TUGAS ANALISIS FARMASI 2

RESUME MATERI 3

“VALIDASI METODE ANALISIS”

Disusun oleh :

Ni Putu Elsa Nidya 19330715/ Kelas A

Dosen Pengampu :
Lia Puspitasari, S. Farm., M.Si., Apt.

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL
JAKARTA
2020
 Validasi Metode Analisis

Validasi/verifikasi metode wajib dilakukan dengan berbagai alasan untuk :

1. Menjamin mutu dan pencapaian tingkat mutu tertentu
2. Menjamin mutu produk yang dapat diterima oleh suatu badan internasional
3. Memenuhi persyaratan akreditasi ISO 17025 (Sistem Mutu Laboratorium)
4. Memenuhi persyaratan pendaftaran obat jadi/sedíaan farmasi
5. Memenuhi persyaratan metode yang digunakan pada uji profisiensi (uji banding antar
laboratorium).

Validasi/Verifikasi Metode
 Farmakope, ISO 17025.2005 dan CPOB mensyaratkan bahwa metode pengujían yang
digunakan untuk menetapkan mutu produk farmasi dan pemenuhan persyaratan
mutu/spesifikasi, harus sudah dibuktikan kesesuaiannya terhadap akurasi, presisi dan
reliabilitasnya yang telah ditetapkan.
 Para pengguna metode standard, misalnya yang terdapat dalam kompendia (farmakope
dan kodeks) tidak disyaratkan untuk memvalidasinya tetapi diwajibkan untuk
memverifikasi kesesuaian metode pada kondisi penggunaan.
 Metode pengujian yang non-standard atau hasil pengembangan laboratorium sebelum
digunakan harus divalidasi dahulu.
 Kegiatan validasi/verifikasi metode merupakan kegiatan yang terencana dan dilakukan
oleh personal yang terlatih.

Laboratorium harus memvalidasi:

a. Metode tidak baku (non-standard)
b. Metode yang didisain/dikembangkan sendiri.
c. Metode standard yang digunakan di luar lingkup yang dimaksudkan.
d. Metode standard yang dimodifikasi atau direvisi untuk mengkonfirmasi bahwa metode
itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan.
(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.2)

 Validasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah yang dilakukan untuk membuktikan
bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang sesuai
 dengan tujuan pengunaannya. Atau konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti
yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi.
(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.1)

 Verifikasi metode analisis adalah suatu proses ilmíah yang dilakukan laboratorium untuk
membuktikan bahwa laboratorium mampu menggunakan metode analisis standar
sesuai dengan tujuan penggunaannya pada kondisi nyata laboratorium.
Karakteristik kinerja metode (parameter validasi/verifikasi) yang dibuktikan harus
berdasarkan pada tujuan kegunaan, kategori dan kriteria metode tersebut.

Parameter yang digunakan dalam validasi metode analisis

USP (United States Pharmacopeia) ICH (International Conference On

Harmonization)
1. Presisi (keseksamaan) 1. Presisi
2. Akurasi (kecermatan) 2. Akurasi
3. Batas deteksi 3. Batas deteksi
4. Batas kuantitasi 4. Batas kuantitasi
5. Spesifitas (kekhasan) 5. Spesifitas
6. Linearitas 6. Linearitas
7. Rentang 7. Rentang
8. Robustness
9. Kesesuaian sistem

Strategi Validasi/Verifikasi Metode Analisis

1. Nyatakan dengan jelas tujuan dan ruang lingkup dari metode yang akan
divalidasi/verifikasi
2. Tentukan parameter kinerja metode dan kriteria penerimaan untuk masing-masing
parameter tersebut.
3. Buat rencana percobaan validasi/verifikasi
4. Verifikasi kinerja dan kalibrasi semua peralatan dan instrumen
5. Siapkan semua bahan seperti pereaksi, pelarut dan bahan acuan standar (BPFI, CRM,
SRM), matriks, dan lain-lain.
6. Lakukan percobaan validasi/verifikasi secara internal ataupun eksternal
7. Buat SOP pelaksanaan validasi/verifikasi metode untuk kegiatan pengujian rutin
(method transferred)
8. Buat kriteria untuk revalidasi
9. Buat laporan dan dokumentasi lengkap vaiidasi/verifikasi yang telah dilakukan.
Panduan validasi metode analisis

