BIOLOGI MOLEKUKER

“ISOLASI DNA & RNA”

Oleh Kelompok :5

1. SHINDY SAUSAN P07134018085

2. NI KADEK AYU SWANDEWI P07134018096

3. I GEDE YOGA PRAMANA P07134018097

4. NI PUTU RIA LILIA SARI P07134018098

5. KOMANG SISILIA P07134018100

6. DESAK MADE DWI PITRIAWATI P07134018105

7. I GUSTI AYU REDINA MATUA DEWI P07134018108

KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
TAHUN 2109
PENGERTIAN DNA

DNA merupakan suatu asam nukleat yang menyusun gen di dalam inti sel. Di
dalamnya, tersimpan segala informasi biologis dari setiap makhluk hidup dan beberapa virus.
Tidak hanya di dalam inti sel, DNA juga terdapat di dalam mitokondria, kloroplas, sentriol,
plastid, hingga sitoplasma.

STRUKTUR DNA

DNA adalah suatu molekul besar kompleks yang terdiri dari dua pita panjang yang saling
berpilin membentuk heliks ganda, dengan setiap pitanya merupakan suatu polimer dari
ratusan hingga ribuan nukleotida. Setiap nukleotida ini terdiri dari:

 Gula pentosa deoksiribosa, gula pentosa (beratom 5C) yang kehilangan satu atom
oksigen.
 Gugus fosfat,  yang terikat pada atom C nomor 5 dari gula pentosa.
 Basa nitrogen, yang terikat pada atom C nomor 1 dari gula pentosa.
FUNGSI DNA
 Membawainformasigenetik.
 Memilikiperandalampewarisansifat.
 Mengekspresikaninformasigenetik.
 Menyintesismolekulkimia lain.
 Menduplikasikandiriataubereplikasi.
SIFAT DNA
 Jumlah DNA konstanpadasetiapjenisseldanspesies.
 Kandungan DNA dalamselbergantungsifatploidiataujumlahkromosom.
 Bentuk DNA padaintiseleukariotiksepertibenang yang tidakbercabang.
 Bentuk DNA padaintiselprokariotik, plastid, danmitokondriaberbentuksirkuler.

DEFINISI ISOLASI DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(Mader, 1993).
Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus
diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya.

(Wilson, Keith and John, 2010).

MACAM METODE ISOLASI DNA

1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen

DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara
acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing
yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan
sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-
60% (Subandiyah,2006).

2. Metode CTAB

Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida
karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping
deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis
yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang
diekstraksi (Prasetyo, 2008).

3. Phenol:chloroform

Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi

DNA, Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

4. Salting Out

Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein

menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein.

5. Guanidine isothiocyanate

Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk
lisis dinding sel, Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.

6. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi
recovery DNA kurang (Barnum 2005).

7. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan
sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya
komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA
secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004).

TAHAP ISOLASI DNA

1. Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

2. Pelisisan dinding dan membran sel

Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan
(homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan
menggunakan  larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena
substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan
untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat
diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

3. Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam
larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

4. Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan
tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal
tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh
temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga
DNA dapat diisolasi secara utuh.

5.  Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga
untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan
larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan
larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan
protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama
5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas ( Fauziah, 2010)

MANFAAT ISOLASI DNA

Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis,
atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan
DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat
aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensic perlu memulihkan
DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau
korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan (Anggie, 2011).

PENGERTIAN RNA
RNA atau asam ribosa nukleat merupakan satu dari tiga makromolekul utama (bersama
dengan protein dan DNA) yang memiliki fungsi penting dalam segala bentuk kehidupan.
RNA mempunyai peran sebagai pembawa bahan genetik serta memainkan peran utama
dalam ekspresi gentik. Didalam suatu gentika molekular, RNA menjadi seuatu perantara
antara informasi yang dibawa DNA serta ekspresi fenotipik yang diwujudkan dalam bentuk
protein.

