MAKALAH ANALITIK

REVIEW JURNAL LC/MS

OLEH:
INEKE AYUNINGSIH KAHA
YULINDA S. BILI

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS NUSA CENDANA
KUPANG
2016
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Tuhan,karena atas berkat-Nya penulis dapat menyelesaikan
makalah ini dengan baik.

Adapun isi dari makalah ini adalah tentang apa itu LC/MS,instrumen, perangkat,cara
kerja,dan hasil yang di peroleh berdasarkan cara kerja LC/MS.

Dengan selesainya makalah ini,penulis meyampaikan terima kasih kepada semua pihak
yang turut membantu dalam menyelesaikan makalah ini,baik secara langung maupun tidak
langsung.Penulis menyadari makalah ini masih jauh dari kesempurnaan,oleh karena itu,penulis
sangat mengharapkan kritikan dan saran dari pembaca yang bersifat membangun.Dan kiranya
makalah ini dapat menambah wawasan dari pembaca sekalian.

Kupang, Mei 2018

Penulis
 BAB I
PENDAHULUAN

A.Latar Belakang
Optimalisasi proses penemuan obat yang dibuat selama dekade terakhir telah
difasilitasi oleh meningkatnya kemampuan kimia sintesis menggunakan teknologi seperti
kimia kombinatorial. Hal ini juga memperoleh keuntungan oleh penerapan teknologi
throughput yang tinggi untuk secara cepat mengidentifikasi kandidat obat ampuh dari
perpustakaan senyawa besar. Salah satu tantangan yang tersisa kunci yang terkait dengan
ADME (penyerapan, distribusi, metabolisme, ekskresi), merupakan bagian integral dari
proses penemuan obat awal, adalah karakterisasi senyawa ini. teknologi yang cepat dan
kuat diperlukan untuk menyediakan data ADME berkualitas tinggi yang memadai.
Berbeda dengan penyelidikan potensi di screening tinggi-throughput (HTS), sifat ADME
sampel obat yang potensial hanya dapat diatasi dengan secara simultan mengukur
senyawa itu sendiri. Dalam hal ini teknologi yang di perlukan adalah , spektrometri
massa (MS), karena mereka memberikan sensitivitas yang memadai, selektivitas, dan
kecepatan untuk proses analisis. Namun, penyelidikan awal sifat ADME belum mampu
mengimbangi tuntutan yang dihasilkan oleh penerapan teknologi sintetis dan screening
yang semakin besar.
B.Rumusan Masalah
1. Apa itu LC/MS?
2. Apa saja instrumen pada LC/MS?
3. Apa saja perangkat LC/MS?
4. Bagaimana cara kerja LC/MS?
5. Bagaimana hasil yang di peroleh berdasarkan cara kerja LC/MS?

C.Tujuan
Tujuan penulisan makalah ini adalah
1. Untuk mengetahui apa itu LC/MS
2. Untuk mengetahui instrument-instrumen pada LC/MS
3. Untuk mengetahui perangkat-perangakat dalam LC/MS
4. Untuk mengetahui cara kerja dari LC/MS
5. Untuk mengetahui hasil kerja dari LC/MS
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1. Pengertian LC/MS
Liquid Chromatograpy – Mass Spectroscopy adalah dua alat yang digabungkan menjadi
satu, yang berfungsi untuk memisahkan beberapa senyawa atau campuran senyawa berdasarkan
kepolarannya (prinsip kerja kromatografi), dimana setelah campuran senyawa tersebut terpisah,
maka senyawa yang murni akan diidentifikasi berat molekulnya. Data yang didapatkan adalah
berat molekul ditambah beberapa muatan dan berat molekul pelarut.Menggunakan peralatan dan
gas khusus optimal saat melakukan Liquid Chromatography dengan Mass Spectrometer (LC-
MS), yang dikenal juga sebagai High Performance Liquid Chromatography dengan Mass
Spectrometer (HPLC-MS), akan sangat meningkatkan keakuratan hasil Anda.
LC-MS memadukan daya pemisahan HPLC untuk bahan berat molekul besar dengan
kemampuan MS untuk mendeteksi dan mengonfirmasikan identitas molekul secara selektif.
Aplikasi utamanya adalah di bidang penelitian farmasi, analisis lingkungan, pengujian makanan,
dan kedokteran forensik.
LC-MS menggunakan sistem HPLC, tetapi pada saat fase gerak cair meninggalkan
kolom, sampel cairan disemprotkan untuk menghasilkan tetes mikro. Tetes ini menguap dengan
cepat dan melepaskan molekul analit terionisasi yang kemudian dapat dipisahkan dalam MS.
Semprotan beraliran besar dapat memanfaatkan atomisasi atau nebulisasi tambahan yang
menggunakan aliran tinggi gas inert seperti Nitrogen.

