REVIEW

ISOLASI PREPARATIF DAN PEMURNIAN DUA ISOMER BARU ALKALOID

DITERPENOID DARI ACONITUM COREANUM OLEH KROMATOGRAFI ARUS
BERLAWANAN KECEPATAN TINGGI
Nabilla Qurrota A’yunin 19820001
Matakuliah Analisis Fitokimia Program Magister Biologi
Pascasarjana Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang

PENDAHULUAN
Akar Aconitum coreanum telah banyak digunakan untuk mengobati berbagai jenis
kelainan seperti kardialgia, distorsi wajah, epilepsi, migrain/sakit kepala, vertigo, tetanus,
kejang infantil, dan rematik arthralgia. Penelitian farmakologis dan praktik klinis
menunjukkan bahwa ekstraknya memiliki anti-arrhythmia, analgesik, dan efek anti-inflamasi.
Komponen aktif utama diisolasi dari ramuan ini adalah alkaloid diterpenoid dan banyak dari
mereka senyawa homolog (struktur kimia ditunjukkan pada Gambar. 1), dengan demikian
pemisahan dan pemurnian mereka adalah pekerjaan yang sulit tetapi sangat diperlukan untuk
mempelajari hubungan struktur dan aktivitas senyawa ini.

Gambar 1. Struktur kimia alkaloid diterpenoid

Kromatografi kontra-arus berkecepatan tinggi sebagai kromatografi partisi cair-cair

