LAPORAN PRAKTIKUM

BIOMOLEKUL
ISOLASI DNA PLASMID

Disusun Oleh
Nama : - Siska Sri Wahyuni
- Wardatul Hasanatil Faizah
- Agung Susanto Jati Waseso
Kelas : AP
Kelompok : 9
Asisten : M. Syechfu Aref G

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2018
 BAB I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung

materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh
bentuk kehidupan secara seluler, sehingga DNA ini sangat penting dalam
kehidupan manusia. DNA mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu
generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam sel akan membentuk
genom (Suryo, 2004). DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas.
DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon,
sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. DNA mitokondria dan kloroplas hanya dapat
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu (Glick, 2005).
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari
bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi
DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA juga
dapat dilakukan melalui sentrifugasi, dimana teknik ini dilakukan berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang memiliki berat molekul besar akan
berada pada bawah tabung, sedangkan molekul yang ringan akan berada pada
bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menghasilkan dua macam fraksi yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012). Isolasi
DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti
protein dan RNA, sehingga meode yang digunakan harus efektif dan bisa
dilakukan untuk semua spesies. Metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA (Surzycki, 2000).
 DNA berfungsi sebagai pembawa informasi genetik, berperan dalam
menduplikasi diri dan dalam pewarisan sifat, sebagai ekspresi informasi genetik,
pengarah sintesis RNA pada sebuah proses kimia atau transkripsi, kode untuk
pengaktifan protein dan penonaktifan gen serta untuk membuat protein. Teknik
isolasi DNA ini perlu dilakukan agar DNA yang akan digunakan sebagai
penelitian dalam keadaan yang lebih murni, sehingga dapat menganalisis sifat atau
karakter dari DNA yang diisolasi. Isolasi DNA pada saat ini juga dapat digunakan
dalam beberapa kegiatan biologis, misalnya dalam mengawinkan tumbuhan untuk
mengasilkan spesies yang baru.

1.2. Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dari percobaan ini adalah:
1. Bagaimana teknik mengisolasi DNA Plasmid?
2. Bagaimana mengetahui berat molekul DNA Plasmid?

1.3. Tujuan
Adapun tujuan dari percobaan ini adalah:
1. Melatih kemampuan untuk mengisolasi DNA Plasmid.
2. Mengetahui berat molekul DNA Plasmid

1.4 Manfaat
Adapun manfaat dari percobaan ini adalah:
1. Mahasiswa dapat Melatih kemampuan untuk mengisolasi DNA Plasmid.
2. Mahasiswa dapat mengetahui berat molekul DNA Plasmid
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Deoxyribose Nucleid Acid (DNA)

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung
informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya
(Suryo 2004). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom.
Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel
organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen(Campbell dkk.2004). DNA
organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular dan terletak dalam sitoplasma,
sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier yang terletak
dalam inti sel (Goodenough, 1988).

