KLT-DENSITOMETRI

KLT DENSITOMETER
• Metoda analisis instrumental yang berdasarkan
interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit yang
merupakan noda pada KLT
• Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang
mempunyai pancaran sinar yang panjang gelombang
diatur dari 200 - 700 nm.
• Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi
sinar atau emisi sinar (flouresensi)
Teknik penggunaannya :
- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan
(hanya untuk TLC dengan pendukung gelas),
- Sinar yang diserap dan dipantulkan
- Atau sinar yang dipendarkan.

Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda

dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer
digunakan alat khusus reflection photomultiplier,
sebagai pengganti  photomultiplier pada
spektrofotometer.

3
Pada era perkembangan teknik kromatografi saat
ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph
Scanner" yang lebih populer dengan nama
densitometer makin banyak dipakai .
lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan
noda pada KLT secara :
• Absorpsi
• Transmisi
• Pantulan (refleksi) pendar fluor
• Pemadaman pendar fluor

Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif

analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang
yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T.
 

5
• S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode
densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif
ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti
testosteron dalam cairan biologis pada rentang
kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2-
150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan
pengukuran pendaran pada noda (kromatogram)
KLT.

6
 Kurva hubungan serapan dan kadar

• Persamaan Kubelka-Munk 
• Korelasi kadar analit yang dirajah terhadap area
kromatogram tidak merupakan garis lurus.

• Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan intensitas

semula (I0) jatuh pada permukaan lapisan tipis yang tidak
homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka
sebagian dari REM tersebut akan:
• direfleksikan (Is)
• diserap oleh analit lapisan tipis (I)
• diteruskan (It).
• I=10 + Is + It 7
• Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada
koefisien permukaan lapis tipis (E), yang dinyatakan
sebagai : Is = I. E
• Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang
dipakai. Selanjutnya akan didapat :
I0 =I-IsI0=I-I. E=(I-E)I
• Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis
yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert Beer
seperti pada spektrofotometri
It =I0. e-KX

8
• Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-
densitometri dikenal parameter :
• K (koefisien absorbsi)
• S (koefisien penghamburan). 

• Karena adanya parameter S inilah terjadi penurunan

intensitas radiasi yang masuk medium lapis tipis
yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam.

9
 Bagan Alat densitometer
• Gambar
Sumber Sinar
Photo multiflier Sinar polikromatis
Untuk refleksi

Sinar pantulan Sinar Mono

Monokromator kromator

Densitometer Densitometer
Double beam Single beam
Photomultiflier
Untuk sinar yang diteruskan
10
• Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah
dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas
area (mikro volt) yang tertera merupakan
besaran puncak. Kadang-kadang prosentase
yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari
puncak yang muncul (tergambar).
• Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak
semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi
terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak
bercak.
• Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan
molekul senyawa untuk mengumpul ditengah
lebih banyak.
12
 Analisis Kualitatif
• Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu retensinya, atau
dilakukan penyarian dari bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji
secara spektroskopi.
• Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji.

Sinar mono
Intensitas Serapan

kromatis
Propil spektrogram

`
Bercak

Panjang gelombang (nm)

 Chamber
Tempat elusi

Lempeng Silica gel

Bercak

Cairan elusi
HASIL SCANNING SATU BERCAK
• Scanning tiap bercak dengan lambda
berbeda
• Scanning serentak beberap puncak/bercak
 Contoh 1
 Analisis golongan tetrasiklin, dengan fase diam :
seluluse F, Fase gerak : larutan MgCl2 0,25 M.
(Nornendy, 1993).

. . . . . . . . . . .
0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0

Kromatogram tetrasiklin dan turunannya dilihat

dibawah sinar UV, 366 nm
1. Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat),
2. Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu)
3. Terasiklin HCl Rf =0,73 (merah ungu)
19
• Turunan tetrasiklin dapat membentuk khelat dengan logam
bervalensi +2 sehingga tidak akan baik bila digunakan
silika gel GF.

• Tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks dengan

Ca++ sehingga tak dapat dielusi sempurna.