yang bebas telah banyak digunakan dalam pemisahan preparatif produk alami. Itu pemisahan
dan pemurnian alkaloid diterpenoid dari ekstrak A. coreanum menggunakan HSCCC telah
dilaporkan sebelumnya. Ini adalah laporan pertama dari dua isomer diterpenoid baru alkaloid
berhasil dipisahkan oleh arus balik berkecepatan tinggi kromatografi, HSCCC yang efisien
ditambah dengan metode ELSD berhasil dibuat dengan mengoptimalkan pelarut dua fase
sistem untuk memisahkan dan memurnikan dua isomer alkaloid yang diterpenoid.
METODE PENELITIAN
1. Alat
Instrumen HSCCC yang digunakan dalam penelitian ini adalah TBE-300A
kromatografi arus berlawanan kecepatan tinggi (Tauto Biotechnique, Shanghai, Cina) dengan
tiga kolom pemisahan kumparan multi-lapisan yang terhubung secara seri (I.D. dari tubing =
1,6 mm, total volume = 260 ml) dan loop sampel 20 ml.
Radius putaran adalah 5 cm, dan nilai coil dari kumparan multilayer bervariasi dari 0,5
di terminal internal hingga 0,8 di eksternal terminal. Kecepatan revolusi peralatan dapat diatur
dengan pengontrol kecepatan di kisaran antara 0 dan 1000 rpm. Alat sirkulasi suhu konstan
HX 1050 (Beijing Instrumen Laboratorium Boyikang, Beijing, Cina) digunakan untuk
mengendalikan suhu pemisahan. Shimadzu LC-8A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Jepang)
digunakan untuk memompa sistem pelarut dua fase. Flow-splitter (rasio split = 3: 1; 3 untuk
kolektor dan 1 untuk ELSD) adalah digunakan untuk menghubungkan ke deteksi hamburan
cahaya menguapkan. Alltech 500 ELSD (Alltech Associates, Deerfield, IL, USA) digunakan
untuk memantau efluen. Data dikumpulkan dengan Sepu 3000 workstation kromatografi
(Peralatan Sains Hangzhou Puhui, Hangzhou, Cina).
Peralatan HPLC yang digunakan adalah sistem Agilent 1100 (Agilent Teknologi, Palo
Alto, CA, USA) termasuk QuatPump G1311A, a G1315B UV-vis detektor fotodioda,
G1313A Auto-sampler, sebuah degasser dan workstation HPLC Agilent G1332A.
Spektrum massa direkam pada Aglient 1100 electrospray spektrometer massa ionisasi-
waktu ketakutan (ESI-TOF).
Spektrometer resonansi magnetik nuklir (NMR) yang digunakan di sini adalah Bruker
AVANCE 500 (Bruker, Swiss).
2. Reagen dan bahan
Semua pelarut organik digunakan untuk persiapan ekstrak kasar dan Pemisahan
HSCCC memiliki tingkat analitik (Nanjing Chemical Reagent Corporation, Nanjing, Cina).
Asetonitril digunakan untuk HPLC adalah kelas kromatografi (Merck, Darmstadt, Jerman),
dan airnya adalah air suling. DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA,
USA) digunakan sebagai pelarut untuk NMR
penentuan.
A. coreanum disediakan oleh Pabrik Farmasi Mayinglong (Baicheng, Provinsi Jilin,
Cina) dan diidentifikasi oleh Profesor Weichun Wu (Universitas Farmasi Shenyang,
Shenyang, Cina).
3. Persiapan ekstrak kasar
A. coreanum digiling menjadi bubuk (sekitar 30 jerat) oleh disintegrator. Serbuk (10
kg) diekstraksi tiga kali dengan 95% etanol. Setelah konsentrasi dalam vakum, residu (120 g)
adalah dimurnikan dengan kolom resin berpori D101, dielusi dengan air suling, etanol 30%,
etanol 60%, dan etanol 95%. 60% fraksi etanol (10 g), yang mengandung senyawa target
adalah diuapkan di bawah tekanan rendah dan dikeringkan menjadi bubuk, bubuk disimpan
dalam lemari es (−2 ◦C) untuk HSCCC berikutnya pemisahan.
4. Pemilihan sistem pelarut dua fase
Sistem pelarut dua fase dipilih sesuai dengan koefisien partisi (K) dari setiap komponen
target. Nilai-K ditentukan oleh HPLC sebagai berikut: 10 mg ekstrak kasar ditambahkan ke
tabung reaksi, dimana 5 ml dari setiap fase dari dua fase sistem pelarut ditambahkan. Tabung
reaksi diguncang dengan keras beberapa menit. Kemudian fase atas dan bawah dianalisis oleh
HPLC. Koefisien partisi (K) dari semua komponen dalam sampel diperoleh dengan area
puncak yang diperoleh dari fase atas ke sana dari fase bawah.
5. Persiapan sistem pelarut dua fase dan larutan sampel
Dalam penelitian ini, sistem pelarut dua fase terdiri dari etil asetat – n-butanol-metanol
– 2% asam asetat (3.5: 1.5: 2: 4.5, v / v / v / v) digunakan untuk pemisahan HSCCC. Setiap
pelarut ditambahkan ke corong pemisah dan diimbangi secara menyeluruh pada suhu kamar.
Fase atas dan fase bawah dipisahkan dan degassed oleh mandi supersonik selama 30 menit
sesaat sebelum digunakan.
Larutan sampel untuk pemisahan HSCCC dibuat dengan melarutkan 1 g bubuk kering
dari fraksi etanol 60% dalam 10 ml fase atas dari sistem pelarut dua fase.
6. Prosedur pemisahan HSCCC
HSCCC dilakukan sebagai berikut: Kolom melingkar multi-lapisan pertama kali
sepenuhnya diisi dengan fase atas sebagai stasioner tahap. Fase gerak berair bawah kemudian
dipompa ke dalam ujung kepala inlet kolom pada laju aliran 2,0 ml / menit, sedangkan
aparatus dijalankan pada kecepatan revolusi 850 rpm. Setelah keseimbangan hidrodinamik
tercapai (sekitar setengah jam), seperti yang ditunjukkan oleh fase gerak yang jelas dielusi di
outlet ekor, 10 ml sampel larutan yang mengandung 1 g minyak mentah dimasukkan ke dalam
kolom melalui katup injeksi. Sepanjang percobaan, suhu pemisahan dikontrol pada 25 ◦C.
Limbah dari ekor ujung kolom diperkenalkan ke deteksi hamburan cahaya menguapkan
(ELSD) melalui aliran-splitter. Detektor itu dipanaskan selama 30 menit; gas nitrogen
diperkenalkan ke detektor pada 3,0 L min− 1 dan kromatogram segera direkam setelah injeksi
sampel. Setiap fraksi puncak dikumpulkan secara manual sesuai dengan kromatogram yang
diperoleh dan setiap koleksi diuapkan di bawah tekanan tereduksi dan dilarutkan dengan 0,2
M HCl untuk analisis kemurnian selanjutnya oleh HPLC.
7. Analisis dan identifikasi HPLC dari fraksi puncak HSCCC
Analisis HPLC dilakukan dengan fase terbalik Kolom Diamonsil C18 (250 mm × 4,6
mm I.D., 5 μm, Dikma Teknologi, Shanghai, Cina) pada suhu kamar. Fase seluler adalah (A)
2 mg / ml sodium 1-heptansulfonat (termasuk trietilamina 0,2% dan pH disesuaikan menjadi
3,0 dengan asam fosfat) dan (B) asetonitril dalam mode gradien sebagai berikut: 0-20 menit,
17-30% asetonitril; 20–40 menit, 30–35% asetonitril. Limbah dipantau pada 205 nm dan laju
aliran adalah 1,0 ml min− 1. Identifikasi struktural dari setiap fraksi puncak HSCCC dilakukan
oleh 1H NMR, 13C Data NMR dan 2D NMR.