2.2. Instrumen LC/MS

Penanganan sampel analitis dilakukan oleh sistem RapidFireTM autosampler cepat-suntik
(BioCius, Woburn, MA, USA). Sistem ini terdiri dari handler piring dilengkapi dengan barcode
scanner, perangkat injeksi sampel yang cepat dan fase padat ekstraksi mobil Tridge. Robotika
kecepatan tinggi (injeksi jarum statis di x / y-sumbu tapi bergerak di z-sumbu, piring bergerak
bersarang di x / y-axis tapi statis di z-axis) dan cepat beralih katup putar mengaktifkan tarif ow fl
tinggi. Karena sistem RapidFireTM asli mampu menyuntikkan hanya baris baris-demi-dari
piring 96- atau 384-baik perangkat lunak sistem itu dimodifikasi untuk memungkinkan
penggunaan sebagai autosampler fleksibel. Sistem ini terdiri dari dua stasiun pencuci terletak di
sebelah piring untuk memfasilitasi interim mencuci dle nee- antara mencuci sampel. tempat
mencuci berada di bawah pengalir, diisi dengan air dan dengan metanol. Untuk memudahkan
penggunaan 0,8 mL piring, perangkat penanganan piring dan jarum suntik ( "pengisap")
diadaptasi di rumah. pengisap harus miring dengan sudut 30◦ untuk menembus andal dan tanpa
pukulan-out dasar penyegelan piring sampel. Sebagai sistem baru ini dirancang untuk
menjalankan, tidak ada metode pengembangan dan interaktif pra-cek dalam hal metode
selektivitas selama spektrometri massa anal- ysis. Oleh karena itu, empat palung dibangun ke
dalam sistem di sebelah sarang piring untuk memungkinkan suntikan matriks kosong untuk
Penegasan selektivitas metode analisis. Teknologi RapidFireTM didasarkan pada kolom klasik
switching ing [31] dan solusi teknis yang dikembangkan untuk manajemen pelarut dan kolom
beralih digambarkan pada Gambar. 1A-C. sampel uid Liq- disedot oleh pompa vakum ke loop
sampel 10 L untuk 250 ms (A) dan kemudian flushed untuk 3000 ms ke kartrid C4 (B) (volume
kamar 3,8 L; BioCius, Woburn, MA, USA) dengan fase gerak berair. Padat langkah ekstraksi
fase mempertahankan analit saat mengeluarkan campur matriks (misalnya, komponen buffer).
analit yang diserap dan kembali- dari kartrid untuk 3000 ms dengan fase gerak organik dan di
halau ke spektrometer massa (C). Deteksi spektrometri massa dilakukan pada TSQ Vantage dari
ThermoFisher (San Jose, CA, USA). Sambil melakukan kembali flush ke spektrometer massa,
loop sampel dan tubing yang relevan yang fl ushed dengan fase gerak organik untuk mencegah
carry-over dari analit atau matriks komponen-komponen ke dalam sampel berikutnya.
Equilibrium untuk sampel berikutnya dilakukan di perangkat A (Gambar. 1) dan membutuhkan
500 ms. Dalam rangka untuk lebih meminimalkan efek carry-over, stasiun mencuci dari sistem
yang digunakan untuk melakukan mencuci jarum dengan air murni (100%) dan metanol murni
(100%) antara sampel. Pelarut telah dijalankan telah di atur terdiri dari tiga dan terus berjalan
dan isocratically operasi pompa HPLC (G1310A, Agilent, Waldbronn, Jerman): Pompa 1 (air
99,9%, 0,09% asam format dan 0,01% TFA, tingkat pengujian 1,25 mL / min) sampel di alirkan
ke cartridge dan SPE-wash. Pompa 2 (99,9% asetonitril / metanol (1: 1, v: v), 0,09% asam
format dan 0,01% TFA) berjalan pada tingkat ow fl 1,25 mL / menit dan melakukan sebuah
bilasan organik dari loop sampel dan pipa ( katup rotary 1, 2 dan 3; negara C). Pompa 3 adalah
eluting analit dari cartridge ke dalam spektrometer massa dengan fase gerak organik dari pompa
2 (fl ow menilai 1,25 mL / menit).
LC-MS / sistem MS yang divalidasi terdiri dari dua pompa HPLC (PU-980, Jasco, Groß-
Umstadt, Jerman), satu pompa biner (G1312A, Agilent, Waldbronn, Jerman), digabungkan
dengan QTRAP spektrometer massa 2000 (AB Sciex , Foster City, CA, USA) dan dijalankan
dengan teknologi kolom switching dan throughput 1 min / sampel. Sistem ini divalidasi terhadap
gradien linier LC-MS / MS-sistem tems sebelumnya.

2.3.Perangkat LC/MS
1. Spektrometri massa QuickQuanTM 2.3, XcaliburTM 2.0.7, XDK
2. Data spektral perangkat lunak pengolah QuickCalcT
3. Database
4. The LabVIEW software
5. AssayExplorer
2.4. Cara kerja LC/MS
Salah satu cara kerja LC/MS adalah dalam proses pembuatan obat,sesuai dengan jurnal
yang telah di gunakan oleh penulis dalam makalah ini dalah penerapan LC/MS dalam pembuatan
obat dalam bidang farmasi.berikut adalah cara kerja LC/MS:
preparasi sampel
Sampel di ambil dari invitro(konsentasi 1M) dalam waktu 0, 5, 15, 30 dan 45 menit
dan kemudian di tambahkan dengan asetonitril dengan volume 2 kali lipat untuk mengendapkan
protein dan menghentikan reaksi enzimatik. Sebuah aliquot dari internal standar proprietary
generik pada konsentrasi 2 M ditambahkan ke masing-masing sampel dan sampel disentrifugasi
pada 4000 rpm dan 4 ◦ C (centrifuge 5810R, Eppendorf, Hamburg, Jerman) selama 20 menit.
Supernatan dipindahkan ke 0,8 mL piring. Piring sampel yang panas-disegel dan disimpan pada -
20 ◦ C sampai analisis. Langsung sebelum analisis, piring dicairkan dan disentrifugasi pada 4000
rpm selama 5 menit. solusi Tuning obat dianalisis disediakan di piring terpisah untuk optimasi
senyawa spektrometri massa pada konsentrasi 1 M di
50% metanol. Semua sampel dan tuning plat barcode label dan terkait dengan fi le yang berisi
semua data analisis misalnya, nama yang relevan analisis senyawa, rumus molekul, ID
eksperimen, posisi di piring dan kode standar internal. Informasi dalam yang sesuai fi le yang
mudah diakses oleh perangkat lunak master dari sistem injeksi melalui pembaca barcode.