DNA adalah suatumateri genetik dimana semua informasi terdapat di

dalamnya.DNA tersusun atas tiga komponen utama yaitu gula pentosa
(Dioksirobosa), asam fosfat dan pasangan basa nitrogen (purin dan pirimidin).
DNA pada manusia, hewan atau tumbuhan ditemukan pada inti sel atau di dalam
organ lain seperti mitokondria dan kloroplast. DNA disusun dari nukleotida
dimana antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan
dengan ikatan fosfat. Ikatan fosfat tersebut sangat kuat dan biasanya dikenal
sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat ( PO 4-)
pada sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga dinamakan asam nukleat
(Goodenough, 1988).
DNA yang menyusun kromosom dan plasmid pada bakteri diselimuti oleh
suatu dinding sel dan pada virus diselimuti oleh protein teretentu. Organisme
prokariot mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid adalah mulekul DNA
yang bentuknya sirkular dengan ukurannya jauh lebih kecil dibanding dengan
kromosom (Lehninger, 1982). Plasmid dapat memperbanyak diri dengan cara
bereplikasi. Plasmid pada umumnya digunakan dalam rekayasa genetik. Teknologi
DNA rekombinan menggunakan E. Coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai pembawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen ini selanjutnya akan
mengekspresikan produk tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim
(Stanfield, 1996).
Plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada
sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari
molekul DNA utama pada kromosom bakteri. Plasmid mempunyai titik ori (origin
of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA
kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi.
Berbagai tipe plasmid telah ditemukan pada sel bakteri. Distribusi plasmid pada
bakteri bersifat sporadis karena ada bakteri yang mengandung plasmid tetapi ada
juga yang tidak, misalnya pada sel E.coli terdapat plasmid F yang menyebabkan
bakteri ini mempunyai sifat konjugatif tertentu. Plasmid F biasa digunakan
sebagai vector untuk membawa DNA yang akan disisipkan pada genom sel target.
Plasmid juga merupakan alat yang efisien untuk mengamplifikasi klon DNA
karena memiliki kopi yang sangat banyak per selnya (Lehninger, 1982).
DNA dapat mereplikasi diri
melalui tiga cara yaitu sebagai berikut
1. Semi konservatif
Semi konservatif yaitu apabila
dua pita spiral dari “double
helix” memisahkan diri dan
setiap pita tunggal dari 'double
helix' parental membentuk pita pasangan yang baru
2. Konservatif
Konservatif yaitu rantai double helix parentalnya tetap utuh, dan semuanya
dapat mencetak double helix yang baru
3. Dispersif
Dispersif yaitu kedua pita double helix parental terputus-putus membentuk
segmen-segmen. Segmen-segmen DNA parental dan segmen-segmen DNA
yang yang baru saling bersambungan dan membentuk dua double helix baru
(Jack, 1995).

2.2. Fungsi dan Struktur DNA

DNA memiliki fungsi untuk menyimpan semua informasi genetik secara
lengkap yang dibutuhkan, untuk memberikan ciri khas dari struktur semua protein
dan RNA pada setiap spesies organisme. DNA berguna untuk membuat program
untuk menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur. DNA juga
digunakan untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan
untuk menentukan sifat spesifik dari organisme tertentu. (Lehninger, 1982).
Tiga struktur DNA meliputi struktur primer, struktur sekunder, dan struktur
terier. Struktur primer dari DNA disusun oleh monomer-monomer nukleotida.
Nukleotida terbentuk dari satu gula pentose (2-deoksi-D-ribosa) berbentuk
furanosa, satu basa nitrogen yang meliputi purin atau pirimidin, dan satu molekul
fosfat. Arah rantai DNA dari ujung 5’ bebas menuju gugus hidroksil 3’ bebas
(Kusuma, 2010). Struktur sekunder dari DNA berupa double helix, dimana dua
untai polinukleotida secara anti parallel yang berpilin ke kanan dan melingkari
sumbu. Nukleotida yang merupakan penyusun DNA terdiri atas tiga gugus
molekul yaitu gula dengan 5 karbon (2-deoksiribosa), basa nitrogen, dan gugus
fosfat. Basa nitrogen penyusun DNA adalah golongan purin dan golongan
pirimidin. Basa purin dibagi menjadi dua yaitu adenin (A) dan guanin (G)
(Kusuma, 2010).Struktur tersier dari DNA paling umum ditemukan pada virus dan
mitokondria. Struktur DNA tersier berbentuk lingkaran. Lingkaran terbentuk
karena dari kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak
berujung. DNA dengan struktur tersier dapat diisolasi dari bakteri, virus, dan
mitokondria yang berbentuk superkoil (Kusuma, 2010).

