam.

2.6 Persiapan sampel uji

Kontrol positif
Kontrol positif merupakan sampel inokulum ( kultur murni ) dengan konsentrasi
tertentu tanpa sampel
Sampel Negatif
Sebanyak 50 mL susu secara aseptik dimasukan dalam erlenmeyer steril 100
mL. Lakukan pengulangan sebanyak enam kali
Sampel Positif
Sampel positif dibuat dalam 2 tingkat inokulum yaitu tingkat kontaminasi rendah (
10 CFU/mL) untuk sampel pertama, sebanyak 45 mL susu secara aseptik
dimasukan dalam erlenmeyer steril 100 mL, kemudian ditambahkan 5 mL kultur
dari pengenceran 10-7 ( jumlah bakteri pada 10-7 dianggap 100 CFU/mL )
lakukan pengulangan sebanyak 6 kali. Untuk sampel kedua, sebanyak 45 mL
susu secara aseptik dimasukan ke dalam erlenmeyer steril 100 mL, kemudian
ditambahkan 5 mL kultur dari pengenceran 10 -6 ( jumlah bakteri pada 10-6
dianggap 1000 CFU/ mL ) lakukan pengulangan sebanyak enam kali.

2.7 Cara Uji

a) Pindahkan 1 mL suspensi pengenceran 10 -1 tersebut dengan pipet steril
kedalam larutan 9 mL BPW untuk mendapatkan pengenceran 10-2
b) Buat pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 dan seterusnya dengan cara yang sama
seperti pada butir a), sesuai kebutuhan
 c) Selanjutnya masukan sebanyak 1 mL suspensi dari setiap pengenceran
kedalam cawan petri secara duplo.
d) Tambahkan 15 mL sampai dangan 20 mL PCA yang sudah diinginkan hingga
tempratur 450c 10c pada masing-masing cawan yang berisi suspensi. Supaya
larutan contoh dan media PCA tercampur seluruhnya, lakukan pemutaran
cawan kedepan dan kebelakang atau membentuk angka delapan dan
diamkan menjadi padat.
e) Inkubasi pada temperatur 320C 10C selama 24 jam sampai dangan 48 jam
dengan meletakan cawan pada posisi terbalik.

2.8 Perhitungan jumlah koloni

Hitung jumlah koloni pada setiap seri pengenceran kecuali cawan petri yang
berisi koloni menyebar (speader colonies). Pilih cawan yang mempunyai jumlah
koloni 25 sampai 250.

2.9 Pelaporan hasil

a) Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau
diatasnya, maka angka ketiga menjadi 0 ( nol ) dan angka kedua naik 1
angka, misalnya 456 menjadi 460 (4.6 x 102 )
b) Bila angka ketiga 4 atau dibawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 ( nol )
dan angka kedua tetap, misal 454 menjadi 450 ( 4.5 x 102 )
c) Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 dan
angka kedua adalah genap, misal 445 menjadi 440 (4.4 X 10 2 )
d) Bilia angka ketiganya 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0
(nol) dan angka kedua naik 1 angka misal 455 menjadi 460 (4.6 x 102 )

3. Parameter dan Tahapan Verifikasi Metode Uji

No. Parameter Uji Syarat Keberterimaan Bahan Uji Keterangan (sumber)

1. Presisi %RSD <10 % Sampel

sampel +
2. Akurasi %Recovery (80%-120%)
inokulum
3. Spesifisitas 100 %
Keterangan masing masing parameter Uji :

1. Prosedur pengujian presisi

Tingkat kesesuaian antara hasil uji individual dangan hasil rata-rata
pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian
yang sama. Dilakukan tujuh kali pengujian terhadap sampel sesuai prosedur
uji, kemudian nilai %RSD (Relative Standard Deviation) hasil pengujian
dihitung menggunakan rumus sebagai berikut.