Instrumentasi

Penanganan sampel analitis dilakukan oleh sistem RapidFireTM autosampler cepat-suntik

(BioCius, Woburn, MA, USA). Sistem ini terdiri dari handler piring dilengkapi dengan barcode
scanner, perangkat injeksi sampel yang cepat dan fase padat ekstraksi mobil- Tridge. robotika
kecepatan tinggi (injeksi jarum statis di x / y-sumbu tapi bergerak di z-sumbu, piring bergerak
bersarang di x / y-axis tapi statis di z-axis) dan cepat beralih katup putar mengaktifkan tarif ow fl
tinggi. Karena sistem RapidFireTM asli mampu menyuntikkan hanya baris baris-demi-dari
piring 96- atau 384-baik perangkat lunak sistem itu dimodifikasi untuk memungkinkan
penggunaan sebagai autosampler fleksibel. Sistem ini terdiri dari dua stasiun pencuci terletak di
sebelah piring untuk memfasilitasi interim mencuci dle nee- antara mencuci sampel. tempat
mencuci berada di bawah pengalir, diisi dengan air dan dengan metanol. Untuk memudahkan
penggunaan 0,8 mL piring, perangkat penanganan piring dan jarum suntik ( "pengisap")
diadaptasi di rumah. Pengisap harus miring dengan sudut 30◦ untuk menembus andal dan tanpa
pukulan-out dasar penyegelan piring sampel. Sebagai sistem baru ini dirancang untuk
menjalankan, tidak ada metode pengembangan dan interaktif pra-cek dalam hal metode
selektivitas selama spektrometri massa analysis. Oleh karena itu, empat palung dibangun ke
dalam sistem di sebelah sarang piring untuk memungkinkan suntikan matriks kosong untuk
Penegasan selektivitas metode analisis. Teknologi RapidFireTM didasarkan pada kolom klasik
switching ing [31] dan solusi teknis yang dikembangkan untuk manajemen pelarut dan kolom
beralih digambarkan pada Gambar. 1A-C. sampel Liquid disedot oleh pompa vakum ke loop
sampel 10 L untuk 250 ms (A) dan kemudian flushed untuk 3000 ms ke kartrid C4 (B) (volume
kamar 3,8 L; BioCius, Woburn, MA, USA) dengan fase gerak berair. Padat langkah ekstraksi
fase mempertahankan analit saat mengeluarkan campur matriks (misalnya, komponen buffer).
analit yang diserap dan kembali- dari kartrid untuk 3000 ms dengan fase gerak organik dan di
halau ke spektrometer massa (C). Deteksi spektrometri massa dilakukan pada TSQ Vantage dari
ThermoFisher (San Jose, CA, USA). Sambil melakukan kembali flush ke spektrometer massa,
loop sampel dan tubing yang relevan yang fl ushed dengan fase gerak organik untuk mencegah
carry-over dari analit atau matriks komponen-komponen ke dalam sampel berikutnya.
Equilibrium untuk sampel berikutnya dilakukan di perangkat A (Gambar. 1) dan membutuhkan
500 ms. Dalam rangka untuk lebih meminimalkan efek carry-over, stasiun mencuci dari sistem
yang digunakan untuk melakukan mencuci jarum dengan air murni (100%) dan metanol murni
(100%) antara sampel. Pelarut telah dijalankan telah di atur terdiri dari tiga dan terus berjalan
dan isocratically operasi pompa HPLC (G1310A, Agilent, Waldbronn, Jerman): Pompa 1 (air
99,9%, 0,09% asam format dan 0,01% TFA, tingkat pengujian 1,25 mL / min) sampel di alirkan
ke cartridge dan SPE-wash. Pompa 2 (99,9% asetonitril / metanol (1: 1, v: v), 0,09% asam
format dan 0,01% TFA) berjalan pada tingkat ow fl 1,25 mL / menit dan melakukan sebuah
bilasan organik dari loop sampel dan pipa ( katup rotary 1, 2 dan 3; negara C). Pompa 3 adalah
eluting analit dari cartridge ke dalam spektrometer massa dengan fase gerak organik dari pompa
2 (fl ow menilai 1,25 mL / menit).
LC-MS / sistem MS yang divalidasi terdiri dari dua pompa HPLC (PU-980, Jasco, Groß-
Umstadt, Jerman), satu pompa biner (G1312A, Agilent, Waldbronn, Jerman), digabungkan
dengan QTRAP spektrometer massa 2000 (AB Sciex , Foster City, CA, USA) dan dijalankan
dengan teknologi kolom switching dan throughput 1 min / sampel. Sistem ini divalidasi terhadap
gradien linier LC-MS / MS-sistem tems sebelumnya.