HASIL DAN DISKUSI

1. Optimalisasi kondisi HSCCC
Fraksi etanol 60% A. coreanum dianalisis dengan HPLC (Gbr. 2), fase gerak HPLC
yang mengandung natrium 1-heptansulfonat, trietilamina, dan asam fosfat, yang bisa
menawarkan pemisahan yang baik, tidak cocok untuk pemurnian berikutnya, jadi kami lebih
suka menggunakan HSCCC untuk memisahkan senyawa 1 dan 2. Eksperimen HSCCC awal
dilakukan dengan sistem pelarut dua fase terdiri dari etil asetat-nbutanol-metanol-0,2 M HCl
(3,5: 1: 1: 3,5, v / v / v / v) sesuai dengan penelitian awal kami, hasil menunjukkan bahwa
sistem pelarut dua fase ini cocok untuk pemisahan alkaloid dari A. coreanum kecuali 1 dan 2.
Dalam studi selanjutnya, rasio volume pelarut organik dimodifikasi untuk menemukan yang
sesuai Nilai K dari senyawa 1 dan 2 untuk pemisahan HSCCC, tetapi K nilai senyawa 1 dan 2
sangat mirip dan sedikit berubah (Tabel 1). Akhirnya, bukannya HCl, asam asetat diuji dalam
komposisi sistem pelarut dua fase, dan nilai K komponen target didiskriminasi (Tabel 1).
Nilai K dari komponen target dalam sistem pelarut yang berbeda terdeteksi oleh HPLC dan
dirangkum dalam Tabel 1, itu menunjukkan bahwa ketika rasio volume asam asetat
meningkat, perbedaan antara nilai K dari senyawa 1 dan 2 diperbesar kemudian. Penambahan
asam asetat bukan HCl membuat dua fase sistem pelarut selektivitas yang baik untuk
memisahkan keduanya senyawa target. Ketika etil asetat-n-butanol-metanol-2% asam asetat
(3.5: 1.5: 2: 4.5, v / v / v / v) digunakan sebagai sistem pelarut dua fase, kedua senyawa
tersebut dapat memisahkan dengan benar dan total waktu percobaan juga dapat diterima (Gbr.
3). Pengaruh kecepatan revolusi, laju alir fase gerak, dan suhu pada resolusi puncak HSCCC
juga diselidiki, itu menunjukkan bahwa ketika laju alir adalah 2,0 ml min − 1, kecepatan
revolusi adalah 850 rpm, dan suhu pemisahan 25 ◦C, persentase retensi fase stasioner adalah
60%, hasil pemisahan adalah memuaskan.
Tabel.1 Nilai K dari komponen target dalam sistem pelarut yang berbeda terdeteksi oleh
HPLC

Gambar 2. Analisis HPLC dari fraksi etanol 60%. Kolom: kolom diamonsil C18 (250 mm ×
4,6 mm I.D., 5 m); fase geraknya adalah (A) 2 mg / ml natrium 1-heptansulfonat (termasuk
trietilamina 0,2% dan pH disesuaikan menjadi 3,0 dengan asam fosfat) dan (B) asetonitril
dalam mode gradien sebagai berikut: 0-20 menit, 17-30% asetonitril; 20-40 menit, 30–35%
asetonitril; deteksi: 205 nm; laju aliran: 1,0 ml min− 1.
Gambar 3. Kromatogram HSCCC dan hasil analisis HPLC dari fraksi puncak 1 dan 2. Sistem
pelarut: asam asetat etil asetat-n-butanol-metanol-2% (3,5: 1,5: 2: 4,5, v / v / v / v); fase gerak:
fase bawah; mode elution: head to tail; laju aliran: 2,0 ml / menit; ukuran sampel: 1,0 g;
volume injeksi: 10 ml; kecepatan putaran: 850 rpm; penyimpanan dari fase stasioner: 60%;
Kondisi HPLC sama seperti pada Gambar. 2

