NAMA : YUNITA

NPM : 1543050101

KIMIA ANALISIS I (Pagi B)

Nama Senyawa : Azithromycin

RM/BM : C 38 H 72 N 2 O 12 2H 2 O/ 785,0

Pemerian : Serbuk, hampir putih, tidak berbau

Jenis Obat : Antibiotik makrolida

Kelarutan : 1. Sangat sukar larut dalam air,etanol dan dalam

larutan
alkali yang mengandung air
2. Dalam asam asam encer
3. Larut dalam pelarut organik
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Mengobati infeksi bakteri

PEMERIKSAAN KROMATOGRAFI HPLC PADA AZITHROMYCIN

I. Alat dan Bahan

a. Alat :

1 set alat Kromatogafi HPLC

 b. Bahan :

AZITHROMYCIN standar (99,49%) dipasok oleh Shifa Pharmed

Industrial Group (Iran) sebagai sampel hadiah. HPLC-grade metanol,
HPLC-kelas asetonitril, kalium dihidrogen fosfat, asam klorida dan
natrium hidroksida berasal dari Merck (Darmstadt, Jerman). HPLC air
kelas yang digunakan dalam analisis disiapkan oleh reverse osmosis
dan melewati 0,45 m Millipore Filter (Millipore Company, USA)
sebelum digunakan. Sebuah pH 6,0 penyangga fosfat (0,2 M),
dibuat dengan melarutkan 6,8 g kalium dihidrogen fosfat dalam 500
mL air, menambahkan 28 mL 0,2 solusi hidroksida M natrium dalam
air dan menipiskan dengan air sampai 1000 mL (USP). Dapar fosfat
pH 8,0 dibuat dengan melarutkan 6,8 g kalium dihidrogen fosfat
dalam 500 mL air, menambahkan 230,5 mL 0,2 solusi hidroksida M
natrium dalam air dan menipiskan dengan air sampai 1000 mL
(USP).

II. Cara Kerja

1. Instrumen

sistem HPLC (D-7000, Merck Hitachi, Tokyo, Jepang) dengan pompa Binary L-
7100, L-7420 UV-Vis detektor dengan kolom oven (perairan, USA) dipekerjakan.
software HSM-7000 digunakan untuk akuisisi dan pengolahan data.

2. kolom analitis

AZI dianalisis dengan analisis HPLC fase terbalik menggunakan kolom HPLC
yang berbeda. MZ-Analysentechnik GmbH, Target Perfectsil, ODS-3 (250 mm
panjang, 4,6 mm diameter dalam dan 5 ukuran m partikel) kolom dengan MZ C18
guard analitis kolom (20 mm x 4,6 mm) dikemas dengan sorben yang sama,
LiChrospher RP-8 , Merck, (250 mm panjang, 4 mm diameter dalam dan 5 m
ukuran partikel), LiChrospher RP-8, Merck, (100 mm panjang, 4,6 mm diameter
dalam dan 5 m ukuran partikel), LiChrospher RP-18, Merck (250 mm panjang, 4,6
mm diameter dalam dan 10 m ukuran partikel), ODS-H optimal, Capital, (150 mm
panjang, 4,6 mm diameter dalam dan 3 pm ukuran partikel) dan C 18 -SB-ZX 3,
Zorbax (panjang 50 mm , 2,1 mm diameter dalam dan 3,5 m ukuran partikel) yang
digunakan. Semua percobaan dipekerjakan dalam modus isokratik.

3. Penentuan panjang gelombang UV yang tepat

Sebuah panjang gelombang yang cocok diperlukan untuk penentuan

AZITHROMYCIN. Panjang gelombang yang tepat untuk deteksi obat dalam fase
gerak ditentukan oleh scanning panjang gelombang pada kisaran 200-400 nm
dengan Shimadzu UV-1201 (Shimadzu, Jepang) spektrofotometer.