Optimasi senyawa MS

Sebuah prasyarat untuk sensitif dan selektif "Pemantauan Reaksi Beberapa" (MRM)
analisis dengan trometers tiga quadrupole massa alamiah lainnya adalah penentuan transisi
MRM senyawa-spesifik dengan tuning parameter MS. State-of-the-art spektrometer massa secara
otomatis melakukan baik optimasi senyawa dan pengukuran sampel dengan cara yang
sepenuhnya otomatis dan software-dibantu untuk senyawa dalam mode ionisasi positif dan
negatif. Untuk tujuan ini spektrometer massa ditetapkan untuk "mode optimasi" oleh Cepat
Quantum (Thermo Fisher, San Jose, CA, USA) software memicu optimasi senyawa otomatis dan
"MRM mode "untuk analisis kuantitatif. untuk optimasi senyawa solusi senyawa murni (1 M)
yang digunakan, di cuci- dari sistem RapidFireTM berkurang 3000-1000 ms. Massa sinyal
spektrometri dari senyawa yang ditargetkan selama proses optimasi dicapai dengan mengurangi
eluting tingkat pengujian ke 0,3 mL / menit. Waktu suntikan ditetapkan untuk memberikan
sinyal analit dengan spektrometer massa atas permintaan dari software QuickQuanTM, untuk
kedua MS dan optimasi MS / MS. Optimasi senyawa spektrometri massa Kurang dari 1,5 menit
menghasilkan parameter spektrometri massa dasar ionisasi polarisasi (positif atau negatif), S-
lense, tegangan CE dan, yang paling penting, penentuan transisi MRM dioptimalkan. parameter
dioptimalkan disimpan dalam database QuickQuanTM dan dapat secara otomatis diambil untuk
pengukuran sampel dalam modus MRM. Dalam rangka memfasilitasi optimasi senyawa untuk
mode ionisasi positif dan negatif senyawa tuning dilakukan pada pH 7,4. Di fi rst langkah solusi
analit sarat dengan air 10 mM ammo- nium asetat ke cartridge dan dielusi kembali ke
spektrometer massa dengan pelarut organik (95% asetonitril / metanol (1: 1, v: v) dan 5% 10 mM
amonium asetat; pH 7,4). Hasil ionisasi yang lebih tinggi dalam mode ionisasi negatif, pH 7.4
(pelarut A: 10 mM amonium asetat; pelarut B: 95% asetonitril / metanol (1: 1, v: v) dan 5% 10
mM amonium asetat) dipertahankan untuk pengukuran sampel. Untuk sampel menampilkan
respon sinyal yang lebih tinggi dalam mode ionisasi positif sistem secara otomatis beralih dari
pH 7,4-2,5 (pelarut C: air 99,9%, 0,09% asam format dan 0,01% TFA; pelarut D: 99,9%
asetonitril / metanol d: 1, v: v), 0,09% asam format dan 0,01% TFA), dalam waktu kurang dari 1
menit. Hal ini dicapai dengan penerapan tiga katup pengalir yang diposisikan di belakang
degasser dari pompa isocratically kerja RIAS tersebut. Sebuah skema menguraikan otomatis
pelarut pH-perubahan itu digambarkan dalam Gambar. 1D. Perubahan individu dari throughput
sistem pengambilan sampel tinggi di kabel untuk penanganan sinyal diadaptasi di rumah.