2. Optimalisasi kondisi ELSD

Karena penyerapan UV yang rendah dari alkaloid yang diterpenoid ini dan sistem
pelarut HSCCC mengandung agen terbatas UV semacam itu sebagai etil asetat, HSCCC-
ELSD dikembangkan untuk mendeteksi jenis ini senyawa dalam prosedur pemisahan kami.
Hasilnya menunjukkan itu teknologi yang ditulis dgn tanda penghubung ini adalah cara yang
mudah untuk mendeteksi senyawa yang tidak mudah menguap dalam pelarut terbatas UV
yang mudah menguap yang digunakan dalam HSCCC. Dalam pengalaman kami, kondisi
ELSD bisa terutama dioptimalkan dengan mengubah suhu tabung melayang, laju aliran gas,
dan rasio pemisahan splitter. Jadi pengaruh variabel-variabel ini terhadap efisiensi deteksi
dipelajari. Sinyal untuk rasio kebisingan senyawa 1 dan 2 dicapai dengan baik ketika suhu
tabung melayang diatur pada 110 ◦C, laju aliran gas nitrogen adalah 3,0 L min− 1, dan rasio
split ditetapkan pada 3: 1.
3. Identifikasi struktural
Struktur kimia dari puncak pada Gambar. 3 diidentifikasi oleh data HR-ESI-MS, 1H
NMR, 13C NMR, dan 2D NMR mereka.
Senyawa 1 dan 2 diperoleh sebagai bubuk tidak berwarna dan telah formula molekul
yang sama dengan C20H25NO4 yang disimpulkan dari ESI-MS ([M + H] + pada m / z
344.2). Dari 1H, 13C NMR, DEPT, HSQC, Data HMBC (Gbr. 4), dan NOESY, struktur 1
dan 2 ditetapkan sebagai 13-dehydro-1β, 2α, 6β -trihydroxyhetisine dan 13-dehydro-2α, 3β,
6β -trihydroxyhetisine.
Spektrum 13C NMR (DEPT) dari 1 dan 2 menunjukkan 20 sinyal dikaitkan dengan inti
diterpenoid C20, itu menunjukkan sinyal karakteristik karbon untuk satu kelompok metil sudut
(C18), satu ekstrim alkena (= CH2, C17), dan empat atom C kuartener (C4, C8, C10, C16).
Spektrum 1H NMR dari 1 dan 2 menunjukkan 25 sinyal proton, ini menunjukkan sinyal
karakteristik proton untuk satu Me (H – C18), satu C = CH2 (H – C17), satu CH (H – C20), dan
satu CH2 (H – C19) kelompok. Sinyal untuk N-methyl, MeO dan cincin aromatik tidak ada
yang menunjukkan bahwa ada tidak ada cincin oksazolidin dalam kerangka C20, dapat
disimpulkan bahwa mereka adalah C20 alkaloid hetisin.
Dalam spektrum HMBC 1, korelasi C10 (δC: 53.3) / H – C1 (δH: 3.28, 1H, d, ȷ = 3.0
Hz) dan C10 (δC: 53.3) / H – C20 (δH: 3.42, 1H, br. s), dan korelasi C4 (δC: 36.3) / H – C3 (ıH:
1.43, 1.68, 2H, m), C4 (δC: 36.3) / H – C19 (δH: 2.78, 2.94, 2H, m) dan C4 (δC: 36.3) / H – C18
(δH: 1.23, 3H, s) ditemukan. Itu memverifikasi itu kelompok OH terhubung ke C1. Dalam
spektrum HMBC 2, korelasi C10 (δC: 42.8) / H – C1 (δH: 1.17, 1.58, 2H, m) dan C10 (δC 42.8)
/ H – C20 (δH: 3.51, 1H, br. s), dan korelasi C4 (δC: 43.0) / H – C3 (δH: 3.48, 1H, m), C4 (δC:
43.0) / H – C19 (δH: 3.10, 3.38, 2H, d, J = 12.2 Hz) dan C4 (δC: 43.0) / H – C18 (δH: 1.50, 3H,
s), dapat sangat menyarankan bahwa C3 terhubung dengan grup OH. Itu perbedaan antara
spektrum HMBC mereka ditunjukkan pada Gambar. 4, konformasi dan kelompok lain yang
sesuai dikonfirmasi oleh 2D Analisis NMR

Gambar 4. Korelasi kunci HMBC dari senyawa 1 dan 2

KESIMPULAN
Metode HSCCC yang efisien dikembangkan untuk pemurnian dan pemisahan dua
alkaloid diterpenoid isomer baru dari A. coreanum. Dalam penelitian ini, penambahan asam
asetat sebagai gantinya HCl dapat mempengaruhi nilai koefisien partisi komponen target.
Ketika asam asetat etil asetat-n-butanol-metanol-2% (3.5: 1.5: 2: 4.5, v / v / v / v) digunakan
sebagai sistem pelarut dua fase, nilai K yang cocok dari dua senyawa isomer didapat
pemisahan HSCCC. Alkaloid yang diterpenoid sangat murni bisa diperoleh dari ekstrak kasar
dalam pemisahan satu langkah; 25,4 mg dari senyawa 1 (puncak 1 dikumpulkan selama 270-
350 menit) dan 18,3 mg dari senyawa 2 (puncak 2 dikumpulkan selama 370-465 menit)
dihasilkan dari 1 g ekstrak kasar. Kemurnian dua senyawa adalah 96,9% dan 95,7%
ditentukan oleh HPLC. Identifikasi struktural mereka adalah dilakukan oleh analisis MS, 1H
NMR, 13C NMR, dan 2D NMR.