Validasi Metode Analisis

Validasi Metode Analisis

Validasi : suatu proses (percobaan dilaboratorium) untuk membuktikan bahwa
karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang telah
ditetapkan sebelumnya.
Parameter Validasi Metode Analisis:
 Accuracy
 Precision
 Specificity
 Detection limit
 Quantitation limit
 Linearity
 Range
 Robustness
Accuracy
  
 Definisi : kedekatan hasil tes yang diperoleh prosedur dengan nilai
sebenarnya.

 Biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery)

 Persen perolehan kembali (% recovery)

% Recovery = x 100%

Persyaratan untuk assay validation = 98-102%

 Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi masing-masing 3 kali

replikasi
Presision
 Definisi : kedekatan hasil pengujian dari beberapa seri pengukuran yang diperoleh
dari sampel yang homogen
 Biasanya dinyatakan sebagai standard deviasi atau standard deviasi relative (RSD)
 Meliputi :
• Reproducibility  menggunakan prosedur analitik di laboratorium yang
berbeda (berbeda analis atau instrument di laboratorium berbeda)
• Intermediate precision  berbeda hari, atau berbeda analis, atau berbeda
peralatan dalam satu laboratorium
• Repeatability  menggunakan prosedur analitik dengan interval waktu
yang singkat pada kondisi yang sama ( analis dan peralatan sama)
 Dianjurkan menggunakan 3 konsentrasi yang berbeda dari target dan dilakukan 3
replikasi
 Dianjurkan dilakukan pada hari yang berbeda dengan analis yang berbeda
Specificity

 Definisi : Kemampuan untuk menilai analit dengan jelas dengan adanya

pengotor, produk degradasi, dan komponen matriks.
 Blanko sampel/Placebo  tidak menghasilkan peak/noda dengan waktu
retensi/Rf yang sama dengan analit
 Peak/noda analit terpisah dari peak/noda lainnya (Rs ≥1,5)

 Kemurnian analit menggunakan Detektor Diode array dan Teknik Spiking (Peak
hasil spiking  menunjukkan satu peak/noda dan memiliki tR/Rf sama)
Detection Limit Quantity Limit
 Definisi: Jumlah terendah analit  Definisi : Karakteristik pengujian

dalam sampel yang dapat dideteksi. kuantitatif untuk senyawa tingkat

rendah dalam matriks sampel seperti
 Rasio signal to noise biasanya
pengotor dan produk degradasi
diterima 2:1 atau 3:1, pendekatan
lain menggunakan kemiringan kurva
 Rasio signal to noise biasanya

kalibrasi dan standard deviasi. diterima 10:1, pendekatan lain

menggunakan kemiringan kurva
 Menggunakan sampel dengan
kalibrasi dan standard deviasi.
konsentrasi rendah
 Menggunakan sampel dengan
konsentrasi rendah
Linieritas
 Definisi: Kemampuan suatu metode
untuk menunjukkan hubungan secara
langsung atau proporsional antara
respons detektor dengan perubahan
konsentrasi analit.
Melalui analisis statistik  Linear
Regression (y = mx + b)
 Disarankan menggunakan minimum 5
macam konsentrasi analit.
 koefisien korelasi r ≥ 0,999
Rentang
 Definisi : Interval antara konsentrasi
terbesar dan terkecil dari analit dalam
sampel
 For Drug Substance & Drug product
Assay  80 to 120% of test
Concentration
 For Content Uniformity Assay  70 to
130% of test Concentration
 For Dissolution Test Method  +/- 20%
over entire Specification Range
 For Impurity Assays From Reporting
Level to 120% of Impurity Specification
for Impurity Assays
Robustness

Ukuran kapasitas untuk tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil tetapi
disengaja dalam parameter procedural yang tercantum dalam dokumen prosedur
dan memberikan indikasi kesesuaiannya selama penggunaan normal.
Data Element Required for Validation
 Kategori 1
Prosedur analitis untuk penghitungan komponen utama bahan obat atau bahan aktif
(termasuk pengawet) dalam produk jadi farmasi.
 Kategori 2
Prosedur analitis untuk penentuan pengotor dalam bahan obat massal atau senyawa
pengurai dalam produk farmasi jadi. Prosedur ini mencakup uji kuantitatif dan uji
batas.
 Kategori 3
Prosedur analitis untuk menentukan karakteristik (misalnya, disolusi, pelepasan obat,
dan lain-lain)
 Kategori 4
Tes identifikasi
Data Element Required for Validation
SYSTEM SUITABILITY
SYSTEM SUITABILITY