2.5 Hasil yang di peroleh

Sebuah efisien sistem analisis berlaku untuk obat awal discovery mengintegrasikan
kecepatan hardware, ketahanan dengan reproduktifitas dan sensitivitas. Menurut persyaratan ini,
tujuannya adalah untuk membangun sebuah sistem untuk analisis spektrometri otomatis dan
tinggi-throughput massa berlaku untuk penyelidikan stabilitas metabolik dan tambahan dalam tes
ADME vitro. The inte- parut dan disesuaikan sistem RapidFire terdiri dari autosampler fleksibel
dengan modul sampel injeksi cepat dan fase padat Unit ekstraksi secara online mampu
menjalankan multiwell-piring dalam format 96- atau 384-baik. Sebuah fitur menghemat waktu
dari tem ini adalah bergerak x- / y-tray, yang dengan cepat menempatkan pelat sampel ke posisi
sampel diprogram sedangkan aspirasi jarum tetap terfiksasi. elaksanaan disesuaikan prinsip Jenis
barcode assay- ke hardware autosampler adalah perbaikan pertama fi sehubungan dengan
pengakuan uji-jenis dan inisiasi otomatis sesuai proses analitis. Jadi piring sampel dari tes
ADME dapat diperkenalkan ke dalam sistem itu tanpa interaksi pengguna. Sebagai akibatnya,
sistem ini mampu membedakan pelat sampel dan piring untuk optimasi senyawa spektrometri
massa. Sejak untuk massa quadrupole tiga spektrometer penentuan fi c MRM-transisi senyawa-
spesifik dan tegangan dasar seperti S-lense dan energi lision col adalah prasyarat untuk
memperoleh data kuantitatif, sistem secara otomatis melakukan keduanya, optimasi senyawa dan
sampel pengukuran sepenuhnya cara otomatis. Tantangan mengoptimalkan kondisi spektrometri
massa sebelumnya diselesaikan dengan analisis ow-injection fl (FIA) [32] konstan infus solusi
analit [33,34]. Oleh karena itu, yang paling sering beralih antara tion optimalisasi dan
pengukuran terlibat perubahan hardware manual, misalnya, kolom telah dilewati untuk
memungkinkan aliran-injection atau autosamplers terpisah digunakan untuk infus konstan
melalui katup tambahan [34]. Dalam pendekatan ini masalah ini diselesaikan dengan seri
berjangka waktu beberapa injection ( "infus semu") dengan menerapkan rendah flow tingkat (0,3
mL / menit). Dengan demikian, analit terelusi perlahan tapi terus menerus dari waktu ke waktu
dalam bentuk puncak diperluas cocok untuk prosedur optimasi. Persyaratan teknis
memungkinkan spesifik waktu dan penerapan tarif ow fl berbeda dikelola oleh perangkat lunak
antarmuka LabVIEW yang melakukan komunikasi dua arah ("jabat tangan") antara HT-
autosampler dan spektrometer massa. Sehubungan dengan urutan hierarki dari komponen sistem,
perangkat lunak LabVIEW adalah software utama untuk seluruh sistem dan merupakan kunci
untuk komunikasi dan waktu antara perangkat analitis dan akhirnya faktor yang menentukan
untuk tingkat dicapai otomatisasi dan kecepatan.
2.5.1 Kerja pengujian
Meningkatkan throughput dalam analisis sampel tidak hanya membutuhkan instrumentasi
analitis kecepatan tinggi tetapi juga bersamaan dengan pekerjaan flow optimasi untuk mencapai
informasi kompatibel flow. Oleh karena itu sangat diperlukan untuk mengintegrasikan sistem
analisis tinggi-throughput dijelaskan dalam seluruh proses. Dalam banyak perusahaan farmasi,
penyelidikan ADME dan data ADME disediakan oleh unit layanan pusat untuk proyek-proyek
penelitian yang berbeda. persiapan sampel laboratorium pusat menghasilkan berbagai jenis
sampel ADME yang kemudian dipindahkan ke unit analisis MS pusat. Unit persiapan sampel
sentral melakukan jenis yang diinginkan dari ADME assay dan transfer barcode piring sampel
berlabel serta fi le informasi per piring ke unit analitis. Rincian proses ow dioptimalkan seluruh
pekerjaan fl akan dijelaskan di tempat lain memperoleh gambaran dari daerah puncak dari
seluruh percobaan stabilitas metabolik untuk satu senyawa. Selanjutnya, data yang diolah
ditransfer ke database SQL. SQL Database berfungsi sebagai lapisan pengambilan untuk mesin
perangkat lunak analisis data dan hasil perhitungan (Assay Explorer), akhirnya memberikan
parameter ADME seperti setengah-Lifes dan upscaled dalam parameter vitro-in vivo, seperti
Ance jelas-dan persen darah hati fl ow. Data yang dihitung adalah akhirnya dilaporkan ke
database global yang memungkinkan para ilmuwan untuk mengeksekusi query dan merakit
hubungan aktivitas struktur (SAR). Dengan demikian, tion integra dari RIAS ke seluruh
informasi aliran penemuan obat menghindari kesalahan-rawan transaksi manual informasi
memakan waktu dan. Di samping evaluasi data, intervensi manual dalam seluruh proses dibatasi
untuk sampel makan, pelarut ulang isian dan pertukaran kartrid setelah ca. 2500 sampel suntikan
2.5.2. Otomatisasi dan kecepatan

Karena RIAS (cepat dan terintegrasi sistem analisis) didirikan untuk merupakan bagian
integral dari penemuan obat kerja fl ow ia mampu secara otomatis memanfaatkan informasi
dengan memindai barcode. Sebuah prasyarat untuk akses informasi adalah bahwa semua
informasi yang diperlukan disediakan pada jaringan komputasi. Ini masi mation terdiri misalnya,
jenis uji, nama senyawa dan spesifik konten c lainnya yang diperlukan sehubungan dengan
percobaan dan prosedur, dimiliki oleh semua alat tes robotika dari percobaan stabilitas metabolik
serta RIAS dan diterapkan sebagai pemicu untuk kegiatan sistem. Waktu yang diperlukan untuk
optimasi senyawa otomatis dari sistem spektrometri massa divalidasi biasanya berkisar sekitar
1,5 min / senyawa untuk MS dan MS / MS optimasi dan terutama independen dari jenis uji in
vitro. Dengan setup eksperimental RIAS disajikan di atas, kecepatan analisis sampel
diminimalkan untuk 8 s / sampel yang sama dengan throughput 450 sampel per jam. faktor teknis
mengurangi sampel ke waktu siklus sampel adalah mikro dioptimalkan fl sistem uidic termasuk
katup rotary cepat beralih dari RapidFireTM serta cepat bergerak x- / y-tray. Sangat penting
adalah ment abandon- dari kromatografi konvensional, yang telah dikurangi menjadi HT-mode
pengolahan data. Khas pengolahan data pandangan HT-MS sistem / MS dalam mode high-
throughput. Setelah puncak cepat ulasan data disimpan dalam database untuk pencarian
berikutnya ke dalam perangkat lunak analisis data untuk perhitungan lebih lanjut. Dalam contoh
ini buspirone dimetabolisme dari mikrosom hati manusia (atas MRM transisi). Dalam transisi
MRM rendah puncak dari pertama dan fi internal standar nal menunjukkan suntikan matriks
kosong memfasilitasi selektivitas dan akumulasi cek. Penerapan langkah gradien sederhana pada
cartridge ekstraksi fase padat sebagai satu-satunya pemurnian langkah. Pada awal penemuan obat
kuantisasi NCES (entitas kimia baru) harus dilakukan sebagian besar tanpa standar nal stabil
berlabel internasional (IS) karena memakan waktu dan karena itu sintesis biaya-intensif. Namun
demikian penggunaan utama dari standar internasional nal menguntungkan dan dianjurkan untuk
menyeimbangkan variabilitas dalam proses analisis. Oleh karena itu standar internal generik
merupakan kompromi yang memungkinkan koreksi gangguan dari matriks bahkan jika IS secara
struktural berbeda. Aplikasi ini IS digunakan dalam kedua metode, konvensional LC-MS / MS
dan RIAS. Penerapan metode gradien HPLC konvensional biasanya menyebabkan waktu retensi
yang berbeda dari analit dan IS. Dengan demikian, komponen matriks yang co-mengelusi dengan
analit atau IS mungkin berbeda dan dapat mengganggu berbeda dengan proses ionisasi analit
atau IS. Menerapkan RIAS, langkah gradien secara simultan mengelusi baik analit dan IS dari
kolom dengan komponen matriks yang sama. Akibatnya, potensi efek pendinginan dalam proses
ionisasi MS mempengaruhi baik, analit dan standar internal dengan cara yang sama.
2.5.3. Pengolahan data