Badan Judul panduan Tahun terbit

ICH a. ICH Q2A : Text on validation of analytical procedure 1994

b. ICH Q2B Validation of analytical procedures 1995

methodology

CDER a. Reviewer guidance validation of chromatographic 1994

methods 1987
b. Submitting sample and analytical data for method
validation 2000
c. Analytical procedure and method validation for human
studies 1999
d. Bioanalytical method validation for human studies
USP Validation of compendial method 2009

Tahapan validasi metode

1. Tahap persiapan
a. Kalibrasi instrumen dan alat-alat gelas
b. Penyiapan pereaksi pelarut dan bahan acuan baku (CRM, SRM, BPFI) serta matriks
sediaan (placebo)
2. Tahap validasi
 Spesifisitas  Batas kuantisasi
 Linieritas dan rentang  Akurasi
 Batas deteksi  Presisi

SPESIFISITAS
Kemampuan untuk menguji secara tegas analit yang dimaksud dengan adanya
komponen lain atau yang diperkirakan ada seperti cemaran, hasil degradasi dan komponen
matriks.
Jika spesifisitas metode tidak ada atau kurang baik maka metode dapat dílengkapi
dengan prosedur analisis pendukung yang memadai seperti pemisahan : ekstraksi, destilasi,
SPE.

Pengujian
a. Untuk identifikasi senyawa aktif dalam bahan atau sediaan.
Metode harus mampu menyeleksi dan mengidentifikasi senyawa-senyawa yang ada
dalam sampel yang berkaitan dengan struktur molekulnya. Dapat dibuktikan dengan hasil
 positif (atau dibandingkan dengan bahan acuan standar yang diketahui) dari sampel yang
mengandung analit dan dengan hasil negatif dari sampel yang tidak mengandung analit.

b. Untuk penetapan kadar cemaran

Dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan sejumlah tertentu cemaran,
hasil degradasi atau matriks. Dibuktikan dengan terlihatnya secara nyata gangguan itu dan
cemaran dapat ditetapkan secara akurat dan presisi yang memadai.
c. Untuk penetapan kadar
Dinyatakan dengan jelas bahwa prosedur tidak dipengaruhi oleh adanya cemaran
atau gangguan matriks. Dalam praktek dapat dilakukan dengan cara menguji sampel yang
dìtambahkan sejumlah tertentu cemaran atau matriks dan terlihat nyata bahwa prosedur
tidak dipengaruhi oleh komponen asing tersebut.
Jika cemaran tidak tersedia maka sampel yang diuji harus diperlakukan sebelumnya
dengan menyimpan sampel dalam kondisi “stress” yang relevan (cahaya, panas,
kelembaban, hidrolisis asam/basa oksidasi). Dalam kasus ini pengujian dilakukan bersama
sampel utuh.
Untuk metode kromatografi, dipersyaratkan kromatogram harus ditampilkan untuk
melihat derajat selektivitasnya dan kemurnian pucak.

LINEARITAS
Keampuan untuk memperoleh hasil uji yang proporsional (sepadan) terhadap konsentrasi
analit dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi yang digunakan secara langsung atau
melalui sesuai transpormasi matematik yang jelas.

Pengujian :

 Menyiapkan larutan analit sebanyak minimal 6 konsentrasi dengan rentang 20 - 120% dari
konsentrasi aktual
 Mengukur respon instrumen ke enam larutan tersebut, masing - masing paling sedikit tiga
kali pengukuran (pengulangan)
 Buat kurva antara respon instrumen terhadap konsentrasi analit dan hitung persamaan
matematik yang memadai (persamaan garis regresí linier atau regresi kuadrat)
 Hitung derajat linearitas melalui :
- koefisien korelasi (r) - VX0
- % Y-intercept - Faktor respon
Parameter VX0 dijadikan dasar untuk pemilihan kurva kalibrasi yang menggunakan regresi
linear atau regresi kuadratik dengan memilih VX0 yang paling mendekati 2%.
Kriteria penerimaan linearitas dan rentang

Metode Untuk Level Rentang Kriteria penerimaan*)

