REVIEW JURNAL ANALISIS INSTRUMEN

OPTIMASI METODE ANALISIS PIRAZINAMID DAN ETAMBUTOL

DALAM SEDIAAN FIXED DOSE COMBINATION (FDC) PADA DRIED
BLOOD SPOT (DBS) MENGGUNAKAN LIQUID
CHROMATOGRAPHYTANDEM
MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS)

KELOMPOK :7
ANGGOTA : 1. ELI WAHYUNI 22164959A
2. MELISA NATALIA 22164969A
3. ANISA NUR ROHMAH 22164958A
4. ASSYIFA ADELIA FRIHANI 22164973A

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA
2017

1
 I. ALAT DAN BAHAN
a. Alat
UPLC-MS/MS Waters, USA instrument meliputi Ultra Performance Liquid
Chromatography (UPLC), kolom tipe Acquity UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm x
50 mm), UPLC– Quaternary Solvent Manager (QSM), UPLC-Flow Through Needle
(FTN), dan XEVOtandem Quadrupole Detector (TQD). Kertas DBS tipe FTA
DMPK-C (Whatman), disposable membrane filter unit ukuran 0,20 μm (Toyo Roshi
Kaisha, Ltd, Japan), degasser (Branson,USA), neraca (AND), mikropipet (Scorex)
dan alat-alat gelas.

b. Bahan
 Darah manusia sehat (whole blood) (Palang Merah Indonesia (PMI) Yogyakarta)
 Isoniazid (INH, Beijing Second Pharma, India)
 Rifampisin (RIF, Lupin Ltd., India)
 Pirazinamid (PZA, Lupin Ltd., India)
 Etambutol (EMB, Lupin Ltd., India)
 Hypergrade acetronitrile : pro LC-MS (Merck), hypergrade metanol pro LC-MS
(Merck), formic acid pro analysis (Merck), deionization water pro LC-MS
(Merck).

II. METODE
 Persiapan fase gerak.
Masing-masing fase gerak disaring dengan penyaring vakum
kemudian gas dihilangkan dengan degasser selama 15 menit.
 .Pembuatan larutan optimasi (simultan).
Timbang INH, RIF, PZA dan EMB masing-masing lebih kurang
10 mg dan larutkan keempat analit dengan metanol hingga didapat

2
 konsentrasi akhir campuran 1 mg/mL. Simpan pada suhu minus 60ºC
hingga saat digunakan.

 Preparasi larutan optimasi pada DBS.

Pipet 50 μL larutan optimasi ke dalam microtube yang sudah berisi
450 μL whole blood, homogenkan microtube dengan bantuan vortex
selama 20 detik dengan kecepatan maksimal. Sebanyak 50 μl diteteskan
pada plate kertas DBS dan keringkan pada suhu 37ºC selama 1 jam. DBS
kemudian dipotong dan potongan kemudian dimasukan ke dalam 500 μL
metanol. Campuran divortex 3 menit dan disonifikasi 60 menit. Larutan
hasil sonifikasi disaring menggunakan syringe filter ukuran 0,20 μm,
masukan ke dalam tempat sampel dan siap diinjeksikan.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

 Kondisi MS
Proses optimasi diawali dengan tuning untuk mendapatkan kondisi sistem
yang sesuai meliputi : suhu kolom 35ºC, suhu autosampler 4ºC, kecepatan alir 0,2
mL/menit. Electrospray ionization (ESI) diatur pada model positif (ES+) dengan
nitrogen sebagai nebulizer. Turbo gas diatur pada suhu 500ºC dan tegangan jarum
ESI pada 5500V. Kuantifikasi analit menggunakan multiple reaction monitoring
(MRM, MS/MS).
Setelah diatur dalam kondisi awal tersebut, maka dilakukan analisis
transisi untuk melihat pola fragmentasinya. Transisi pada PZA dan EMB
menghasilkan fragmen parent dan daughter seperti yang tercantum pada tabel di
bawah.

Transisi dan Model Ionisasi pada Optimasi Metode Analisis Pirazinamid dan Etambutol
secara Simultan dalam Dried Blood Spot (DBS) Menggunakan LC-MS/MS
Analit Transisi (m/z) Ion Mode

3
Pirazinamid 123,9 80,9 ES +
Etambutol 9205,01 115,91 ES +

 Preparasi dan ekstraksi analit pada DBS

Preparasi dan ekstraksi DBS merupakan titik kritis untuk mendapatkan
keakuratan hasil analisis. Penggunaan kertas DBS jenis FTA DMPK-C berfungsi
untuk menghindari pengaruh senyawa kimia pada kertas yang dapat mengganggu
analisis.

 Optimasi fase gerak

Ketepatan komposisi fase gerak akan memberikan pemisahan yang
optimal, respon analit yang tinggi dan bentuk puncak yang baik.

Komposisi fase gerak dengan teknik elusi isokratik dan hasil pemisahan
Komposisi fase gerak Hasil

Air : Metanol (50:50) tidak memisah

Air : Asetonitril (50:50) tidak memisah

Asam format 0,1% : asetonitril - asam format resolusi dan tailing factor belum memenuhi
0,1 % (50:50) syarat

Hasil pemisahan dengan elusi isokratik kemudian dikembangkan menjadi elusi gradient
untuk menyempurnakan pemisahan. Terdapat 3 komposisi gradien yang diujicobakan

Komposisi fase gerak dengan teknik elusi gradient

Komposisi Menit ke- Komposisi fase gerak A:B Analit

4
 0-1 50:50
Gradien I 1-3 60:40 Tidak memisah
3-5 80:20

0-0,5 60:40
Gradien II 0,5-1 50:50 Memisah
2-5 20:80

0-1 40:60
Gradien III 1-3 50:50 Tidak memisah
3-5 30:70

Komposisi nomor 2 pada teknik elusi gradien menunjukan kromatogram dengan

pemisahan yang baik.

Profil kromatogram hasil Optimasi Metode Analisis Pirazinamid dan Etambutol dalam
Sediaan Fixed Dose Combination (FDC) pada Dried Blood Spot (DBS) menggunakan Liquid
Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS); Puncak A dan D pengotor,
Puncak B = etambutol; Puncak C=pirazinamid.

Setelah didapat kromatogram yang baik, dilanjutkan dengan menghitung parameter

resolusi dan tailing factor.
5
 Waktu rambat (tR), Resolusi (R) dan tailing factor (TF) dari komposisi fase gerak
terpilih
Parameter PZA EMB Syarat

Waktu tambat (menit) 0,77 0,61 -

Resolusi (R) 62,85 2,09* dan 2,46** >2

Tailing factor (TF) 0,82 0,78 ≤2

Ket : *=terhadap puncak sebelah kiri (puncak A); **=terhadap puncak sebelah kanan (puncak
B); PZA=Pirazinamid; EMB=Etambutol

IV. KESIMPULAN
Penelitian ini berhasil mendapatkan kondisi instrumen dan fase gerak yang
optimal.

6
7