Pengolahan data dilakukan dalam mode high-throughput yang memfasilitasi review

puncak dan mengurangi jumlah data yang fi les karena semua sampel dari sebuah serial assay
termasuk dalam satu file [12,14,18]. Untuk mencapai alokasi puncak akurat serta puncaknya
tepat integra tion waktu switching valve 2 (Gambar. 1C) dari HT-autosampler dipantau dan
secara otomatis ditambahkan ke data mentah MS fi le selama review puncak di QuickCalc
(Gambar. 2) . Diproses MS data mentah yang disimpan dalam database dan dapat diambil dari
software ysis data yang anal-. Ara. 2 menggambarkan contoh ulasan puncak khas dalam mode
high-throughput sampel dari uji stabilitas metabolik. MRM transisi pada panel atas
menggambarkan ana Lyte jejak, MRM transisi di panel bawah jejak standar internal. Sampling
senyawa dari akhir waktu-poin dari uji stabilitas metabolik disuntik pertama yaitu, urutan
analisis diatur dari berpotensi rendah ke konsentrasi analit tinggi, yang meminimalkan sampel ke
sampel membawa-efek dan dengan demikian kesalahan dalam kuantisasi dan setengah-Lifes.
2.5.4. Carry-over dan sensitivitas
Setelah pekerjaan terpisahkan fl ow dari RIAS telah ditetapkan persyaratan utama untuk sistem
analitis yang minimal carry-over efek dan sensitivitas maksimal. Dalam rangka mini sampel
mize carry-over pipa dari sistem injeksi yang cepat adalah fl ushed dengan pelarut organik
setelah setiap injeksi sampel ditunjukkan pada Gambar. 1C). Selanjutnya satu berair dan satu
injeksi metanol dari stasiun mencuci terpadu dijalankan antara sampel, untuk membersihkan
jarum menghirup dari dalam dan dari luar. Contoh pada Gambar. 3 menunjukkan perwakilan
carry-over Arah 3. Investigasi carry-over dan tingkat signal-to-noise. seri injeksi 3 × metanol dan
3 × matriks kosong dari percobaan stabilitas metabolik (mikrosom hati manusia), diikuti oleh 6 ×
solusi koktail midazolam dan verapamil berduri ke dalam matriks kosong yang disebutkan di
atas (300 nM conc. masing-masing) dan lagi 3 × matriks kosong dan 3 × metanol untuk
menunjukkan rendah carry-over dan sensitivitas tinggi dari sistem. sinyal MRM dalam jangka
waktu 0,2-1 menit yang penguat ed dengan faktor 100 untuk menunjukkan tinggi signal-to-noise
tingkat (3 × 105: 1 untuk midazolam dan 2 × 104: 1 untuk verapamil). Carry-over untuk kedua
analit adalah 0,2% dan CV daerah puncak untuk 6 suntikan adalah 2% untuk midazolam dan 3%
untuk verapamil masing-masing dan karakteristik signal-to-noise dari sistem. Oleh karena itu,
ekor cock- dari dua fase klasik Aku metabolisme substrat, midazolam dan verapamil (300 nM
masing-masing) dalam matriks dari stabilitas assay metabolik dengan mikrosom hati manusia
disiapkan. Sebuah urutan tiga metanol dan tiga suntikan matriks kosong diikuti oleh enam
suntikan analit, midazolam dan verapamil, lagi follow melenguh oleh tiga suntikan matriks
kosong. Hampir tidak ada carry-over sinyal (0,2% untuk kedua, midazolam dan verapamil)
diamati dan tingkat tinggi signal-to-noise (3 × 105: 1 untuk midazolam dan 2 × 104: 1 untuk
verapamil) dapat diperoleh seperti yang digambarkan di Ara. 3 oleh amplify- ing dasar di
wilayah suntikan matriks kosong dengan faktor 100.

3.5. Reproduktifitas

Reproduktifitas merupakan prasyarat penting yang lebih jauh untuk bekerja kuantitas
produk dan telah ditangani pada tahap awal dari validasi dari sistem. Sistem RapidFire pada
umumnya sensitif terhadap sampel yang mengandung partikel-partikel yang dapat menyebabkan
penyumbatan mikro fl uidic fl ow-jalan [25]. Untuk mencegah penyumbatan semua piring
sampel disentrifugasi sebelum analisis. Sebuah tes kesesuaian sistem umumnya dilakukan
sebelum memulai analisis sampel dan memeriksa sistem mengenai reproduksi, bentuk puncak
dan sensitivitas. Akibatnya, reproduktifitas sistem ditemukan sebanding dengan sistem LC-MS /
MS konvensional. Ini adalah exempli- fi ed oleh pada Gambar. 3 dimana matriks incubations
protein-endapan dari stabilitas assay metabolik dengan mikrosom hati manusia telah dibubuhi
dengan larutan midazolam dan verapamil (masing-masing 300 nM) dan disuntikkan enam kali.
The koefisien variasi (CV) adalah 2% untuk midazolam dan 3% untuk verapamil, masing-
masing con fi rming reproduksi yang sangat baik untuk analisis LC-MS / MS pada umumnya.