Struktur RNA

Struktur dasar dari RNA hampir sama dengan DNA. RNA adalah polimer yang tersusun dari
beberapa nukleotida. Dalam setiap nukleotida mempunyai satu gugus pentosa,  satu gugus
fosfat, dan satu gugus basa nitrogen (basa N). POlimer tersusun dari suatu ikatan berselang-
seling antara gugus fosfat dari satu nukleotida dengan gugus pentosa dari nukleotida yang
lainnya. Ada perbedaan antara DNA dan RNA yang terletak pada satu gugus hidroksil cincin
gula pentosa, sehingga dinamakan dengan ribosa, sedangkan gugus pentosa pada DNA
disebut deoksiribosa. Basa nitrogen pada RNA sama dengan DNA, terkecuali basa timina
pada DNA digantikan dengan urasil pada RNA, maka tetap ada empat pilihan: sitosina,
adenina, urasil, guanina untuk sebuah nukleotida. Selain tiu juga, bentuk dari konformasi
RNA tidak berbentuk pilin ganda sebagaimana DNA, namun bervariasi sesuai dengan tipe
serta funsinya.

TIPE-TIPE RNA

RNA ada di alam dalam berbagai tipe/macam. Sebagai bahan genetik, RNA mempunyai
wujud sepasang pita (double-stranded RNA, RNA, dsRNA). Genetika molekul klasik
mengajarkan, pada eukariota ada tida tipe RNA yang terlibat dalam proses sintesis protein.

1. RNA-kurir (messenger-RNA, mRNA), yang disintesis dengan RNA polimerase I.

2. RNA-ribosom (ribosomal-RNA, rRNA), yang disintesis dengan RNA polimerase II
3. RNA-transfer (transfer-RNA, tRNA), yang disintesis dengan RNA polimerase III

Di akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21 diketahui bahwa RNA ada dalam berbagai macam
bentuk dan terlibat dalam proses pascatranslasi. Dalam pengaturan ekspresi genetik orang
sekarang mengenal RNA-mikro yang terlibat dalam “peredaman gen” atau gene silencing dan
small-interfering RNA yang terlibat dalam suatu proses pertahanan terhadap serangan virus.
Fungsi RNA

Dalam bebrapa kelompok virus (misalnya bakteriofag), RNA adalah bahan genetik. Yang
mempunyai fungsi untuk menyimpan informasi genetik, sebagaimana DNA pada organisme
hidup lain. Saat virus ini menyerang sel hidup, RNA yang dibawa masuk ke sitoplasma sel
korban, lalu ditranslasi oleh sel inang untuk menghasilkan virus-virus yang baru.

Tetapi, peran yang penting dari RNA ada pada fungsinya sebagai perantara antara DNA serta
protein dalam proses ekspresi genetik sebab ini berlaku untuk seluruh organisme hidup.
Dalam peranan ini, RNA diproduksi sebagai salinan kode urutan basa nitrogen DNA dalam
proses transkripsi. Kode urutan basa ini tersusun dalam bentuk “triplet”, tiga urutan basa N,
dikenal dengan kodon. Setiap kodon berelasi dengan satu asam amino (kode untuk berhenti),
monomer yang menyusun protein.

Sebuah penelitian mutakhir atas fungsi RNA menunjukan bukti yang mendukung atas teori
“dunia RNA”, yang mengatakan bahwa pada awal suatu proses evolusi, RNA adalah bahan
genetik universal sebelum organisme hidup memakai DNA.

Interferensi RNA

Sebuah gejala yang baru ditemukan pada penghujung abad ke-20 merupakan mekanisme
peredaman (silencing) dalam ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa RNA tidak
diterjemahkan (translasi) menjadi protein oleh tRNA. Hal itu terjadi disebabkan belum
sempatnya ditranslasi, mRNA dihancurkan/dicerna oleh suatu mekanisme yang dibuat
sebagai “interfrensi RNA”. Mekanisme tersebut melibatkan sedikitnya tida substansi (enzim
dan protein lain).