4. kondisi kromatografi
Dua pelarut organik (asetonitril dan metanol), fraksi volume yang berbeda dari
metanol disaring dan degassed dan asetonitril (50, 60, 70, 80, dan 90 v / v) dan
dapar fosfat dengan pH yang berbeda (6.0, 8.0) pada konsentrasi 0,2 M, 0,02 M
diperiksa mungkin fase mobile. Panjang gelombang ditetapkan pada 210 nm.
panjang gelombang ini dipilih karena merupakan maksimum UV dan memberikan
sensitivitas yang diperlukan untuk kuantisasi konsentrasi obat rendah dalam
bentuk sediaan farmasi. Temperatur kolom dipertahankan pada suhu yang berbeda
(25 C, 50 C). Fase gerak dipompa pada tingkat yang berbeda aliran (1,0, 1,5
mL / menit) dengan 500 uL Volume injeksi.

5. Pembuatan larutan Standar

Kuantitas akurat ditimbang dari AZITHROMYCIN (10 mg) dipindahkan ke labu

ukur 10 mL, sekitar 5 ml fase gerak ditambahkan dan dilarutkan. Solusinya
dibawa ke volume dengan fase gerak dan benar dicampur untuk mendapatkan
konsentrasi akhir 1,0 mg / mL. Larutan stok siap disimpan pada suhu 4 C dalam
botol kaca. Dari larutan stok ini, solusi standar baru disiapkan sebelum analisis.

6. HPLC validasi metode

Validasi metode dilakukan pada fase diam yaitu terbaik ditentukan. C18 kolom, 5
m, 250 mm 4,6 mm.

7. linearitas

Kurva kalibrasi dibangun dengan sembilan konsentrasi (bersamaan disiapkan)

mulai 1-80 mg / mL untuk AZITHROMYCIN. Setiap tingkat konsentrasi
disiapkan dalam rangkap tiga dan menganalisis tiga kali. Kurva kalibrasi dibangun
dengan memplot konsentrasi senyawa dibandingkan respon puncak daerah.
linearitas dievaluasi dengan metode regresi kuadrat terkecil.

8. Ketelitian

Ketepatan metode ini ditentukan oleh pengulangan (intra-hari) dan presisi

menengah (inter-hari) dan dinyatakan sebagai RSD (%). Sembilan meniru
suntikan solusi standar AZITHROMYCIN pada konsentrasi berkisar 1-80 mg /
mL dibuat seperti dijelaskan di atas. Variasi intra-hari dinilai oleh analis yang
sama lebih dari satu hari, sedangkan inter-hari presisi dilakukan oleh analis
independen lain selama 3 hari.

9. Ketepatan

Keakuratan metode ini diuji dengan analisis ulangan sampel yang berbeda dari
AZITHROMYCIN pada konsentrasi yang diketahui dan kemudian dibandingkan
dengan konsentrasi yang benar itu. Akurasi dinilai dengan persentase recovery.
 10. Deteksi dan kuantisasi batas (sensitivitas)

Batas kuantifikasi (LOQ) ditentukan selama evaluasi kisaran linear dari kurva
kalibrasi. LOQ didefinisikan sebagai konsentrasi terendah menghasilkan presisi
(% CV) dan akurasi (% recovery) dalam rentang yang dapat diterima mereka
dengan daerah puncak tiga kali batas deteksi (LOD).

III. Hasil

1. Temukan wavelength

Spektrum ultraviolet dari AZITHROMYCIN menunjukkan panjang gelombang

serapan maksimum pada 210 nm (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2 ). Oleh
karena itu, 210 nm panjang gelombang terpilih untuk mencapai sensitivitas
tertinggi untuk penelitian.

2. Pemilihan fase gerak

kombinasi yang berbeda dari asetonitril atau metanol dan penyangga fosfat,
serta konsentrasi penyangga yang berbeda (0,2 M, 0,02 M) diuji dan kondisi optimum
pada penyangga metanol-fosfat 0,02 M (90:10, v / v), dicapai. Kromatogram yang
diperoleh menunjukkan pemisahan yang cepat dengan waktu retensi
AZITHROMYCIN di 7.23 min ( Gambar 3 ).
 3. Pemilihan HPLC fase diam

Berbeda fase stasioner terbalik digunakan dan hasilnya dibandingkan. Hasil

terbaik diperoleh dengan menggunakan Octadecylsilane (ODS, 18). Berbagai kolom
C18 dengan panjang dan partikel yang berbeda ukuran diadili dan hasilnya
dibandingkan berdasarkan pada lebar puncak dan simetri puncak. Puncak lebar
terbaik diperoleh pada kolom C18 dengan 250 mm panjang dan 5 ukuran m partikel
(seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3 ).