2.5.6. Aplikasi untuk analisis stabilitas metabolik

The RIAS, disesuaikan dan divalidasi sesuai dengan kriteria tersebut di atas, telah diuji
dengan cara yang sepenuhnya otomatis, yang meliputi optimasi senyawa (tala piring) dan
pengukuran sampel (sampel piring) untuk percobaan stabilitas metabolik. Setup dari sistem ini
memungkinkan pengolahan tanpa pengawasan dari piring yang disediakan 96- baik. Hasil dari
48 tes stabilitas metabolik menggunakan mikrosom hati manusia pengujian satu set delapan
senyawa referensi mampu memanfaatkan- komersial yang digambarkan dalam Gambar. 4.
Korelasi setengah Lifes (t1 / 2) dari LC-MS / MS pendekatan divalidasi (x-axis) dan setengah-
Lifes dari RIAS baru disesuaikan (y-axis) dengan senyawa referensi yang disebutkan di atas
ditampilkan sangat baik korelasi dengan korelasi koefisien (r2) dari 0.982. Senyawa referensi
yang dipilih mewakili obat tinggi, menengah dan rendah-izin dan prevalently digunakan untuk
mengkarakterisasi aktivitas enzimatik metabolisme enzim fase I obat, seperti isoenzim sitokrom
P450 (CYP450). Buspirone dan verapamil sangat dibersihkan oleh N-dealkilasi dari CYP450
3A4 sementara zolam mida- cepat hidroksilasi. Alprenolol dan diklofenak merupakan obat cukai
yang tinggi juga mendasari hidroksilasi oleh CYP450 2D6 (alprenolol) dan CYP450 2C9
(diklofenak). Dekstrometorfan dan diltiazem menjalani dealkilasi moderat oleh CYP450 2D6
dan 3A4 sementara diazepam, obat izin rendah, secara perlahan hydroxylated dan dealkylated
oleh CYP450 2C19 dan 3A4. The mikrosomal stabilitas assay serta analisis spektrometri massa
dilakukan pada hari yang sama (n = 2) dan diulang pada 3 hari berturut-turut (Total n = 6) untuk
masing-masing senyawa referensi. Penerapan kehidupan nyata ditunjukkan dengan set
diperpanjang 470 percobaan stabilitas metabolik pada berbagai spesies hewan. 167 senyawa
yang berbeda, senyawa referensi serta senyawa penelitian proprietary dengan berbagai massa
molekul dari Ara. 4. Korelasi setengah Lifes dari 8 senyawa model dalam mikrosom hati
manusia. Korelasi setengah Lifes (t1 / 2) berasal dari LC-MS / MS sistem divalidasi (x-axis) dan
HT-MS / MS (y-axis) sistem "RIAS". Data diperoleh dari tes stabilitas metabolik yang
dilaksanakan pada 3 hari berturut-turut (n = 2) untuk setiap analit. 250-700 Da ditampilkan
berbagai lipophilicity (menyumbat P) antara -0,7 dan 9, yang merupakan perwakilan untuk
program penemuan obat awal. Sejak MS optimasi senyawa dalam RIAS dilakukan dengan cara
yang sepenuhnya otomatis operator tidak memerlukan pengetahuan apriori dari karakteristik
senyawa seperti rumus tahi lalat atau informasi struktural. Alat tes dan percobaan spektrometri
massa telah dilakukan di bawah kondisi penelitian kehidupan nyata, yaitu, sampel menjalani
beberapa freeze dan thaw siklus. Selain itu, pengukuran sampel di divalidasi LC-MS / MS assay
dan para RIAS tidak selalu dilakukan pada hari yang sama. Ara. 5 menunjukkan korelasi yang
tinggi (r2 = 0,828) setengah-Lifes (t1 / 2) antara divalidasi pendekatan LC-MS / MS (x-axis) dan
RIAS (y-axis). Karena batas-batas eksperimen biologi yang terakhir titik waktu sampling
(pengambilan sampel dari stabilitas assay metabolisme senyawa penelitian) diambil pada 45
menit dan ekstrapolasi dengan faktor dua (= 90 menit) dianggap diterima selain di fl uencing
varian tertentu dari setengah lifes (t1 / 2). Pada Gambar. 5 biru memanjakan garis
mengindikasikan perbatasan 90 menit dan senyawa luar garis ini dianggap bersifat stabil.
degradasi sampel dari beberapa beku dan mencair siklus sehubungan dengan karakteristik
stabilitas diketahui senyawa penelitian dianggap sebagai kemungkinan alasan untuk outlier.
Selama proses analisis data bahkan penyimpangan kecil dalam plot regresi dari tes waktu-poin
menyebabkan perbedaan besar dalam setengah Lifes (t1 / 2) dan karena itu menyebabkan
penyebaran khas dalam hubungan petak korelasi untuk setengah-Lifes atas 90 min . Sejak outlier
yang ditemukan untuk senyawa diukur dengan divalidasi LC-MS / MS dan oleh RIAS suatu
kesetaraan kedua metode berkaitan dengan keandalan setengah Lifes diasumsikan.
Proses analisis seluruh (optimasi senyawa MS dan pengukuran sampel) untuk 470
percobaan berlangsung 120 jam pada Ara. 5. Korelasi setengah Lifes dari 167 senyawa dari 470
percobaan stabilitas metabolik. Korelasi paruh (t1 / 2) berasal dari divalidasi LC-MS / MS (x
axis) sistem dan RIAS (y-axis). Semua data diperoleh setelah optimasi senyawa sepenuhnya
otomatis dengan sistem baru. Sampel dari spesies yang berbeda berasal dari 470 percobaan
stabilitas metabolik dengan 167 senyawa dalam spesies yang berbeda. waktu siklus dari sampel
ke sampel adalah 8 s didasarkan pada teknologi RapidFire dibandingkan dengan 1 menit dengan
pendekatan divalida. Sistem tanggal tetapi hanya 12 jam di RIAS - sesuai dengan 2.338 suntikan
cepat (3 s masing-masing) untuk MS tuning dan 4700 suntikan (8 s masing-masing) untuk
pengukuran sampel. Dengan mempercepat faktor dari 10 sekaligus menjaga kualitas data untuk
senyawa referensi serta untuk satu set perwakilan dari senyawa penelitian, kita
mempertimbangkan RIAS sebagai sebuah sistem yang unggul dalam menghasilkan data dari tes
stabilitas metabolik dibandingkan dengan LC- sebelumnya diterapkan divalidasi MS / MS.
3.7. Keterbatasan dan arah masa depan