• Bila digunakan selulusa sebagai fase diam, terdapat batas

kelarutan dalam selulusa, dan terjadi ikatan hidrogen.

• Dengan eluen larutan MgCl2,tetrasiklin dapat

membentuk ikatan kompleks lebih baik dibanding yang
lain.
20
 Analisis Kuantitatif

• Analisis kuantitatif diperlukan senyawa baku pembanding, dan dibuat

kurva regresi linier.

• Untuk menguji tetrasiklin yang tidak mengalami degradasi digunakan

cara analisis dengan KLT

• Dibuat kurva baku hubungan kadar (mcg/ml) dan luas puncak (mV).

Data Kadar Luas puncak

• 0,0 mcg 1,96 mV
• 5 mcg 8,5468 mV
• 10 mcg 13,6856 mV
• 15 mcg 19,0454 mV
• 20 mcg 23,9754 mV
• 25 mcg 29,356 mV
• 30 mcg  38,675 mV
Kurva regresi linier normal

40
35
30
Luas area mV.

25
20 Y= 2.396 X + 1.097
15
10
5
0
0 20 40
Kadar obat mcg
22
• Persamaan kurva kromatogram yang didapat pada
pengamatan tetrasiklin mempunyai persamaan
regresi linier sebagai berikut:
• Y = 0,513 X + 1,487 , R- 0,9996 
• Contoh menghitung:
Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV,
• Maka harga X :
= (24,487-1,487): 0,513
= (23)70,513
=44,834 mcg/ml
 Hasil penelitian Rhodamin
a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)
No Nama Sampel Warna Benang Wol Hasil
Uji
1 Kerupuk bunga Merah muda +
(tersanjung)
2 Kerupuk bawang Tidak merah muda -

3 Kerupuk ketela Merah muda +

4 Kerupuk rengginang Tidak merah muda -
ketan
5 Kerupuk rengginang Tidak merah muda -
beras
6 Kerupuk slondok Tidak merah muda +

7 Kerupuk unyil Merah muda +

8 Kerupuk taro Tidak merah muda -

9 Kerupuk lotek Tidak merah muda -

10 Kerupuk angin Tidak merah muda -

Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan
366 nm

Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nm

a. Kerupuk ketela
b. Kerupuk bunga (tersanjung)

c. Kerupuk unyil
A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml) Luas Area (milivolt)
0,005 0,7092
0,015 0,8493
0,030 0,8582
0,060 2,8790
0,090 3,2248
0,120 4,5278

2. Sampel kerupuk ketela

Replikasi Luas area (milivolt)
1 1,3010
2 1,0251
3 1,1926
4 1,4120
5 1,2412
6 1,0307
7 0,7282
B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt)
0,005 0,4425
0,015 1,1420
0,030 1,5273
0,060 3,0667
0,090 4,2450
0,120 5,1967

2. Sampel kerupuk bunga

Replikasi Luas area (milivolt)

1 2,1328
2 1,7314
3 1,2856
4 1,4730
5 1,0555
6 1,0966
7 0,6985
C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil
1. standar Rhodamin B

Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt)

0,005 0,4865
0,015 0,9649
0,030 1,3910
0,060 1,6812
0,090 2,1991
0,120 2,2197

2. Sampel kerupuk unyil

Replikasi Luas area (milivolt)

1 0,5340
2 0,7687
3 0,5636
4 0,5116
5 0,5502
 Kesimpulan penggunaan HPTLC
a. HPTLC dapat digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis campuran senyawa antara 20 sampai 30
senyawa.
b. Biaya pemeliharaan, operasinal, jauh lebih murah dari
HPLC.
c. Cara deteksinya bercak(senyawa) pada lempeng lebih
banyak pilihan dari HPLC walaupun dengan pereaksi
warna.
d. Pemisahan yang terjadi pada HPTLC lebih dari 10
menit, sedangkan HPLC mungkin lima menit sudah
selesai.
e. Ketilitian dan ketepatan mendekati HPLC.