LAPORAN PRAKTIKUM

ANALISA FARMASI

HPLC

DISUSUN OLEH :

IKHSAL MUKRI JUMADILA (1801019)

S1-4A

GRUP A

KELOMPOK 4 (EMPAT)

RABU, 10 JUNI 2020

NAMA DOSEN:
MELZI OCTAVIANI, M. Farm, Apt

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU

YAYASAN UNIV RIAU

2020
 PENETAPAN KADAR SAKARIN, ASAM BENZOAT, ASAM SORBAT, KOFEINA,
DAN ASPARTAM DI DALAM BEBERAPA MINUMAN RINGAN BERSODA SECARA
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. TUJUAN PRAKTIKUM
Memperoleh analisis optimum untuk penetapan kadar sakarin, aspartam, asam
benzoat, asam sorbat dan kofeina yang terdapat di dalam minuman ringan secara
KCKT fase terbalik.

II. TINJAUAN PUSTAKA

HPLC adalah salah satu metode kromatografi cair (liquid chromatography)
dengan menggunakan tekanan. Prinsip: “Pemisahan analit-analitberdasarkan
kepolarannya”, fase gerak= zat cair , Fase diam= kolom.
Kegunaan HPLC :
1. Untuk Menganalisis Sejumlah Senyawa Organik Yang Tidak Stabil
2. Untuk Menganalisis Senyawa dengan Berat Molekul Tinggi
3. Untuk Memastikan Kemurnian Suatu Senyawa
4. Untuk Keperluan Identifikasi dan Kuantifikasi

SKEMA ALAT HPLC

Instrumentasi HPLC :
1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut
Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi,
ex: Methanol for HPLC. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fase gerak
(harus inert), biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung.
2. Pompa
HPLC menggunakan pompa bertekanan tinggi untuk mengalirkan fase gerak
menuju kolom fase diam. Pompa yang digunakan dalam HPLC haruslah pompa
bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom
fase diam dan melewati detector
- Sistem pompa dapat mengatur secara otomatis perbandingan pencampuran pelarut
sehingga dihasilkan pencampuran yang baik.
- Sistem pompa juga mampu melakukan elusi isokratik dan elusi gradien.
- Elusi isokratik adalah elusi yang perbandingan komposisi fase geraknya konstan
selama pengukuran berlangsung
- Elusi gradien adalah elusi yang komposisi fase geraknya berubah-ubah selama
pengukuran berlangsung .
3. Injector
Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi
dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem
injeksi otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam
kisaran volume 0.1-100 µL.
4. Kolom dan Fase Diam

Kolom HPLC adalah bagian terdapat fase diam sbg tempat pemisahan komponen
sampel. Kemudian dihitung waktu retensi (tR) masing-masing komponennya oleh
detektor. Waktu retensi (Time Retention/tR) adalah waktu yang dibutuhkan oleh
senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju detektor. Senyawa yang
berbeda akan memiliki waktu yang berbeda sehingga masing-masing konsentrasinya
dapat dihitung. Fase diam biasanya adalah oktadesil silika (ODS) yang memiliki
lapisan C18.
5. Detektor

Berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang telah melewati kolom dan
memberikan sinyal elektronik pada pengolah data
 6. Pengolah Data
Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang terbaca oleh detektor
dalam bentuk kromatogram. Kromatogram menggambarkan jumlah komponen pada
sampel dilihat dari jumlah puncak (peak) yang dihasilkan.

III. Alat dan Bahan

Alat :
 KCKT yang terdiri dari pompa KCKT model LC-6A
 Detektor UV-VIS model SPD-6AV
 Rekorder dan integrator model C-R4A Chromatopac (Shimadzu)
 Kolom C-18 Latek (15 cm x 4,0 mm)
 Spektrofotometer UV-VIS 1601 (Shimadzu)
 pH meter (Jenway)
 Neraca analitik (Ohaus).
 Pengaduk ultrasonik (Branson 3200).
 Saringan filter eluen dan sampel 0,45 µm (Whatman).
 Alat-alat gelas.
Bahan :
 Bahan baku pembanding natrium sakarin (China)
 Natrium benzoat (F.Goodrich Kalama USA)
 Kalium sorbat (Japan),
 Kofeina (China)
 aspartam (Ajinomoto).
 Pelarut kimia metanol p.a
 Asam asetat glasial (e.Merck)
 Ammonium asetat (E.Merck)
 aAsetonitril p.a (E.Merck)
 Aquabides (Ikapharmindo)
 Sampel minuman ringan berkabonasi CC, DC, PC, DP dan CLC