Penetapan kadar 6 50 – 150% r ≥ 0,999
20 – 120% %y- intercept≤ 2,0%
VX0 ≤ 2,0%
Disolusi 5-8 10% - 150% dari Q **) r> 0,99
%y intercept ≤ 5,0%
VX0 ≤ 5,0%
Cemaran (Kadar 5 LOQ – 2% r≥ 0,98
rendah) VX0 ≤ 5,0%
Cleaning (Kadar 5 LOQ - 20 kali LOQ r≥ 0,98
sangat rendah) VX0 ≤ 5,0%
*) Dari : Handbook of Pharmaceutical by HPLC
**) Q Persentasi jumlah zat terlarut dalam medium

RENTANG
Adalah interval antara batas terendah dan batas tertinggi konsentrasi analit yang
telah dibuktikan dengan hasil presisi, akurasi, dan linearitas yang dapat diterima.
Rentang metode diuji dengan melakukan pembuktian data yang memperlihatkan presisi,
akurasi dan linearitas yang dapat diterima, baik pada konsentrasi terendah maupun tertinggi
serta pada konsentrasi lain dalam rentang sesuai dengan tujuan metode analisis.

BATAS DETEKSI DAN BATAS KUANTISASI

a. Batas deteksi (BD/LOD)
Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih dapat terdeteksi, tapi tidak perlu
ditetapkan secara kuantitatif dalam kondisi percobaan yang telah dinyatakan.
Pengujian :
1) Untuk metode non instrumen, BD ditetapkan dengan menguji sampel yang
mengandung analit dalam kadar tertentu. Dengan melakukan pengenceran
secara bertahap, ditentukan batas terendah kadar analit yang masih dapat
dideteksi secara visual (menggunakan reaksi kimia, KLT, dan lain-lain).
2) Untuk metode instrumen, BD dinyatakan:
a) Sebagai konsentrasi analit pada saat respon menunjukkan ratio signal-
noise 3 : 1 (S/N = 3).
b) Mengukur besarnya respon instrumen dari 20 larutan blangko dan
menghitung simpangan bakunya (SD).
 Batas deteksi merupakan hasil perkalian simpangan baku blangko
dengan suatu faktor (3,3/b), dimana b merupakan kemiringan garis
regresi linier.
Perhitungan:
- BD = Konsentrasi larutan pada S/N 3
= 3 [Konsentrasi larutan uji/(S/N)]
- BD = 3,3 (SD/b) = 3,3 (Sy/x)/b
Dimana : SD = simpangan baku blangko (n = 20)
b = kemiringan garis regresi (Y = bx + a)
Catatan:
SD (Simpangan baku) dapat dihitung dengan cara menghitung:
a. Simpangan baku larutan blangko
b. Simpangan baku residual garis regresi (Sy/x)
c. Simpangan baku pada perpotongan garis sumbu Y (Y-intercept)
Dengan demikian BD dapat diprediksi dari hasil pengukuran larutan blangko,
hasil perhitungan dari data pengukuran larutan encer, atau dari data kurva
kalibrasi (persamaan regresi linier).

b. Batas kuantisasi (BK/LQ)

Adalah konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat ditentukan dengan
presisi dan akurasi yang diterima dalam kondisi percobaan yang ditetapkan, BD
dan BK dinyatakan dalam satuan konsentrasi. Suatu karakteristik metode
penetapan kadar senyawa kadar rendah dalam matriks sampel seperti cemaran dan
hasil degradasi dalam bahan baku obat atau sediaan farmasi.
Pengujian :
1) Untuk metode non instrumental, umumnya ditentukan dengan melakukan
analisis sampel yang mengandung analit, lalu menetapkan kadar terendah
analit yang dapat dideteksi dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima.
2) Untuk metode instrumental, umumnya dengan mengukur besarnya respon latar
belakang analisis dengan cara menganalisis sejumlah larutan blangko sampel
dan menghitung simpangan bakunya. Batas kuantitasi (BK) adalah nilai
simpangan baku larutan blangko (SD) dikalikan faktor (10/b).
Untuk pengukuran respon instrumen yang memberikan latar belakang (noise)
maka batas kuantitasi adalah konsentrasi analit dalam larutan dimana respon
instrumen memberikan ratio signal-noise (S/N) = 10.
Perhitungan:
- BK = Konsentrasi larutan pada S/N 10
= 10 [Konsentrasi larutan uji/(S/N)]
- Bk = 10 (SD/b) = 10 (Sy/x)/b
Dimana : b = kemiringan garis regresi
 SD = simpangan baku blangko
Sy/x = simpangan baku residual garis regresi

