ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF

PADA KROMATOGRAFI

Yuris Diksy, M.Si

Analisis Kualitatif?

The aim of qualitative analysis is to answer the question ‘What’ is in the sample?
Pada TLC atau Kromatografi Kertas

Nilai Rf atau Rt sampel dibandingkan dengan nilai Rf standar

Pada TLC atau Kromatografi Kertas

Nilai Rf atau Rt sampel dibandingkan dengan nilai Rf standar

Sampel memiliki spot di Rf yang sama dengan Rf

standar, maka secara kualitatif terdapat senyawa
yang sama dengan standar pada sampel

STD SPL
Pada TLC atau Kromatografi Kertas

Nilai Rf atau Rt sampel dibandingkan dengan nilai Rf standar

Sampel Tidak memiliki spot di Rf yang sama dengan

Rf standar, maka secara kualitatif tidak terdapat
senyawa yang sama dengan standar pada sampel

STD SPL
Analisis Kualitatif pada GC atau HPLC?

The aim of qualitative analysis is to answer the question ‘What’ is in the sample?
 Ada dua situasi untuk analisis kualitatif pada HPLC atau GC

Jika komponen dalam sampel diketahui dan Jika komponen dalam sampel sama sekali tidak
puncak kromatografi perlu untuk ditetapkan diketahui

 Dengan cara menginjeksikan standar murni  Dengan menggunakan detektor yang dapat
dan menetapkan puncak dalam kromatogram digunakan untuk membantu identifikasi, seperti
berdasarkan waktu retensi standar. spektrometer massa.

 Dengan detektor selektif, seperti dioda-  Mungkin juga perlu untuk mengumpulkan fraksi
array UV atau detektor Fluoresensi, dapat eluen yang mengandung senyawa puncak
membantu dalam identifikasi senyawa yang untuk karakterisasi menggunakan Infra-red
terdapat pada puncak dengan menghasilkan atau Nuclear Magnetic Resonance
spektrum atau respons spesifik. Spectroscopy (NMR).
Injeksikan larutan standar dibawah kondisi yang sama dengan sampel,
dan membandingkan factor retensi (k) dan respon dari puncak pada
kromatogram dari larutan standar dengan sampel

Konsentrasi dari larutan standar harus

semirip mungkin dengan puncak pada
sampel, hal ini untuk menghindari
kesalahan karena efek bentuk puncak yang
sama.
 Identifikasi puncak

Sample Spiking
 Identifikasi puncak

Spectral Peak Identification

Menggunakan detektor diode

array UV (DAD) atau dengan
detector spektroskopi massa
(MS)
Analisis Kuantitatif?
 KLT-Densitometer

• Metode analisis instrumental yang berdasarkan

interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang
merupakan spot pada KLT
• Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang
mempunyai radiasi sinar pada panjang gelombang
200 - 700 nm.
• Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi
sinar atau emisi sinar (flouresensi)
 KLT-Densitometer
Pelat HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi)
atau KLTKT (kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat
digunakan untuk preparatif (butuh lempeng cukup banyak),
maka hanya untuk analisis kuantitatif

Pelacak bercak (TLC Scanner) untuk analisis kuantitatif

dapat digunakan densitometer baik menggunakan
pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung
menggunakan pelacak sinar UV-Vis maupun sinar
fluoresensi.
 KLT-Densitometer
Teknik penggunaannya :
- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan
- Sinar yang diserap dan dipantulkan
- Atau sinar yang dipendarkan.

Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda

dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer
digunakan alat khusus reflection photomultiplier,
sebagai pengganti photomultiplier pada
spektrofotometer.
lnteraksi radiasi elektromagnetik dengan
Spot pada KLT secara :

• Absorpsi
• Transmisi
• Pantulan (refleksi)

Pemakaian “TLC Scanner (Densitometer)" makin banyak dipakai

seiring dengan berkembangnya teknik kromatografi
• Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif
analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang
yang merupakan hasil pemisahan dengan KLT.

• Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan

area spot pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya
dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja
Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area
spot kromatogram diukur pada posisi lurus atau
"Zig-zag" menyeluruh.
Instrumentasi Densitometer
 Cara Kerja Densitometer

• Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah

dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas
area (mikro volt) yang tertera merupakan besaran
puncak. Kadang-kadang persentase yang tertulis
hanya merupakan kadar relatif dari puncak yang
muncul (tergambar).
• Dalam pengamatan lurus bila spot nya tidak
simetris akan kurang teliti sebab konsentrasi
terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak spot.
• Penotolan dengan spot kecil kemungkinan molekul
senyawa untuk mengumpul ditengah lebih banyak.
Analisis Kualitatif
Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC?
Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC?

Analisis kuantitatif menggunakan luas area atau tinggi puncak untuk menentukkan
konsentrasi dari komponen di dalam sampel
Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC?