2.3. Isolasi DNA

Isolasi DNA adalah suatu cara untuk mempelajari DNA. Isolasi DNA
dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA juga dapat dilakukan
dengan menggunakan sentrifugasi, dimana metode ini didasarkan pada berat
molekul komponen-komponen yang dipisahkan. Komponen yang memiliki berat
molekul besar akan mengendap dahulu di dasar tabung dan komponen dengan
berat molekul yang kecil akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).
Teknik isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen
Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya
digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk
menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas
sebagai sumber enzim protease serta garam dapur. Isolasi DNA metode Kitchen
Preparation menggunakan detergen sebagai alternative pengganti EDTA dan
SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai
pengganti enzim protease. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat
menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi
hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk
senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk
karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga
dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia
(Sambrook et al., 1989).
2.3.1 Isolasi DNA Plasmid
DNA plasmid adalah tempat untuk kloning gen. DNA plasmid harus
dipisahkan dari DNA kromosom sehingga akan mempermudah untuk
mendapatkannya. Ukuran dari DNA plasmid sangat kecil daripada DNA
kromosom dan untuk memisahkan DNA plasmid, maka diperlukan perlakuan
berbeda dengan prosedur isolasi DNA kromososm. Membran sel dipecah dengan
menambahkan detergen. Proses pemecahan ini akan membebaskan DNA
kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lainnya. Hasil proses lisis
kemudian ditambahkan potasium untuk mengendapkan DNA kromosom dan
protein. Endapan DNA, protein, dan potasium dipisahkan dengan cara
sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang
diambil untuk dipisahkan dari DNA plasmid. RNase dan protese ditambahkan
untuk mendegradasi RNA dan protein. Proses terakhir adalah menambahkan
etanol untuk mengendapkan DNA plasmid (Cooper, 2000).
Kuantitas dari DNA dicerminkan berdasarkan berat molekul bukan oleh
volume. Kuantitas DNA dapat diketahui dengan cara dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang 256 nm atau 260 nm. Kualitas dari
DNA hasil isolasi berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein
Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat diubah menjadi
konsentrasi, dimana nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml
(Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Elektroforesis gel agrosa merupakan suatu metode yang prinsipnya
berdasarkan pergerakan dari molekul bermuatan pada media penyangga matriks
stabil, yaitu gel agarosa atau poliakrilamid. Pergerakan molekul tersebut di bawah
pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel agarosa berfungsi untuk memisahkan
fragmen-fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb yang berjalan
secara horizontal. Jenis elektroforesis lainnya yaitu elektroforesis poliakrilamid
yang biasanya digunakan untuk memisahkan DNA yang berukuran 1 pb yang
berjalan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid digunakan untuk
menentukan skuens DNA (Muladno, 2002)
2.3.2 Isolasi DNA Kromosom
Prinsip dari isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom
atau DNA genom dari komponen lain yang terdapat di dalamnya. DNA kromosom
dapat disolasi dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel
ditambahkan lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil
sulfat) untuk memecah membran dan mengeluarkan seluruh isinya kemudian
dilakukan ekstraksi dengan cara menambahkan protease dan RNase pada ekstrak
sel. Protease akan mendegradasi protein dan RNase mendegradasi RNA,
sehingga yang tinggal DNA. Ekstrak yang didapatkan kemudian dipanaskan

sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA

(DNase). Larutan DNA kemudian di endapkan dengan etanol dan bisa dilarutkan
lagi dengan air (Cooper, 2000).
 BAB III. METODELOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
- Mikropipet
- Tabung eppendorf
- Beaker glass
- Erlenmeyer
- Sentrifuse
- Shaker incubator
- Lemari es
- Gabus
- Termometer
- Water bath

3.1.2 Bahan
- Larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH
8) 100 µL
- Larutan II (NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O steril)200 µL
- Es batu
- Larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)150 µL
- Campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol (25:24:1)
- Etanol absolut
- Etanol 70%
- ddH2O
- Koloni tunggal transforman E.Coli(inokulum)
 - Gel agarosa 1,5%
- Buffer TAE
- Larutan Etidium Bromida (EtBr) 250 µg/mL
- Buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA) 250 µl
- Lisozim 10mg/ml 250 µL
- STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) 50µL
- Larutan fenol jenuh 300µL
- Larutan natrium asetat 0,3 M