AKURASI (KECERMATAN)
Adalah tingkat kedekatan hasil pengujian metode dengan nilai yang sebenarnya atau
nilai yang dinyatakan benar.
Pengujian :
Akurasi ditentukan dengan 4 cara sebagai persen perolehan kembali (recovery).
a. Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi terhadap sampel yang telah
diketahui kadarnya. Sampel yang digunakan adalah sampel acuan baku yang
dikeluarkan badan resmi (SRM dari NIST, dan lain-lain).
b. Analisis kadar analit yang ditambahkan ke dalam matriks sampel (plasebo) yang
dianalisis (spiked method).
c. Jika matriks dan eksipien tidak tersedia, maka akurasi dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali kadar analit yang ditambahkan pada produk jadi yang sudah
mengandung analit (standar addition method).
d. Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang divalidasi terhadap hasil
dengan metode baku (cara grafik).
Kriteria penerimaan akurasi *)

Jenis Uji Level Konsentrasi Rentang Kriteria

Penetapan kadar 3 level, dengan 3 70%, 100% 130% Bias : ± 2%
dalam bahan baku kali pengujian (80%, 100%, 120%) Rekoveri :
atau sediaan jadi 98,0 – 102,0%
Disolusi 3 level dengan 3 kali
20 – 35% Q Bias : ± 5%
pengujian 50 – 80 % Q Rekoveri :
100 – 130% Q 95,0 – 105,0 %
Penetapan kadar 1 level dengan 3 kali LOQ – 1% Bias : ± 20,0%
Rendah (Cemaran) pengujian Rekoveri :
80,0 – 120,0%
Penetapan Kadar 3 level dengan 3 kali LOQ – 20 kali LOQ Bias : ± 50,0%
sangat rendah pengujian Rekoveri :
(Cleaning) 50,0 – 150,0%)
*) Handbook of Pharmaceutical analysis by HPLC
**) Q Persen terdisolusi
PRESISI (KESEKSAMAAN)
Adalah tingkat kesesuaian antara hasil analisis individual jika prosedur dilakukan
berulang kali terhadap sampel ganda atau beberapa sampel yang homogen.
Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (SBR) atau koefisien
variasi (KV). Presisi metode dinyatakan dengan tiga jenis penetapan yaitu repeatabilitas
(keterulangan), presisi antara dan reprodusibilitas (ketertiruan).
a. Repeatability (keterulangan)
Adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil analisis yang sama untuk
beberapa sampel yang kadarnya sama yang dilakukan oleh satu orang analis pada
waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama.
Keterulangan diukur terhadap 6 jenis sampel dengan konsentrasi sama 100% dari
konsentrasi aktual atau 3 jenis sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari
konsentrasi aktual yang diukur masing-masing tiga kali (triplikasi).
b. Presisi antara (intermediate precision)
Adalah pengukuran kinerja metode dimana sampel-sampel diuji dan dibandingkan
menggunakan tenaga analis berbeda, peralatan berbeda atau hari berbeda (inter day
precision). Presisi antara tidak perlu diuji, jika kajian reprodusibilitas telah dilakukan.
Nama lain presisi antara adalah “Ruggedness”.
c. Reprodusibilitas (ketertiruan)
Merupakan pengujian presisi yang terakhir dan tuntas. Reprodusibilitas diuji dengan
cara menyiapkan sampel yang homogen dan stabil, lalu diuji oleh beberapa
laboratorium (studi kolaboratif). Hasil ini akan memperlihatkan adanya galat acak
yang disebabkan oleh sampel dan laboratorium, serta galat sistematik. Dihitung
dengan ANOVA.
d. Presisi sistem atau instrumen
Keragaman dalam pengukuran menggunakan suatu instrumen akan memberikan
kontribusi pada presisi sistem. Oleh karena itu sistem yang digunakan harus diuji
kesesuaiannya meliputi misalnya keterulangan penyuntikan, resolusi, kesimetrisan
pada kromatografi.
Kriteria penerimaan presisi *)
Repeatabilitas dan presisi antara
Jenis Pengujian Level dan Rentang Kriteria Penerimaan
Konsentrasi
Penetapan 3 level dengan 3 kali (70, RSD ≤ 2,0%
kadar/keseragaman 100, 130%) atau 6
kandungan penetapan pada 100%
Disolusi 12 sampel kadar rendah RSD ≤ 20%
Penetapan kadar rendah 6 replika pada LOQ dari RSD ≤ 20,0%
(Cemaran) batas toleransinya
Cleaning 6 replikat pada 10 LOQ RSD ≤ 20,0%

ROBUSTNESS (KETEGARAN METODE)

Ukuran kemampuan metode untuk tetap tak terpengaruh dan bertahan terhadap
pengaruh kecil, yang dilakukan dengan sengaja dengan membuat variasi pada faktor yang
berpengaruh, tetapi memberikan indikasi reliabilitas metode yang normal pada pengujian
biasa.