 Tujuan : untuk memverifikasi sistem kromatografi cukup untuk analisis yang

dimaksudkan.
 Faktor yang dapat mempengaruhi perilaku kromatografi:
• Komposisi, kekuatan ionik, suhu, dan Ph dari fase gerak
• Laju alir, dimensi kolom, suhu kolom, dan tekanan.
• Karakteristik fase diam, tipe kolom (berbasis partikel atau monolitik),
partikel atau macropore size, porositas, dan luas permukaan
• Fase terbalik dan modifikasi fase diam, tingkat modifikasi kimia (end-
capping, permuatan karbon, dan lainnya)
 SYSTEM SUITABILITY
Parameter
1. pH Fase gerak
2. Konsentrasi garam pada Dapar
3. Komponen Fase gerak
Contoh: methanol-air =50:50
Metanol – air = 98: 2
4. Temperatur kolom
5. Volume injeksi
Perubahan yang diperbolehkan
± 0.2
± 10%
Komponen minor (≤50%) : 30% relative
atau maksimum 10% absolut
30% dari 50 = 15% (melebihi 10% absolut)
 perubahan yang diperbolehkan
maksimum 10%  60: 40 atau 40:60
30% dari 2 = 0,6%
Boleh diubah dalam rentang 98,6:1,4 –
97,4:2.6
± 10%
Boleh diubah asal masih memenuhi
presisi, akurasi, linieritas dan batas
deteksi
SYSTEM SUITABILITY
Parameter
6. Panjang gelombang detector UV
7. Kecepatan alir fase gerak
8. Panjang kolom (L)
Pada elusi gradien
Perubahan yang diperbolehkan
Tidak boleh diubah
± 50% (isokratik)
- Tergantung ukuran partikel (dp)
- Boleh diubah asal L/dp tetap atau
antara -25% sampai +50%
- Boleh diubah asal Nilai lempeng
teoretis (N) tetap atau antara -25%
sampai +50%
- Panjang kolom dan ukuran partikel
tidak boleh diubah
HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
 HPLC : teknik pemisahan yang didasarkan pada fase diam padat dan fase gerak cair dan
dengan menggunakan tekanan.

 Fase Diam :
• Partisi
 RP-HPLC: fase gerak polar, fase diam non polar
 Pemisahan didasarkan atas koefisien partisi analit dalam fase diam dan fase
gerak
 Urutan elusi: analit polar terelusi lebih dahulu, analit non plar terelusi terakhir
• Adsorpsi
 NP-HPLC: fase gerak non polar, fase diam polar
 Pemisahan didasarkan atas adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam polar (silika
atau alumina)
 Analit polar lebih tertahan daripada analit non polar karena gugus silanol pada
silika.
 Contoh fase gerak: Heksana, Heptana dll.
• Pertukaran ion
 Pemisahan didasarkan atas pertukaran ion analit dengan ion dari gugus fungsi
bahan pendukung padat fase diam
 Contoh Fase diam: senyawa sulfonate (penukar kation); ammonium kuarterner
(penukar anion)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

 Kolom:
• Panjang dan diameter dalam kolom mempengaruhi pemisahan.
• Dalam prosedur LC, kolom dapat digunakan dengan persyaratan berikut,
kecuali dinyatakan lain dalam monograf :
a) panjang kolom pelindung harus NMT 15% dari panjang kolom analitik
b) diameter bagian dalam harus sama atau lebih kecil dari kolom analitik
c) bahan pengemas harus sama dengan kolom analitik (misalnya, silika)
dan mengandung fasa terikat yang sama (misalnya, C18).
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

 Fase gerak :
Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut, seperti yang dijelaskan
dalam masing-masing monografi.
 Bagian HPLC
Kromatograf cair terdiri dari reservoir berisi fase gerak, pompa untuk memaksa
fase gerak melalui sistem pada tekanan tinggi, injektor untuk memasukkan
sampel ke dalam fase gerak, sebuah kolom kromatografi, detektor, dan
perangkat pengumpulan data.

Gradient
Controller
•
Pump Column
Detector
Injector
Mobile Phases
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

 Elusi Gradien:
Teknik mengubah komposisi pelarut secara kontinyu selama menjalankan
kromatografi disebut elusi gradien atau pemrograman pelarut.
 Prosedur:
1. Setarakan kolom dan detektor dengan fase gerak pada laju aliran yang
ditentukan hingga sinyal konstan diterima
2. Suntikkan sampel melalui septum injektor, atau gunakan autosampler
3. Mulai program gradien
4. Rekam kromatogram
5. Analisis seperti yang ditunjukkan dalam monografi