Rumus

∑𝒏 ((𝒍𝒐𝒈 𝒂𝟏 − 𝒍𝒐𝒈 𝒃𝟏)/𝒙𝟏))𝟐

𝑹𝑺𝑫 = √ 𝒊=𝟏
𝟐𝒑

%𝑹𝑺𝑫 = 𝑹𝑺𝑫 × 𝟏𝟎𝟎%

Keterangan :

a1 adalah cawan 1
b1 adalah cawan 2
(log a1 – log b1)/x1 adalah perbedaan relatif antara hasil logaritma duplo
i adalah ulangan 1, 2, 3,. . n
p adalah jumlah penentuan duplo (jumlah sampel uji)

Syarat keberterimaan presisi yaitu %RSD < 10%

2. Prosedur pengujian akurasi

Akurasi biasa dinyatakan dalam % perolehan kembali ( % recovery ), yaitu

banyaknya inokulum yang dapat diisolasikan kembali dari sejumlah inokulum
yang dimasukan ke dalam sample.

Persen perolehan kembali dihitung dengan rumus berikut

 Rumus

𝑨
% 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒗𝒆𝒓𝒚 (𝑹) = [ ] × 𝟏𝟎𝟎
𝑩
Keterangan
A adalah koloni yang dapat dihitung pada sampel yang diinokulasi (sampel
positif )
B adalah bakteri yang diinokulasikan ke dalam sampel ( kontrol positif )

Syarat keberterimaan akurasi yaitu (80%≤ %recovery ≥ 120%)

3. Prosedur perhitungan spesifitas

Spesifitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi atau
menghitung mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan
adanya mikroorganisme yang lain.
Sepesifitas merupakan kemampuan metode dalam memberikan hasil negatif
terhadap sampel yang negatif.

Jumlah sampel ( Presumtif )

Metode Pengujian TPC Positive Negatif Jumlah
Positive (+) P A P+A
Hasil uji (
Negative (-) B N B+N
Konfirmatif
Jumlah P+B A+N n

𝑷
𝑺𝒆𝒏𝒔𝒊𝒕𝒊𝒇𝒊𝒕𝒂𝒔 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
(𝑷 + 𝑨)

𝑵
𝑺𝒑𝒆𝒔𝒊𝒇𝒊𝒕𝒂𝒔 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
(𝑩 + 𝑵)
 Verifikasi Metode Pengujian Koliform dan E.Coli dalam
Susu

1. Ruang lingkup
Standar ini menetapakan metode pengujian cemaran mikroba Koliform dan e.coli
secara kuantitatif pada susu serta hasil olahannya.
Jenis metode uji : Pengujian metode In-house

2. Cara Kerja
2.1 Prinsip
menunjukan jumlah koliform dan e.coli yang terdapat dalam suatu produk
dengan cara menghitung koloni yang ditumbuhkan pada media agar berdasarkan
warna khas yang dihasilkan oleh koloni.

2.2 Media dan reagen

a) Chromocult
c) Aquadest

2.3 Peralatan
Cawan petri; pH meter;
tabung reaksi; timbangan;
pipet volumetrik; magnetic stirer
botol media; vortex
penghitung koloni; inkubator;
gunting; penangas air;
pinset; autoclaf
jarum inokulasi ( ose ); lemari steril ( clean bench );
pembakar bunsen; lemari pendingin;
stomacher; freezer;
2.4 Persiapan contoh
a) Pipet contoh sebanyak sebanyak 10 mL / 1 mL
b) Tambahkan 90mL/ 9mL pengencer steril kedalam kantong yang berisi contoh,
homogenkan selama 1-2 menit.
*ini merupakan larutan dengan pengenceran 10-1.

2.5 Persiapan kultur uji

Kultur stok yang berasal dari agar miring sebelum digunakan disegarkan terlebih
dahulu dengan menumbuhkan 1 ose kultur ke dalam 50 mL media lalu di
inkubasi pada suhu 250C selama 24 jam.