Penurunan panjang kolom 150 mm meskipun mengakibatkan waktu retensi

lebih pendek, tapi simetri puncak itu memburuk. Mengubah ukuran partikel fase diam
C18 dari 5 pm sampai 3 pm mengakibatkan tailing dan hilangnya puncak simetri (
Gambar 4 ).

Meningkatkan ukuran partikel untuk 10 pm meskipun memberi puncak

sempurna simetris, tetapi meningkatkan lebar puncak hingga 5 menit dengan
reproduktifitas bawah dan batas deteksi yang lebih tinggi (seperti yang ditunjukkan
pada Gambar 5 ).
 4. Pemilihan laju alir dan suhu kolom

Peningkatan suhu kolom dari 25 ke 50 menyebabkan penurunan total

waktu yang dibutuhkan untuk proses pemisahan dengan penurunan pelebaran puncak
dan peningkatan sensitivitas. Juga, meningkatkan laju aliran dari 1 mL / menit ke 1,5
mL / menit menunjukkan penurunan serupa dalam waktu retensi.

5. Pengaruh pH fase gerak

Kami mempelajari efek dari berbagai pH ( 6 , 8 ), menggunakan 10% larutan

natrium hidroksida. Dapar fosfat dengan pH tinggi ( 8 ) digunakan untuk menghindari
masalah dengan silika pembubaran. Selain itu, stabilitas AZITHROMYCIN rendah
media asam. Kami mengamati bahwa hasil pemisahan terbaik dicapai pada pH 8.

6. Validasi metode

Plot respon daerah puncak terhadap konsentrasi AZITHROMYCIN

ditunjukkan pada Gambar 6 . Plot linear selama rentang konsentrasi 1-80 mg / mL
menghasilkan persamaan regresi Y = 2.05 10 4 X + 2,94 10 4 dengan koefisien
korelasi 0,9976 dan dengan interval kepercayaan pada p = 0,05. Sebuah plot yang
sama pada konsentrasi rendah (1-10 mg / mL) memberi nilai kemiringan 2.14 10 4
(lihat kotak dimasukkan dalam Gambar 6 ).
 7. Ketelitian

Hasil yang diperoleh untuk studi pengulangan dan presisi menengah disajikan
dalam Tabel 1 Metode presisi memiliki deviasi standar relatif (RSD) di bawah 1,59%
untuk pengulangan dan 1,61% untuk presisi menengah, yang memenuhi kriteria
penerimaan yang diusulkan (RSD:. Tidak lebih 2,0%).

Intra dan inter-hari variasi metode HPLC untuk penentuan AZITHROMYCIN

Konsentrasi (mg / mL) Intra-hari presisi (% RSD) Inter-hari presisi (% RSD)

1 1.29 1.49
3 1.2 1.18
5 0.75 1.27
7 0.98 1.08
10 1.59 0.75
20 1.09 0.88
40 1.79 1.08
60 0.79 1.16
80 1.49 1.61

8. Ketepatan

Hasilnya dinyatakan sebagai persen pemulihan diperoleh untuk konsentrasi

AZITHROMYCIN yang berbeda. Tabel 2 menunjukkan bahwa persen pemulihan
mulai 85-115,4% dengan RSDs. mulai 0,59-1,59% yang memenuhi kriteria
penerimaan yang diusulkan (% kisaran Pemulihan: 80- 120%).

Akurasi / pemulihan dari metode yang diusulkan

 Konsentrasi (mg / mL) % Pemulihan % RSD
1.5 110.2 1.19
4 115.4 1.59
6 97.9 1.09
8 90,09 0.79
15 85.39 0.89
30 105,4 1.29
50 101,2 0.69
70 85 0.59

9. Deteksi dan kuantisasi batas (sensitivitas)

Hasil penelitian menunjukkan bahwa deteksi dan kuantitasi batas

AZITHROMYCIN menggunakan metode ini adalah 0,3 mg / mL dan 1 mg / mL,
masing-masing.