TAHAP ISOLASI RNA

1. Asam Ribonukleat (RNA)

Asam nukleat terdapat dua jenis yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam
ribonukleat (RNA). Asam-asam nukleat ini adalah molekul-molekul yang membuat
organisme hidup dapat mereproduksi komponen-komponen kompleksnya dari satu generasi
ke generasi berikutnya (Campbell, 2002). RNA merupakan bagian terbesar asam nukleat
dalam setiap sel dan lima sampai sepuluh kali lebih melimpah daripada DNA. Peran
utamanya dan yang paling difahami ialah perannya dalam menerjemahkan informasi genetic
ke dalam molekul protein. Namun RNA
berperan serta dalam fungsi-fungsi endonuklease khusus tertentu yang boleh jadi mengatur
beberapa langkah pada ekspresi gen. Virus-virus tertentu-retrovirus dan beragam virus
tunggal dan ganda hewan, tumbuhan dan insek, mempunyai genom-genom yang tersusun dari
RNA (Moeljopawiro dkk, 1992). Berbagai jenis RNA terdapat dalam semua sel yaitu RNA
ribosomal
(rRNA), RNA pemindah (tRNA) dan RNA duta (mRNA), sebagian juga mengandung RNA
sitoplasmik kecil lain (scRNA). Kurang lebih 80 persen RNA seluler tersusun dari ketiga atau
keempat spesies rRNA dan kurang lebih 15 persen merupakan hampir 100 jenis tRNA dan
kurang dari 5 persen adalah beberapa ribu mRNA yang berbeda-beda. Kurang dari 2 persen
jumlah seluruhnya adalah sejumlah tak terhitung rRNA nuclear dan rRNA sitoplasmik kecil
(Moeljopawiro dkk, 1992).
RNA adalah polinukleotida-polinukleotida yang ukurannya berkisar sedikit sekitar 70
nukleotida dalam beberapa tRNA sampai lebih dari 10.000 dalam beberapa mRNA. Dua
nukleotida purin (adenine dan guanin) dan satu pirimidin (sitosin) umumnya ada pada
nukleotida RNA dan DNA. Namun timin (5-metildiketopirimidin) yang ada pada DNA
diganti oleh urasil pada RNA yang tidak mempunyai 5-metil. Adanya 2’-OH yang berbatasan
dengan hubungan fosfodiester antar nukleotida membuat ikatan P-O yang peka terhadap
alkali dan terhadap enzim yang membelah RNA (Moeljopawiro dkk, 1992).
Pentosa yang berikatan dengan basa nitrogen adalah ribosa pada nukleotida RNA dan
deoksiribosa pada molekul DNA. Perbedaan satu-satunya di antara kedua gula ini adalah
bahwa deoksiribosa tidak memiliki satu atom oksigenpada karbon nomor 2-nya yang
membuat namanya disebut deoksi. Dalam suatu polimer asam nukleat atau polinukleotida,
nukleotida-nukleotida dihubungkan dengan ikatan kovalen yang disebut ikatan fosfodiester
antara fosfat dari suatu
nukleotida dan gula dari nukleotida berikutnya. Pengikatan ini menghasilkan suatu tulang
belakang dengan suatu pola gula-fosfat-gula-fosfat yang berulang. Di sepanjang tulang
belakang gula-fosfat ini terdapat tempelan tambahan yang terdiri atas basa-basa nitrogen
(Campbell, 2002).

Kebanyakan RNA seluler berantai tunggal, meskipun beberapa genom virus hewan
(misalnya reovirus) terdiri dari molekul RNA beruntai ganda menyerupai DNA bentuk A.
Untai-untai tunggal hampir selalu membentuk potongan-potongan helical ganda, pendek,
intramolekuler. Ini timbul karena kebanyakan rantai RNA mempunyai daerah-daerah pendek
urutan-urutan komplementer yang memperbolehkan rantai menyimpul balik membentuk
daerah-daerah helical terbatas. Di daerah-daerah beruntai ganda, A berpasangan dengan U
dan G berpasangan dengan C. G juga dapat membentuk pasangan basa dengan U, namun
kurang stabil daripada pasangan G-C standart, karena sebagai gantinya tiga ikatan hidrogen,
mereka hanya membuat dua ikatan. Segmen-segmen helical ganda yang terbentuk dengan
cara ini biasanya pendek dan terputus, karena urutan basa pada dua daerah yang berinteraksi,
jarang berkomplementer sempurna (Moeljopawiro dkk, 1992).

