Separation and purification of astaxanthin

from Phaffia rhodozyma bypreparative high-

speed counter-current chromatography

Muhammad Taufik Mubarok SBF151810218

Nita Hastuti SBF151810220
Tika Indrasari SBF151810227
Pendahuluan
Sebuah kolom CCC kecepatan tinggi (HSCCC) digunakan
untuk preparatif isolasi dan pemurnian dari astaxanthin dari
Phaf fi rhodozyma a. Dengan sistem pelarut dua-tahap yang
terdiri dari n heksana-aseton-etanol-air (1: 1: 1: 1), ekstrak
mnetah 100 mg P. rhodozyma dipisahkan untuk
menghasilkan 20,6 mg astaxanthin di 92.0% kemurnian.
Dengan satu langkah kolom silika gel lanjut kromatografi,
kemurnian mencapai 99,0%. Struktur kimia dari
astaxanthin adalah confirmed oleh kromatografi lapis tipis
(TLC), UV spektroskopi scanning, kromatografi cair
kinerja tinggi dengan Zorbax SB-C 18 kolom dan Waters
Nova-pak C 18 kolom, dan ESI / MS / MS.
 Pengantar
Astaxanthin (3,3'- dihydroxy-.'- karoten-4,4 '-
dion) adalah antioksidan kuat yang dikaitkan
dengan penurunan intraseluler O2, produksi
memulihkan aktivitas jaringan antioksidan
superoksida dismutase (SOD) dan katalase (CAT),
yang memengaruhi HO-1 ekspresi dan Kegiatan
dengan menghambat translokasi nuklir Nrf2.
Astaxanthin baru-baru ini menarik perhatian
karena -nya farmakologi properti, termasuk
perlindungan UV-kerusakan. pelindung saraf, Anti-
peroksidasi lipid, Anti-peradangan, anti-
diabetesdan anti-kanker.
Alat
Analisis dengan Agilent liquid kromatografi,
Peralatan dengan auto injector, anonline vacuum
degasser, a G1311B/C quaternary pump, a
G1329Bauto-sampler, a G1330B thermostat, a
G1316B thermostatted column compartment
and a G1314F variable wavelength
detector(VWD). The Agilent 1260 ChemStation
soft-ware was used for the analysis of
astaxanthin in the crude extractof P. rhodozyma
and fractions collected from the HSCCC
Bahan
Methanol,
acetonitrileand tetrahydrofuran
astaxanthin standard substance (≥97%)
semua solven organik yang digunakan
untuk fraksi dan HSCCC
Persiapan crude ekstrak
• P.Rhodozyma JMU-MVP14 diinduksi dari P.rhodozyma 7B12
melalui etil metana diikuti oleh pemindaian dengan tenakan
selektif H2O2 dan P.rhodozyma JMU-MVP14 difermentasi.
• Ketika fermentasi selesai, kemudian disentrifugasi untuk
menghilangkan supernatan dan P.rhodozyma thalli dikumpulkan.
Thalli yang pecah ditambah DMSO 400mL pada suhu52 C
selama 10 menit dan diekstrak 2x dengan anhidrat alkohol.
• Fraksi DMSO diekstrak dengan petroleum eter untuk 2x. Fase
yang lebih rendah dikumpulkan dan dipartisi dengan CCC
menggunakan larutan NaCl dan etil asetat.
• Fase NaCl dikumpulkan dan terkonsentrasi di 32C dibawah
vakum dengan penguapan rotary untuk mendapatkan ekstrak
mentah
Pengukuran koefisien (K)
Pemisahan dari astaxanthin oleh HSCCC sebagian
besar tergantung pada pemilihan sistem pelarut dua
fase yang sesuai dengan koefisien partisi (0,5<k<2,0
mL)
2,0mL fase pra equilibrated pelarut dua fase dicampur
dengan 1mg ekstrak minyak mentah di tabung uji.
Kemudian dikocok keras dan di suhu kamar dua fase
pemisahan akan terlihat jelas.
Kedua fase dipisahkan, masing-masing ditambah
metanol. Fase terlarut diuji dengan HPLC dan
dianalisis pada 474nm untuk mendapatkan partisi
ficient dari astaxanthin
Persiapan dua fase solvent dan sampel
n-hexane-acetone-ethanol-air
(1:1:1:1)
digunakan untuk pemisahan HSCCC.
Solven ditambahkan ke sebuah funnel
terpisah pada suhu kamar.
Analisis HPLC
Fraksi ekstrak yang diperoleh dari
HSCCC dan kemurnian astaxanthin
dianalisis dengan HPLC dengan pelarut
air (fluida fase A) dan metanol (cairan
fase B). Analisis dilakukan dengan colom
pada laju alir 0,2mL/menit. Suhu 35C,
volume injeksi 5,0L dan panjang
gelombang 474nm.
Elusidasi struktur
Konfirmasi astaxanthin terisolasi dari HSCCC dilakukan
oleh TLC, HPLC, UV spektra dan ESI/MS/MS spektra.
Panjang gelombang UV adalah 190nm-1000nm.
Pendeteksi spektrometri MS dilakukan pada sebuah
agilent 6460
Sumber ESI diatur dalam mode ionisasi positif. Analisis
ESI dilakukan sebagai berikut : kondisi
◦ Temp.gas = 325C
◦ Aliran gas = 12L/menit
◦ Nebulizer = 35 psi
◦ Kapiler = 4000v
◦ Deteksi ms dilakukan pada kisaran 200-840
Hasil dan diskusi
1. Total crude ekstrak dari p.rhodozyma
dianalisis dengan tlc dan analisis hpc.
Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak
terdiri dari 4 senyawa termasuk
astaxanthin . Dengan menghitung jumlah
total ekstrak yang bisa dicapai dengan
nilai maksimum 965mg/100g thilli
dalam percobaan. Dan mayor senyawa
p.rhodozyma adalah astaxantipis.
2. Pemilihan dua fase pelarut