IV. Kesimpulan

Sebuah metode baru, spesifik, dan divalidasi untuk analisis AZITHROMYCIN

dengan menggunakan HPLC dilengkapi dengan deteksi UV pada 210 nm
dikembangkan. Metode ini akurat, tepat, sensitif, dan linear. Metode ini dapat
digunakan untuk analisis AZITHROMYCIN pada berbagai konsentrasi dan dalam
formulasi obat yang berbeda serta bahan baku.

V. Daftar Pustaka

1. Sean C Sweetman, editor Martindale, The referensi obat lengkap London:... The
Pharmaceutical Tekan; 2009. pp. 207-209.
2. Ghodsi R, Kobarfard K, Tabatabai SA. Penerapan Narrow-Bore Kolom HPLC
di Penentuan Cepat Sildenafil Sitrat di Its Bentuk Farmasi Dosis. Iran J. Pharm.
Res 2012; 11:.. 123-127 [ PMC gratis artikel ] [ PubMed ]
3. Sastre Torano J, Guchelaar HJ. Penentuan kuantitatif dari antibiotik makrolida
eritromisin, roxithromycin, azithromycintromisin dan klaritromisin dalam serum
manusia dengan kinerja tinggi kromatografi cair dengan menggunakan pre-kolom
derivatisasi dengan 9-fluorenylmethyloxycarbonyl klorida dan fluoresensi deteksi.
J. Chromatogr B. Biomed Sci Appl 1998; 720:.. 89-97 [ PubMed ]
4. Bahrami G, Mirzae S, Kiani A. cair kinerja tinggi penentuan kromatografi
azithromycintromisin dalam serum menggunakan deteksi fluoresensi dan
penerapannya dalam studi farmakokinetik manusia. J. Chromatogr B. 2005; 820:.
277-81 [ PubMed ]
5. Bahrami G, Mohammadi B. A baru on-line, di-tabung teknik derivatisasi pre-
kolom untuk kinerja tinggi cair penentuan kromatografi azithromycintromisin
dalam serum manusia. J. Chromatogr B. 2006; 830:. 355-8 [ PubMed ]
6. Taninaka C, Ohtani H, Hanada E, Kotaki H, Sato H, Iga T. Penentuan
eritromisin, klaritromisin, roxithromycin, dan azithromycintromisin dalam plasma
dengan kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi amperometri. J.
Chromatogr B. Biomed Sci Appl 2000; 738:.. 405-11 [ PubMed ]
7. Kees F, Spangler SM, Wellenhofer Penentuan makrolid dalam matriks biologi
dengan kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi elektrokimia. J.
Chromatogr A. 1998; 812:. 287-93 [ PubMed ]
8. Fouda GH, Schneider RP. Penentuan kuantitatif dari azithromycintromisin
antibiotik dalam serum manusia dengan kinerja tinggi kromatografi cair (HPLC)
tekanan -atmospheric kimia ionisasi spektrometri massa: korelasi dengan metode
HPLC-elektrokimia standar Ther.. Obat Monit 1995; 17:. 179-83 [. PubMed ]
9. Abuin Jadi, Codony R, Ramon Compa~N'O, Granados ME, Dolors Prat M.
Analisis antibiotik macrolide di air sungai dengan ekstraksi fase padat dan cair
kromatografi-mass spectrometry. J. Chromatogr A. 2006; 1114:. 73-81 [ PubMed ]
10. Koch DE, Bhandari A, Tutup L, Robert P. Hunter. Ekstraksi
Azithromycintromisin darair limbah kota dan kuantisasi menggunakan
kromatografi cair / spektrometri massa. J. Chromatogr A. 2005; 1074:. 17-22 [
PubMed ]
11. Yan Shen, Chun Yin, Mengxiang Su, Jiasheng Tu. Cepat, sensitif dan selektif
kromatografi cair-spektrometri massa tandem (LC-MS / MS) metode untuk
kuantifikasi topikal azithromycintromisin dalam jaringan kelinci konjungtiva. J.
Pharmaceut. Biomed. Anal 2010; 52:.. 99-104 [ PubMed ]
12. US Pharmacopeia Nasional formularium.; 2010. pp. 1965-1973.