Seperti halnya pada DNA, daerah-daerah helical ganda pada RNA dikacaukan oleh
kenaikan suhu dan pH tinggi. Namun berbeda dengan yang ada pada DNA, ikatan-ikatan
fosfodiester pada RNA dibelah pada pH tinggi, karena panjang daerah-daerah helical pada
RNA untai tunggal pendek dan sering tidak sempurna, daerah-daerah ini mudah dikacaukan.
Namun RNA untai ganda komplementer penuh, meleleh tajam pada kisaran suhu yang
sempit, seperti untai ganda DNA. Seperti DNA, denaturasi untai ganda RNA menghasilkan
dua untai tunggal komplementer yang dapat berasosiasi kembali bila suhu diturunkan secara
lambat. Pada RNA untai tunggal, sesudah renaturasi lebih sulit untuk membentuk kembali
daerah-daerah pasangan basa yang sama dan beberapa struktur pilihan dapat dibentuk
(Moeljopawiro dkk, 1992).

2. Reverse Transcriptase PCR (RT-PC)

Teknik RT-PCR dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA
hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Sebelum teknik ini
dikembangkan, analisis terhadap molekul mRNA biasanya dilakukan dengan metode
hibridisasi in situ, northern blot, dot blot atau slot blot, analisis menggunakan S1 nuklease
atau dengan metode pengujian proteksi RNase (RNase protection assay). Metode hibridisasi
in situ bersifat sangat sensitive sehingga dapat digunakan untuk analisis molekul mRNA yang
terdapat dalam
jumlah sangat sedikit, tetapi teknik ini cukup sulit untuk dilakukan. Metode-metode yang lain
meskipun lebih mudah dilakukan, tidak cukup sensitif. Oleh karena itu, kemudian
dikembangkan teknik RT-PCR untuk mengatasi kelemahan-kelemahan metode yang lain
tersebut (Yuwono, 2006).
 Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA sebagai cetakan
maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse transcription) terhadap
molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA
tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR ini sangat
berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan kloning
dan analisis,
maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik (Yuwono, 2006).
Teknik RT-PCR memerlukan enzim transkriptase balik (reversetranscriptase). Enzim
transkriptase balik adalah enzim DNA polimerase yang menggunakan molekul RNA sebagai
cetakan untuk menyintesis molekul DNA (cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA
tersebut. Beberapa enzim transkriptase balik yang dapat digunakan antara lain mesophilic
viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV)
maupun oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV) dan Tth DNA polimerase. RTase
yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat sangat prosesif dan mampu menyintesis
cDNA sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polymerase mampu menyintesis cDNA
sampai sepanjang 1 -2 kb (Yuwono, 2006). Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan
menggunakan beberapa macam primer yaitu: 1) Oligo (dT) sepanjang 12-18 nukleotida yang
akan melekat pada ekor poli (A) pada ujung 3’ mRNA mamalia. Primer semacam ini pada
umumnya akan menghasilkan cDNA yang lengkap. 2) Heksanukleotida acak, yang akan
melekat pada cetakan mRNA yang komplementer pada bagian manapun. Primer ini akan
menghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial). 3) Urutan nukleotida spesifik, yang dapat
digunakan secara selektif untuk menyalin mRNA tertentu (Yuwono, 2006).

3. Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran
berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan, dibawah pengaruh medan listrik
(Suhartono, 1989). Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan
atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan
negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel
agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya,
maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak
molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung
pula pada bentuk molekulnya (Yuwono, 2005).
Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis virus, DNA, RNA, protein
(enzim dan protein lain), molekul-molekul organik dengan berat molekul rendah seperti
asam-asam amino (Suhartono, 1989; Yuwono, 2005). Elektroforesis DNA dilakukan
misalnya untuk menganalisis fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim
restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya
dengan cara membuat gel agarosa yaitu suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang
diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer.
Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnya
menggunakan oven gelombang mikro (microwave oven). Dalam keadaan panas, gel akan
berupa menjadi cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang biasanya
terbuat dari (Perspex). Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel tersebut dibuat
lubang-lubang dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk menyerupai sisir.
Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Dengan demikian, pada
waktu gel memadat dan sisirnya diambil terbentuklah lubang-lubang kecil. Ke dalam lubang-
lubang kecil itulah sampel molekul DNA dimasukkan. Gel agarosa yang sudah terbentuk
kemudian dimasukkan ke dalam suatu tangki yang berisi buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya dengan tris-asetat-EDTA (TAE)
atau tris-borat-EDTA (TBE) (Yuwono, 2005).
Setelah DNA dimasukkan ke dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan. Kutub yang
sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub lainnya positif.
Oleh karena DNA bermuatan negatif maka molekul-molekul DNA akan bergerak ke arah
kutub positif. Setelah beberapa waktu gel kemudian direndam dalam larutan yang
mengandung etidium bromide. Etidium bromida akan menginterkalasi (menyisip ke dalam)
DNA. Penggunaan etiidium bromide dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena
etidium bromida akan memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari
bawah, maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-
molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis. Molekul RNA dapat
dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu menggunakan gel agarosa, namun dengan
menggunakan buffer yang berbeda yaitu yang mengandung formaldehid (Yuwono, 2005).
Teknik elektroforesis DNA berkembang sehingga analisis molekul DNA tidak hanya
dapat dilakukan dengan prinsip elektroforesis linear. Beberapa teknik baru dikembangkan,
misalnya teknik pulse field gel electrophoresis (PFGE), orthogonal field alternation gel
electrophoresis (OFAGE), transverse alternating field electrophoresis (TAFE) dan lain-lain.
Disamping itu, untuk keperluan tertentu misalnya untuk penentuan urutan basa DNA (DNA
sequencing), elektroforesis DNA dilakukan dengan menggunakan gel yang berbeda yaitu gel
poliakrilamid (Yuwono, 2005).