Analisis kuantitatif melibatkan banyak langkah yang diringkas secara singkat

sebagai berikut:

 Ketahui senyawa yang Anda analisis

 Tetapkan metode yang sesuai dengan komponen yang akan dianalisis

 Menganalisis suatu standar dengan konsentrasi yang diketahui dari senyawa yang
akan diketahui mendapatkan respons alat

 Menganalisis sampel yang mengandung konsentrasi senyawa yang tidak diketahui

 Membandingkan respons konsentrasi yang tidak diketahui dengan respons konsentrasi

(standar) yang diketahui untuk menentukan berapa banyak senyawa yang ada
Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC?
Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC?
Kuantitatif :

1. Metode Pengukuran Tinggi Puncak

Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC?
Kuantitatif :

2. Metode pengukuran luas puncak

 Luas area dihitung dengan pendekatan tinggi peak dikalikan lebar
peak pada setengah tinggi
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
2. Metode pengukuran luas puncak ( lanjutan )
 Luas area dihitung dengan pendekatan cara segitiga ( alas x ½ tinggi )
Alas ( w ) diukur sebagai jarak antara kedua titik potong garis-garis
singgung dengan poros horizontal
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
2. Metode pengukuran luas puncak ( lanjutan )
 Luas area dihitung dengan pendekatan cara segitiga ( alas x ½ tinggi )
Alas ( w ) diukur sebagai jarak antara kedua titik potong garis-garis
singgung dengan poros horizontal
Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC

Normalisasi % Area / % Tinggi

- Untuk tujuan analisis tertentu ,hanya
jumlah relatif analit dalam suatu
multikomponen yang dibutuhkan.
- Biasa digunakan untuk menganalisis
komponen campuran yang terdiri atas
deret homolog
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Eksternal

Standar eksternal adalah dasar dari prosedur kuanatifikasi dimana

pengukuran kalibrasi dan unknown sample dianalisi pada kondisi yang
sama dan terpisah satu sama lain.

Metode Standar eksternal adalah teknik yang paling banyak dan sering
digunakan untuk memeroleh informasi kuantitatif dari kromatogram. Pada
kasus ini, standar murni komponen (senyawa yang sama dengan yang ingin
ditetapkan di dalam sampel) diinjeksikan dalam suatu deret standar yang
dinaikkan konsentrasinya dan luas area atau tinggi peak yang diperoleh
diplotkan terhadap konsentrasi (kurva kalibrasi). Kurva kalibrasi ini harus
menunjukkan suatu hubungan yang linear dengan intersept yang harus
mendekati nol
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Eksternal

Kurva Kalibrasi Biasa

- dibuat suatu deret larutan standar dengan konsentrasi tertentu
kemudian diukur Luas area/tinggi peak
- dibuat kurva kalibrasi luas area atau tinggi peak terhadap
konsentrasi larutan standar
- interpolasikan luas area atau tinggi peak sampel pada daerah
linier dari kurva kalibrasi tersebut maka konsentrasi unsur di
dalam sampel dapat ditentukan.
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Eksternal

Kurva Kalibrasi Biasa

 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Eksternal
High Precision Ratio
- digunakan dua buah larutan standar yang masing-masing
konsentrasinya 5% lebih rendah (c1) dan 5% lebih tinggi (c2)
daripada konsentrasi larutan sampel (cs).

Cs 
 As  A1
xC 2  C1  C1
 A2  A1
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Eksternal
Single Standar
- digunakan satu buah larutan standar yang
konsentrasinya berdekatan dengan sampel
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Internal

• Standar internal merupakan senyawa yang berbeda

dengan analit, meskipun demikian senyawa ini
harus terpisah dengan baik selama proses
pemisahan.
• Standar internal dapat menghilangkan pengaruh
karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran
sampel atau konsentrasi karena variasi instrumen.
• Digunakan sebagai koreksi
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Internal

Syarat-syarat standar internal :

 terpisah dengan baik dari senyawa yang dituju atau dari puncak-puncak
yang lain
 mempunyai waktu retensi yang hampir sama dengan analit;
 tidak terdapat dalam sampel;
 mempunyai kemiripan sifat-sifat dengan analit dalam tahapan-tahapan
penyiapan sampel;
 tidak mempunyai kimiripan secara kimiawi dengan analit;
 tersedia di pasaran dengan kemurnian yang tinggi;
 stabil dan tidak reaktif dengan sampel atau dengan fase gerak;
 mempunyai respon detektor yang hampir sama dengan analit pada
konsentrasi yang digunakan
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Internal

Teknik Standar Internal :

Umumnya digunakan dalam GC dan HPLC
Suatu senyawa reference/pembanding (standard
internal) dengan volume/massa yg konstan
ditambahkan ke dalam larutan standar dan sampel.
Rasio analit terhadap standard internal digunakan
sebagai sumbu Y dalam plot kurva kalibrasi dan
untuk menetapkan sampel.
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Internal
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Internal
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Internal
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Adisi

 Suatu analit dengan gradien konsentrasi ditambahkan ke sampel.

 Sinyal analit yang diketahui ini diukur untuk membantu menentukkan

konsentrasi dalam sampel asli.
• Key assumption: signal is proportional to the concentration of analyte.
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Adisi

- Dibuat deret larutan sampel dengan konsentrasi

sama dan masing-masing ditambah larutan standar
dari unsur yang akan dianalisis

- Interpolasi nilai serapan 0 pada persamaan regresi

y=0
Nilai x berharga mutlak
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Adisi
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Adisi
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Adisi
 Analisis Kuantitatif pada GC atau HPLC
Standar Adisi
Any questions?

You can find me at:

yurisdiksy@gmail.com