IV. Prosedur kerja

1) Sampling minuman
 Proses sampling minuman ringan berkarbonasi dilakukan berdasarkan merek yang
beredar di pasaran (supermarket di daerah Jakarta dan Depok). Lima merek
minuman ringan berkabonasi dipilih untuk dijadikan sampel dalam penelitian ini.
Pemilihan sampel berdasarkan atas informasi kandungan bahan-bahan yang
ditambahkan ke dalam sampel tersebut.
2) Penetapan panjang gelombang pengukuran
a. Pembuatan larutan baku 10 ppm
Dibuat larutan standar dari masing-masing bahan baku pembanding dengan
kadar sakarin 9,64 ppm, asam benzoat 10,101 ppm, asam sorbat 10,05 ppm,
kofeina 10,01 ppm, dan aspartam 10,03 ppm menggunakan pelarut aquabides
yang telah disaring.
b. Penetapan panjang gelombang pengukuran
Masing-masing larutan bahan baku pembanding tersebut diukur serapannya
pada panjang gelombang 200-300 nm menggunakan spektrofotometer, lalu
dibuat kurva serapannya. Kemudian ditentukan panjang gelombang untuk
analisis.
3) Mencari kondisi percobaan optimum untuk analisis sakarin, asam benzoat,
asam sorbat, kofeina dan aspartam.
Larutan campuran bahan baku pembanding sakarin, asam benzoat, asam
sorbat, kofeina dan aspartam di dalam pelarut aquabides, disuntikkan sebanyak 20
µl ke dalam kolom menggunakan fase gerak campuran asetonitril dan dapar asetat
dengan berbagai komposisi yaitu:
a. 19:81, pH dapar 4 dan 4,5
b. 10:90, pH dapar 4 ; 4,5 ; dan 5
c. 5:95, pH dapar 4 ; 4,5 ; dan 5
Dipilih komposisi dan pH dapar yang memberikan pemisahan terbaik,
berdasarkan waktu tambat (tR), resolusi (R), HETP, dan jumlah pelat teori (N).
Kondisi terpilih harus digunakan pada analisis sampel.
4) Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif
Dibuat larutan bahan baku pembanding dalam aquabides yang telah dipasang
dengan konsentrasi sakarin dalam larutan sebesar 1,416 ppm; 0,689 ppm; 0,550
 ppm; 0,344 ppm; 0,2 ppm; dan 0,138 ppm, konsentrasi asam benzoat dalam
larutan sebesar 1,072 ppm; 0,852 ppm; 0,750 ppm; 0,536 ppm; 0,268 ppm; 0,206
ppm; dan 0,150 ppm, konsentrasi kofeina dalam larutan sebesar 1,076 ppm; 0,5
ppm; 0,452 ppm; 0,269 ppm; 0,142 ppm; dan 0,086 ppm, konsentrasi asam sorbat
dalam larutan sebesar 0,055 ppm; 0,027 ppm, 0,013 ppm, 0,0074 ppm; dan
0,0057 ppm dan konsentrasi aspartam dalam larutan sebesar 25,2 ppm; 20,64
ppm; 10,32 ppm; 6,5 ppm; dan 5,16 ppm.
Larutan bahan baku pembanding tersebut disuntikkan sebanyak 20 µl pada
kolom dengan kondisi analisis terpilih. Limit deteksi dan limit kuantitatif
ditentukan dengan membandingkan tinggi puncak zat dengan tinggi puncak derau.
Tinggi puncak derau adalah tinggi puncak terbesar yang dihasilkan oleh garis
dasar pelarut. Batas minimum limit deteksi adalah tinggi puncak zat 2 dan 3 kali
lebih tinggi dari tinggi puncak derau, sedangkan batas minimum limit kuantitatif
adalah tinggi puncak zat 10 kali lebih tinggi dari tinggi puncak derau.
5) Pembuatan kurva kalibrasi
Dibuat larutan sakarin dalam pelarut aquabides yang telah disaring dengan
konsentrasi 5,66 ppm; 11,32 ppm; 22,64 ppm; 45,28 ppm; dan 56,6 ppm lalu
disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam kolom menggunakan kondisi analisis
terpilih. Catat area yang diperoleh lalu dibuat kurva kalibrasinya. Prosedur di atas
diulangi untuk pembuatan kurva kalibrasi asam benzoat, asam sorbat, kofeina,
dan aspartam.
Untuk kurva kalibarsi asam benzoat, dibuat larutan aam benzoat dengan
konsentrasi 1,012 ppm; 5,06 ppm; 10,12 ppm; 20,24 ppm; 40,48 ppm; dan 60,72
ppm. Untuk kurva kalibrasi asam sorbat dibuat larutan asam sorbat dengan
konsentrasi 0,0509 ppm; 0,1018 ppm; 0,509 ppm; 1,018 ppm; 2,036 ppm; dan
3,054 ppm. Untuk kurva kalibrasi kofeina, dibuat larutan dengan konsentrasi 1,01
ppm; 5,05 ppm; 10,1 ppm; 20,2 ppm; dan 40,4 ppm. Sedangkan untuk kurva
kalibrasi aspartam, dibuat larutan aspartam dengan konsentrasi 30,24 ppm; 40,32
ppm; 50,4 ppm; 60,48 ppm; dan 100,8 ppm.
V. Hasil pengamatan
a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