4. Transformasi
Transformasi adalah proses pemasukan molekul DNA yang ada dalam keadaan bebas
di dalam satu lingkungan ke dalam suatu sel penerima, misalnya bakteri. Transformasi dapat
terjadi secara alami maupun karena induksi in vitro. Proses transformasi pertama kali
ditemukan oleh Frederik Griffith pada bakteri Streptococcus pneumoniae termasuk genus
Pneumoniae yang membentuk kapsul bersifat virulen, sedangkan yang tidak membentuk
kapsul bersifat avirulen. Strain avirulen dapat berubah menjadi virulen jika diinkubasikan
dengan ekstrak sel virulen yang sudah dimatikan. Pada tahun 1944, Avery, McLeod dan
McCarty menemukan bahwa proses transformasi dari avirulen menjadi virulen tersebut
disebabkan oleh molekul DNA yang berasal dari strain yang virulen (Moeljopawiro dkk,
1992).
Transformasi diketahui terjadi pada genera bakteri lain termasuk Haemophilus,
Neisseria, Xanthomonas, Rhizobium, Bacillus dan Staphylcoccus. Proses transformasi yang
diinduksi secara in vitro dapat juga berlangsung pada E.Coli, khamir Saccharomyces
cerevisiae, bahkan tanaman tingkat tinggi meskipun mekanisme molekulernya berbeda dari
proses transformasi yang terjadi di alam (Moeljopawiro dkk, 1992). Salah satu syarat utama
agar transformasi dapat berlangsung adalah kompetensi sel. Sel yang kompeten adalah sel
yang dapat menerima molekul DNA dari luar. Kondisi yang mempengaruhi kompetensi sel
bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Kompetensi merupakan implikasi terjadinya
perubahan pada dinding sel bakteri dan diduga berhubungan dengan sintesis materi dinding
sel pada tahapan pertumbuhan tertentu. Dalam proses perkembangan kompetensi sel, akan
terbentuk reseptor pada dinding sel yang merupakan tempat melekatnya molekul.
DNA pada awal proses transformasi. Banyaknya reseptor yang aktif bervariasi dari
satu jasad ke jasad lain, misalnya pada S. pneumoniae ada 80 reseptor, pada B.subtilis ada 50
reseptor, sedangkan pada Haemophilu influenzae hanya ada 4 reseptor (Moeljopawiro dkk,
1992). Kompetensi akan terjadi pada tahapan pertumbuhan tertentu, biasanya pada fase
eksponensial akhir dan dipengaruhi oleh medium pertumbuhan serta aerasi. Banyaknya fraksi
suatu kultur yang menjadi kompeten juga tergantung pada spesies. Sebagai contoh,
kompetensi pada S. pnemoniae dapat diinduksi sampai mencapai 100% namun kondisi
tersebut hanya berlangsung beberapa menit. Sebaliknya, pada B. subtilis kompetensi hanya
akan mencapai 20% akan tetapi dapat berlangsung selama beberapa jam (Moeljopawiro dkk.,
1992).
Pada umumnya proses pemasukan molekul DNA dari luar ke dalam sel inang bersifat
tidak spesifik, artinya tidak tergantung pada spesies inang tersebut. Dengan demikian jika dua
macam molekul DNA yang berasal dari sumber berbeda digunakan untuk transformasi sel
yang sama, maka kedua macam DNA tersebut akan berkompetisi dalam proses transformasi
(Moeljopawiro dkk., 1992).
Transformasi dapat terjadi secara alami maupun karena induksi. Dalam proses
transformasi secara alami, misalnya Pneumococcus, sel dapat menerima DNA untai ganda
berbentuk linier. Agar DNA tersebut dapat direplikasikan dan diturunkan ke sel anakan, maka
donor tersebut harus diintegrasikan dengan mekanisme rekombinasi pada daerah gen yang
homolog pada sel penerima. Plasmid yang dapat digunakan untuk transformasi semacam ini
biasanya adalah plasmid yang dapat melakukan replikatif secara independen sehingga tidak
perlu ada proses rekombinasi dengan genom sel penerima. Pada umumnya sel penerima yang
digunakan dalam transformasi secara induksi adalah sel yang tidak mampu melakukan
rekombinasi (recA). Hal ini dimaksudkan agar tidak terjadi proses penyusunan genom
kembali (rearrangements). Meskipun demikian, dalam beberapa prosedur kloning gen,
kadang-kadang juga digunakan plasmid yang tidak mampu melakukan replikasi secara
independen sehingga plasmid tersebut harus diintegrasikan ke dalam genom sel penerima
(integratting plasmid) agar gen yang dibawa oleh plasmid dapat direplikasikan. Pada bakteri
E. coli, induksi transformasi
dapat dilakukan dengan menginkubasikan sel penerima di dalam larutan CaCl2 dingin
sebelum dicampur dengan DNA donor (Moeljopawiro dkk, 1992).
Pada bakteri lain, misalnya Bacillus subtilis, transformasi biasanya dilakukan dengan
metode transformasi protoplas. Dalam hal ini, dinding sel dihilangkan terlebih dahulu dengan
enzim tertentu. Penghilangan dinding sel tersebut dilakukan di dalam larutan tertentu,
misalnya sukrosa pada konsentrasi tertentu, untuk mempertahankan tekanan osmose sehingga
protoplas yang terbentuk tidak akan lisis. Transformasi dapat juga dilakukan dengan metode
elektroporasi yaitu dengan menggunakan pulsa listrik bervoltase tinggi dalam waktu singkat
(Moeljopawiro
dkk., 1992).
Pada praktikum kali ini plasmid yang digunakan untuk transformasi adalah PUC 19. Plasmid
pUC 19 merupakan salah satu vektor kloning yang biasa digunakan dalam penelitian –
penelitian biologi molekuler. Plasmid ini berukuran 2.686 pasang basa dan memiliki tiga
bagian utama yaitu gen resisten ampisilin, gen lac-Z yang mengandung Multiple Cloning Site
(MCS), dan Origin of Replication
(ORI) (Lodge,

DAFTAR PUSTAKA
https://aisyatunnurlaelyshare.wordpress.com/science/isolasi-dna/

https://www.gurupendidikan.co.id/pengertian-rna-beserta-struktur-tipe-dan-fungsinya/