2.6 Persiapan sampel uji

Sampel negatif
Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke
dalam plastik steril berisi 90 ml pengencer. Kemudian sampel dihomogenkan
hingga tercampur merata dengan pengencer dan dibiarkan kurang lebih 15 menit
sebelum digunakan.
Sampel positif
Sampel ditimbang aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam
kantong plastik steril berisi 90 ml pengencer. Selanjutnya kapang Rhizopus
oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke dalam sampel
masing-masing sebanyak 0,5 ml ke dalam suspensi sampel dan dihomogenkan.
Sampel dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan.
Kontrol positif
diencerkan ke dalam 0,1% pepton dan dihomogenkan.

2.7 Cara Uji

a) masukan sebanyak 1 mL sampel kedalam cawan petri secara aseptik,
lakukan duplo/triplo
b) Tuang media kedalam cawan petri, goyang hingga merata, tunggu hingga
padat.
c) Inkubasi pada temperatur 280C 10C selama 5 hari dengan meletakan cawan
pada posisi terbalik.
 2.8 Perhitungan jumlah koloni
Hitung jumlah koloni pada setiap seri pengenceran kecuali cawan petri yang
berisi koloni menyebar (speader colonies). Pilih cawan yang mempunyai jumlah
koloni 25 sampai 250.

2.9 Pelaporan hasil

e) Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau
diatasnya, maka angka ketiga menjadi 0 ( nol ) dan angka kedua naik 1
angka, misalnya 456 menjadi 460 (4.6 x 102 )
f) Bila angka ketiga 4 atau dibawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 ( nol )
dan angka kedua tetap, misal 454 menjadi 450 ( 4.5 x 102 )
g) Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 dan
angka kedua adalah genap, misal 445 menjadi 440 (4.4 X 10 2 )
h) Bilia angka ketiganya 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0
(nol) dan angka kedua naik 1 angka misal 455 menjadi 460 (4.6 x 102 )

3. Parameter dan Tahapan Verifikasi Metode Uji

No. Parameter Uji Syarat Keberterimaan Bahan Uji Keterangan (sumber)

1. Presisi %RSD <10 % Sampel

sampel +
2. Akurasi %Recovery (80%-120%)
inokulum
3. Spesifisitas 100 %

Keterangan masing masing parameter Uji :

4. Prosedur pengujian presisi

Tingkat kesesuaian antara hasil uji individual dangan hasil rata-rata
pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian
yang sama. Lakukan tujuh kali pengujian terhadap sampel sesuai prosedur
uji, kemudian nilai %RSD (Relative Standard Deviation) hasil pengujian
dihitung menggunakan rumus sebagai berikut.
 Rumus

∑𝒏 ((𝒍𝒐𝒈 𝒂𝟏 − 𝒍𝒐𝒈 𝒃𝟏)/𝒙𝟏))𝟐

𝑹𝑺𝑫 = √ 𝒊=𝟏
𝟐𝒑

%𝑹𝑺𝑫 = 𝑹𝑺𝑫 × 𝟏𝟎𝟎%

Keterangan :

a1 adalah cawan 1
b1 adalah cawan 2
(log a1 – log b1)/x1 adalah perbedaan relatif antara hasil logaritma duplo
i adalah ulangan 1, 2, 3,. . n
p adalah jumlah penentuan duplo (jumlah sampel uji)

Syarat keberterimaan presisi yaitu %RSD < 10%

5. Prosedur pengujian akurasi

Akurasi biasa dinyatakan dalam % perolehan kembali ( % recovery ), yaitu

banyaknya inokulum yang dapat diisolasikan kembali dari sejumlah inokulum
yang dimasukan ke dalam sample.