 Dapat memberikan hasil yang ideal

kisaran nilai K untuk senyawa target
yakni 0,5-2,0.
3. Pemisahan HSCCC preparatif
HSCCC menggunakan n-heksan – aseton – etanol – air
(1:1:1:1).
Hasil menunjukkan bahwa metode pemisahan menghasilkan
20,6mg astaxanthin pada kemurnian 92%. Dengan
ditambahkan silika gel kolom kromatografi bisa mencapai
99%.
Sun et al. Telah melaporkan bahwan kemurnian astaxanthin >
95% dengan silika gel kolom kromatografi dan rekristalisasi.
Zhang et al. Juga melaporkan bahwa kemurnian astaxanthin
mencapai 92% oleh kromatografi kolom poliamida
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kemurnian 99%
astaxanthin dipisahkan dari p.rhodozyma berdasarkan metode
HSCCC dan kolom silika gel kromatografi.
Konfirmasi struktur astaxanthin terisolasi
Diperoleh dari preparatif HSCCC dianalisis
dengan TLC.
Astaxanthin terisolasi diperoleh dari
eksperimen percobaan ini memiliki nilai RF
yang sama (RF=0,21) bentuk spot dan warna
dengan substansi standart astaxanthin .
Astaxanthin memiliki waktu retensi yang
sama dengan astaxanthin substansi standarrt
di bawah kondisi HPLC yang berbeda.
Kesimpulan
P.rhodozyma dapat menghasilkan kaya
astaxanthin yang mana zat bioaktif yang
penting.
Pemisahan astaxanthin dari p.rhodozyma oleh
metode klasik adalah memakan waktu dan
membutuhkan beberapa langkah kromatogram.
Astaxanthin di kemurnian 99% berhasil
dipisahkan dari ekstrak p.rhodozyma
menggunakan kombinasi HSCCC dan silika
gel kolom kromatografi.