b. Uji Limit deteksi dan limit kuantitatif

Kromatogram Campuran standar sakarin, asam benzoat, asam sorbat,

kofeina dan aspartam

Kromatogrm asam benzoat (1) dan kofeina (II)

Kromatogram sakarin (1), asam banzoate (II) dan kofein (IIII)

Kromatogram asambenzoat (1) dan kofein (II)

Kromatogram asam benzoate (II), kofein (II) dan aspartam (III)

Kromatogram kofeina (II) pada sampel

VI. PEMBAHASAN
HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu
alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam (yaitu
sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan
memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara
mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain
dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah gravitasi, didukung melalui
tekanan tinggi sampai dengan 400 atm.
Prinsip kerja dari HPLC adalah dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan
melalui kolom ke detector. Kemudian cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa
gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut
terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan
keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan
fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada
kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan
serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
HPLC terdiri dari dua fase yang pertama adalah fase diam/stasioner, pada fase ini
senyawa-senyawa polar dalam campuran yang melalui kolom akan melekat lebih
lama pada silica (diatome) yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar.
Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom,
yang kedua merupakan fase gerak. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran
 akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi
gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut
karena membutuhkan pemutusan ikatan hidrogen sebagaimana halnya senyawa-
senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh
karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan
bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan
bergerak lebih cepat melalui kolom.
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi
yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada:
1.       tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut)
2.       kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran partikel)
3.       komposisi yang tepat dari pelarut
4.       temperatur pada kolom
Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia
dari alat dalam suatu sampel, sedangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui jumlah
dan konsentrasi alat tersebut dalam sampel. Tentu saja informasi kualitatif diperlukan
sebelum dapat melakukan analisa kuantitatif. Proses separasi biasanya diperlukan
baik untuk analisa kualitatif atau analisa kuantitatif. Sebelum memulai pembuatan
metode analisa, perlu untuk mengetahui labih jauh tentang sifat-sifat sample, tujuan
analisa, berapa jumlah sample yang nantinya akan dianalisa dengan metode terkait,
serta perlu dilihat jenis instrument HPLC yang dimiliki.
HPLC ini menggunakan metode regresi linier. Regresi linier adalah metode
statistika yang digunakan untuk membentuk model hubungan antara variabel terikat
(dependen; respon; Y) dengan satu atau lebih variabel bebas (independen, prediktor,
X). Apabila banyaknya variabel bebas hanya ada satu, disebut sebagai regresi linier
sederhana, sedangkan apabila terdapat lebih dari 1 variabel bebas, disebut sebagai
regresi linier berganda.
Menurut Adnan (1997), HPLC memiliki beberapa keunggulan yaitu:
1.    HPLC dapat menangani senyawa-senyawa yang stabilitasnya terhadap suhu
terbatas, begitu juga volatilitasnya bila tanpa menggunakan derivatisasi.
2.    HPLC mampu memisahkan senyawa yang sangat serupa dengan resolusi yang
baik.
3.    Waktu pemisahan dengan HPLC biasanya singkat, sering hanya dalam waktu
5-10 menit, bahkan kadang-kadang kurang dari 5 menit untuk senyawa
sederhana.
4.    HPLC dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dengan baik dan dengan
presisi yang tinggi, dengan koefisien variasi dapat kurang dari 1%.
5.    HPLC juga merupakan teknik analisis yang peka.
Menurut Arindradita (2009), kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :
1.    Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu
2.   Hanya bisa digunakan untuk asam organik
3.   Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien
elusi
4.    Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas.
Komponen-komponen yang terdapat pada alat HPLC adalah:
1. Pompa
menjaga kestabilan kecepatan aliran dari fase gerak ke fase diam yang
dilengkapi dengan tekanan. Pompa satu berisi aquades
2. Pompa 2
menjaga kestabilan kecepatan aliran dari fase gerak ke fase diam. Pompa
dua berisi aquabides atau cairan infus.
3. Kolom injector
sebagai tempat untuk menginjeksikan sampel ke dalam kolom yang terdapat
pada HPLC
4. Detector
 untuk menganalisis sampel yang berupa waktu retensi dan konsentrasi
5. Monitor
untuk mensetting tekanan dan sebagai input beberapa data lainnya