Persen perolehan kembali dihitung dengan rumus berikut

Rumus

𝑨
% 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒗𝒆𝒓𝒚 (𝑹) = [ ] × 𝟏𝟎𝟎
𝑩
Keterangan
A adalah koloni yang dapat dihitung pada sampel yang diinokulasi (sampel
positif )
B adalah bakteri yang diinokulasikan ke dalam sampel ( kontrol positif )

Syarat keberterimaan akurasi yaitu (80%≤ %recovery ≥ 120%)

6. Prosedur perhitungan spesifitas
Spesifitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi atau
menghitung mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan
adanya mikroorganisme yang lain.
Sepesifitas merupakan kemampuan metode dalam memberikan hasil negatif
terhadap sampel yang negatif.

Jumlah sampel ( Presumtif )

Metode Pengujian TPC Positive Negatif Jumlah
Positive (+) P A P+A
Hasil uji (
Negative (-) B N B+N
Konfirmatif
Jumlah P+B A+N n

𝑷
𝑺𝒆𝒏𝒔𝒊𝒕𝒊𝒇𝒊𝒕𝒂𝒔 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
(𝑷 + 𝑨)

𝑵
𝑺𝒑𝒆𝒔𝒊𝒇𝒊𝒕𝒂𝒔 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
(𝑩 + 𝑵)
 Verifikasi Metode Pengujian Cemaran kapang dan khamir
dalam Susu

4. Ruang lingkup
Standar ini menetapakan metode pengujian cemaran mikroba kapang dan khamir
secara kuantitatif pada susu serta hasil olahannya.
Jenis metode uji : Pengujian metode In-house

5. Cara Kerja
2.1 Prinsip
menunjukan jumlah kapang dan khamir yang terdapat dalam suatu produk
dengan cara menghitung koloni yang ditumbuhkan pada media agar.

2.2 Media dan reagen

a) PDA (Potato Dextrose Agar) (CM 139),
b) Asam titrat (Tartaric Acid) 10%,
c) Aquadest

5.3 Peralatan
Cawan petri; pH meter;
tabung reaksi; timbangan;
pipet volumetrik; magnetic stirer
botol media; vortex
penghitung koloni; inkubator;
gunting; penangas air;
pinset; autoclaf
jarum inokulasi ( ose ); lemari steril ( clean bench );
pembakar bunsen; lemari pendingin;
stomacher; freezer;
5.4 Persiapan contoh
c) Timbang contoh sebanyak sebanyak 10 mL / 1 mL
d) Tambahkan 90mL/ 9mL pengencer steril kedalam kantong yang berisi contoh,
homogenkan selama 1-2 menit.
*ini merupakan larutan dengan pengenceran 10-1.

5.5 Persiapan kultur uji

Kultur stok yang berasal dari agar miring sebelum digunakan disegarkan terlebih
dahulu dengan menumbuhkan 1 ose kultur ke dalam 50 mL media lalu di
inkubasi pada suhu 250C selama 24 jam.

5.6 Persiapan sampel uji

Sampel negatif
Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke
dalam plastik steril berisi 90 ml pengencer. Kemudian sampel dihomogenkan
hingga tercampur merata dengan pengencer dan dibiarkan kurang lebih 15 menit
sebelum digunakan.
Sampel positif
Sampel ditimbang aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam
kantong plastik steril berisi 90 ml pengencer. Selanjutnya kapang Rhizopus
oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke dalam sampel
masing-masing sebanyak 0,5 ml ke dalam suspensi sampel dan dihomogenkan.
Sampel dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan.
Kontrol positif
Kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diencerkan
ke dalam 0,1% pepton dan dihomogenkan.

5.7 Cara Uji

d) masukan sebanyak 1 mL sampel kedalam cawan petri secara aseptik,
lakukan duplo/triplo
e) Tuang media kedalam cawan petri, goyang hingga merata, tunggu hingga
padat.
f) Inkubasi pada temperatur 280C 10C selama 5 hari dengan meletakan cawan
pada posisi terbalik.
 5.8 Perhitungan jumlah koloni
Hitung jumlah koloni pada setiap seri pengenceran kecuali cawan petri yang
berisi koloni menyebar (speader colonies). Pilih cawan yang mempunyai jumlah
koloni 25 sampai 250.