Setup HT-autosampler dan spektrometer massa, dikontrol oleh solusi perangkat lunak
yang disesuaikan, menyediakan dioptimalkan kecepatan pengukuran sampel dan dengan
demikian generasi data metabolik tes bility station. Keterbatasan saat ini untuk lebih
meningkatkan sampling rate adalah kecepatan scan spektrometer massa. sinyal analit yang
berasal dari RIAS biasanya menunjukkan puncak lebar pada awal dari 2 s. Dengan asumsi bahwa
10 titik data yang diperlukan untuk menggambarkan puncak dengan presisi yang memadai,
puncak lebar sempit menyiratkan trade-off antara kecepatan scan dari spektrometer massa dan
jumlah titik data dari transisi MRM. Selain itu, kecepatan tinggi baru membuat tuntutan pada
kapasitas komponen sistem. Sebuah throughput 450 sampel / h diekstrapolasi ke 24 h sama
throughput teoritis 10.800 sampel per hari. Namun, dalam aplikasi kami solid-fase cartridge
ekstraksi dari sistem habis sudah setelah 2500 suntikan. Hal ini membutuhkan pertukaran
cartridge panduan kira-kira setiap 4 jam. Terbaru teknis modifikasi dari sistem RapidFireTM
telah membahas masalah ini dengan menerapkan perangkat pertukaran cartridge otomatis.
Selanjutnya, potensi lebih lanjut untuk mengurangi sampel untuk sampel waktu dapat dicapai
jika spektrometer massa kecepatan scan dapat dikurangi. Dalam kontribusi ini, kecepatan dan
ketahanan dari RIAS (cepat dan terintegrasi sistem analisis) telah berhasil dis- ditunjukkan
menggunakan eksperimen stabilitas metabolik sebagai contoh. Ini masih harus dilihat apakah tes
lainnya, misalnya, in vitro permeabilitas seperti Penambahan Kalsium Karbonat-2 dan PAMPA
bisa dipercepat sama, sehingga mengintegrasikan RIAS dalam proses ADME lainnya. Saat ini,
penggunaan ini HT-MS / MS di bioanalytics dari farmakokinetik dan toxicokinetic sampel harus
dipertimbangkan secara kritis. Karena tem didasarkan pada gradien langkah dengan elusi
bersamaan semua senyawa yang diserap, di-sumber fragmentasi metabolit (misalnya,
glucuronides) untuk senyawa induk dapat menyebabkan lebih tinggi, konsentrasi senyawa induk
palsu yang lebih tinggi. Meskipun sistem belum dievaluasi untuk metabolit fase II atau dalam
sampel vivo, maju MS pra teknologi fi lter [35-39] dapat memperpanjang daerah kation appli
dari RIAS untuk phase I dan tahap II sampel metabolit.
 BAB III
PENUTUP

3.1 KESIMPULAN
Dalam penelitian ini metode LC-MS/MS yang sederhana dan akurat akan menentukan 10
analit pestisida yang dipilih dalam kacang kedelai yang telah dikembangkan dan divalidasi.
Sebuah langkah pembersihan menggunakan Florisil dalam hubungannya dengan C18 dan PSA
terbukti efisien untuk meminimalkan efek matriks, dan penerapan spektrometri massa cairan
isotop memungkinkan kuantifikasi yang akurat. Validasi yang penuh dilakukan sesuai dengan
standar ISO/IEC 17025 dan pedoman DG SANCO, menunjukkan pemulihan yang sangat baik
(86-103%) dan presisi (U < 10,4%). Hasil ini mengkonfirmasikan bahwa kesesuaian metode
yang akan diterapkan untuk penilaian homogenitas dan stabilitas selama penelitian karakterisasi
yang diperlukan dalam pengembangan bahan referensi yang bersertifikat.