Menurut Adnan (1997), komponen utama HPLC antara lain :

1.    Reservoir pelarut
Zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari
senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bahwa tempat
pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas
atau udara yang ada dalam pelarut.
2.    Pompa
Pompa diperlukan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobil dengan
kecepatan dan tekanan tetap. Gangguan pada pompa dapat disebabkan
oleh perawatan yang kurang teratur. Pompa terdiri dari dua jenis. Yang
pertama berisi aqudes dan pompa kedua berisi aquabides.
3.    Injektor
Pada sampel diinjeksikan dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak
mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat
menggunakan syringe.
4.    Kolom
Ukuran kolom yang umum dipakai adalah dengan panjang 10-25 cm dan
berdiameter 4,5-5,0 mm, yang diisi dengan fase stasioner berukuran rata-
rata 5-10 mikrometer dan dibuat dari logam stailessstccl.
5.    Detektor
Detektor digunakan untuk mendeteksi suatu zat atau sample. Sifat-sifat
detektor yang diperlukan adalah mempunyai spesifitas tinggi, bersifat
linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan dapat mendetek dieluen tanpa
mempengaruhi resolusi kromatogram.
VII. KESIMPULAN
1. Metoda Kromatogarfi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dapat digunakan untuk
menetapkan kadar sakarin, asam benzoat, asam sorbat, kofeina dan aspartam yang
terdapat di dalam minuman ringan, dengan kondisi analisis sebagai berikut :
kolom Latek C18 (150 x 4 mm), fase gerak campuran asetonitril dan dapar asetat
pH 5 (5:95), kecepatan aliran fase gerak 1 ml/menit, detektor spektrofotometer
Ultra Violet (UV) pada panjang gelombang 254 nm, dan sensitivitas 0,04.
2. Limit deteksi yang diperoleh pada metode ini adalah untuk sakarin 0,2 ppm, untuk
asam benzoat 0,2 ppm, untuk asam sorbat 0,007 ppm, untuk kofeina 0,142 ppm,
dan untuk aspartam 6,5 ppm, sedangkan limit kuantitatif yang diperoleh adalah
untuk sakarin 0,689 ppm, untuk asam benzoat 0,852 ppm, untuk asam sorbat
0,027 ppm, untuk kofeina 0,452 ppm dan untuk aspartam 25,2 ppm
3. Sampel minuman ringan yang diperiksa memberikan hasil sebagai berikut : kadar
sakarin yang terdapat pada sampel B = (1112,13 + 1,36) ppm, kadar asam benzoat
yang terdapat pada sampel B = (206,81 + 0,61) ppm, sampel C = (10,83 + 0,08)
ppm, sampel D = (163,78 + 0,69) ppm, dan pada sampel A kadar asam benzoat
tidak dapat dihitung karena mendekati limit kuantitatif, dan pada sampel E tidak
ditemukan adanya asam benzoat, kadar kofeina yang terdapat pada sampel A =
(96,66 + 0,18) ppm, sampel B = (130,63 + 1,49) ppm, sampel C = (97,66 + 0,62)
ppm, sampel D = (231,30 + 3,22) ppm. Pada kelima sampel tidak ditemui adanya
asam sorbat.
4. Kadar sakarin, asam benzoat, kofeina, dan aspartam yang ditemukan pada sampel
tidak melewati batas maksimum penggunaan yang diperbolehkan. Sedangkan
kadar asam benzoat pada sampel B melewati batas maksimum penggunaan yang
diperbolehkan.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Arindradita. 2011. High Performance Liquid Chromatography.
Clark, J. 2007.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). http://www.chem-is-
try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kin
erja_tinggi_hplc/. 1 November 2012.

DechaCare. 2012. Paracetamol. http://www.dechacare.com/Paracetamol-P58.html. 1

November2012. http://tekimerzitez.wetpaint.com/page/HIGH+PERFORMAN
CE+LIQUID+CROMATOGRAPHY. 2 November 2012.

Husin, H., Mairiza, L., dan Zuhra. 2007. Oksidasi Parsial Metana Menjadi Metanol
dan Formaldehida Menggunakan Katalis CuMoO3/SiO2. Jurnal Rekayasa
Kimia dan Lingkungan, 6(1) : 21 – 27.

Johnson, R, A. 2002. APPLIED MULTIVARIATE STATISTICAL ANALYSIS. Fifth

Ed. PrenticeHall, Inc. New Jersey.