Tahapan Uji :
a. Identifikasi faktor-faktor yang berpengaruh pada pengujian
b. Menentukan level dari faktor-faktor tersebut
c. Seleksi dan disain percobaan
d. Pelaksanaan percobaan
e. Perhitungan pengaruh faktor terhadap hasil analisis (menggunakan statistika – teknik
ANOVA)

TAHAPAN PELAKSANAAN VALIDASI

Dengan asumsi semua bahan yang digunakan dalam validasi/verifikasi sudah siap, maka
tahapan validasi metode dapat diuraikan sebagai berikut :

1. Hari pertama, pengujian linearitas menggunakan paling sedikit 6 level konsentrasi (untuk
bahan baku obat maupun sediaan farmasi). Penetapan kadar analit dalam bahan baku obat
maupun sediaan farmasi.
2. Pada akhir hari 1 : Penetepan kadar analit dalam 6 sampai kadar sama yang homogen atau
3 sampel kadar berbeda (80, 100 dan 120%) untuk penetapan akurasi dan presisi.
3. Hari ke 2 dan 3 : Pengujian presisi antar hari (inter day precision).
4. Hari ke 4 : Penetapan batas kuantisasi dan batas deteksi serta pengulangan penetapan
presisi (bila diperlukan) karena LOQ dapat dihitung dari data uji linearitas melalui nilai
Sy/x dan kemiringan garis regresi (b)
5. Hari ke 5 : Evaluasi dan pembuatan dokumen/laporan validasi.

Kriteria penerimaan pada validasi metode analisis

Parameter Validasi Kriteria Penerimaan

1. Spesifikasi (metode c. Pada kromatogram hasil penyuntikan larutan analit encer dan
kromatografi) blangko/placebo tidak terdapat puncak lain yang mengganggu
di waktu retensi analit
d. Puncak analit target terpisah dengan jelas dari puncak yang
lain
e. Puncak analit target murni berdasarkan detektor PDA pada
kondisi degradasi buatan
2. Linieritas Kriteria ini berlaku untuk minimal 6 titik konsentrasi antara
20-120% dari konsentrasi target :
a. Koefisien korelasi (r) tidak kurang dari 0,995
b. Persen “bias” dari y-intersept tidak kurang dari 5,0% dan
tidak lebih dari +5,0%
c. Vx0 ≤ 2.0%
3. Rentang Keseksamaan, kecermatan harus sesuai pada kadar 80% sampai
120% kadar sampel
4. Kecermatan Rata – rata rekoveri masing-masing analit harus tidak kurang dari
(akurasi) 98% dan tidak lebih dari 102% dari kadar target
5. a. Presisi Simpangan baku reelatif (SBR) dari enam kali
b. Presisi antara penetapan/penyuntikan atau dari 9 kali penetapa (3 kali dari 3
(Intermediate konsentarsi) tidak lebih dari 2%
precision) Simpangan baku relative dari penetapan oleh dua analit, dua
instrumen atau hari yang berbeda tidak lebih dari 2%
6. Stabilitas analit a. Hasil penetapan kadar dari sampel yang disiapkan tidak
berubah lebih dari 2% pada periode waktu yang ditetapkan
b. Hasil penetapan kadar dari larutan baku kerja tidak berubah
lebih dari 2% pada periode waktu yang ditetapkan
7. Ketegaran metode Kriteria kesesuaian sistem harus dipenuhi untuk variasi
(Robustness) percobaan berikut :
- Komponen organic dalam fase gerak ± 5%
- Konsentrasi pereaksi pasangan ion ± 10%
- pH fase gerak ± 0,1 unit pH, laju alir ± 10% detector ± 2%
nm, suhu kolom ± 5%