5.9 Pelaporan hasil

i) Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau
diatasnya, maka angka ketiga menjadi 0 ( nol ) dan angka kedua naik 1
angka, misalnya 456 menjadi 460 (4.6 x 102 )
j) Bila angka ketiga 4 atau dibawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 ( nol )
dan angka kedua tetap, misal 454 menjadi 450 ( 4.5 x 102 )
k) Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0 dan
angka kedua adalah genap, misal 445 menjadi 440 (4.4 X 10 2 )
l) Bilia angka ketiganya 5, maka angka tersebut dapat dibulatkan menjadi 0
(nol) dan angka kedua naik 1 angka misal 455 menjadi 460 (4.6 x 102 )

6. Parameter dan Tahapan Verifikasi Metode Uji

No. Parameter Uji Syarat Keberterimaan Bahan Uji Keterangan (sumber)

1. Presisi %RSD <10 % Sampel

sampel +
2. Akurasi %Recovery (80%-120%)
inokulum
3. Spesifisitas 100 %

Keterangan masing masing parameter Uji :

7. Prosedur pengujian presisi

Tingkat kesesuaian antara hasil uji individual dangan hasil rata-rata
pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian
yang sama. Lakukan tujuh kali pengujian terhadap sampel sesuai prosedur
uji, kemudian nilai %RSD (Relative Standard Deviation) hasil pengujian
dihitung menggunakan rumus sebagai berikut.
 Rumus

∑𝒏𝒊=𝟏((𝒍𝒐𝒈 𝒂𝟏 − 𝒍𝒐𝒈 𝒃𝟏)/𝒙𝟏))𝟐

𝑹𝑺𝑫 = √
𝟐𝒑

%𝑹𝑺𝑫 = 𝑹𝑺𝑫 × 𝟏𝟎𝟎%

Keterangan :

a1 adalah cawan 1
b1 adalah cawan 2
(log a1 – log b1)/x1 adalah perbedaan relatif antara hasil logaritma duplo
i adalah ulangan 1, 2, 3,. . n
p adalah jumlah penentuan duplo (jumlah sampel uji)

Syarat keberterimaan presisi yaitu %RSD < 10%

8. Prosedur pengujian akurasi

Akurasi biasa dinyatakan dalam % perolehan kembali ( % recovery ), yaitu

banyaknya inokulum yang dapat diisolasikan kembali dari sejumlah inokulum
yang dimasukan ke dalam sample.

Persen perolehan kembali dihitung dengan rumus berikut

Rumus

𝑨
% 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒗𝒆𝒓𝒚 (𝑹) = [ ] × 𝟏𝟎𝟎
𝑩
Keterangan
A adalah koloni yang dapat dihitung pada sampel yang diinokulasi (sampel
positif )
B adalah bakteri yang diinokulasikan ke dalam sampel ( kontrol positif )

Syarat keberterimaan akurasi yaitu (80%≤ %recovery ≥ 120%)

9. Prosedur perhitungan spesifitas
Spesifitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi atau
menghitung mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan
adanya mikroorganisme yang lain.
Sepesifitas merupakan kemampuan metode dalam memberikan hasil negatif
terhadap sampel yang negatif.

Jumlah sampel ( Presumtif )

Metode Pengujian TPC Positive Negatif Jumlah
Positive (+) P A P+A
Hasil uji (
Negative (-) B N B+N
Konfirmatif
Jumlah P+B A+N n

𝑷
𝑺𝒆𝒏𝒔𝒊𝒕𝒊𝒇𝒊𝒕𝒂𝒔 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
(𝑷 + 𝑨)

𝑵
𝑺𝒑𝒆𝒔𝒊𝒇𝒊𝒕𝒂𝒔 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
(𝑩 + 𝑵)