3.2 Skema Kerja

Koloni tunggal

- diinokulasi
- diinkubasi 37oC
- disentrifugasi
-

Isolasi DNA Kromosom pellet Isolasi DNA Plasmid

Disuspensi :
Disuspensi :
Larutan I, II, III
Buffer TE, larutan STEP

- dihomogenkan
- diekstraksi

Lapisan atas
 - dipekatkan
- dinkubasi
- disentrigugasi

pellet

- dilarutkan dalam ddH2O

- Analisis DNA

Hasil

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Isolasi DNA Kromosom
Koloni tunggal isolat A diinokulasikan ke dalam 5 mL media cair dan
diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 30oCdengan kecepatan 150 rpm
selama 18 jam. Kemudian sebanyak 5 mL suspensi sel disentrifugasi selama 2
menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC. Setelah terpisah, supernatan
dibuang kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 uL buffer TE (50 mM tris
HCl pH 8 dan 50 mM EDTA), kemudian ditambahkan 0,2 gram pecahan kaca
steril kemudian dikocok selama 15 menit. Lalu menarmbahkan larutan STEP
(SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50 uL ke dalam susupensi
dan dicampur rata. Campur an ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada
suhu 50oC selam 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan. Kemudian
ditambahkan 300 uL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai
terbentuk emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5
menit selama terpisah 2 lapisan. DNA yang diinginkan berada pada lapisan atas.
Lapisan atas dipipet secara berhati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung
eppendof yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M
sebanyak 0,1 kali dari volume total hasil pemipetan DNA , lalu dicampur pelahan.
Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan
kemudian tabung bolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu, campuran
diinkubasi pada suhu -20oC selam 2 jam sampai semalam. Campuran
disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan
pellet dicuci dengan 0,6 mL etanol 70%. Sentrifuge kembali campuran pada
12000 rpm selama 5 menit. Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH2O.

3.3.2 Isolasi DNA plasmid Pet-endo

Koloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 mL media LB
cair yang mengandung 2.5 L kanamisin dan diinkubasi pada shaker incubator
pada suhu 37°C dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam. Kemudian sebanyak 5
mL suspensi sel disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 4°C, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 Mm Ph
8, Na2EDTA 10 mM Ph 8) 100 L dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit.
Ditambahkan 200 L larutan II (NaOH 0.2 N 20 L, SDS 1% 100 L, aquades
steril 880 L) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung eppendorf,
larutan diinkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 L
larutan III (kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), diinkubasi
dalam es selama 10 menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 4°C, supernatan yang diperoleh dipindah
secara perlahan dengan menggunakan pipet ke dalam tabung eppendorf baru yang
steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1
kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi
12.000 rpm selama 2 menit. Dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa
organikk, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa
cair, fasa cair dipindah dengan cara memipet secara hati-hati ke dalam tabung
eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan
etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam.
Campuran disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf dikeringkan dari etanol
dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet
dilarutkan dalam 30 L ddH2O.

3.3.3 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 40 mL
buffer TAE (40 mM Tris-asetat dan 1 mM Na 2EDTA Ph 8/ stok buffer TAE 5X :
24,2 gram, 5,72 mL asam asetat glasil dan 10 mL dengan pemanasan). Setelah
agarosa terlarut dan didinginkan sampai kira-kira temperatur 45°C, selanjutnya
gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel yang akan
dielektroforesis dicampur dengan buffer pembeban 1 kali (buffer pembeban 6kali:
bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)). Elektroforesis dilakukan
dalam buffer TAE pada tegangan 70-100 Volt. Elektroforesis dihentikan ketika
bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel agarosa
kemudian direndam dalam larutan buffer EtBr 250 g/mL selama 3-5 menit,
selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit atau aquades. Pita-
pita DNA dapat diamati dengan sinar UV.
 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1. DNA Plasmid

No Perlakuan Hasil
Larutan menjadi kental, keruh
1. Penambahan larutan I
dan berwarna putih
2. Didiamkan selama 5 menit Tidak terjadi perubahan
Membentuk larutan tidak
3. Penambahan larutan II
berwarna dan homogen
4. Inkubasi selama 15 menit Terdapat lendir pada larutan
Aroma larutan asam dan larutan
5. Penambahan larutan III
tak berwarna
Larutan membentuk 2 fase
dimana pada bagian atas dan
Inkubasi selama 10 menit dan
6. bawah berupa larutan tidak
disentrifugasi
berwarna dan bagian dinding
berupa lapisan tipis emulsi
 Ditambah campuran
7. Membentuuk emulsi
fenol;kloroform;isoamil alkohol
Supernatan bagian atas dan ditambah
7. Larutan homogen
etanol dingin
8. Diingkubasi selama 60 menit Terdapat pelet
Pelet larut membentuk larutan
9. Pelet diambil dan ditambah etanol
homogen
Larutan homogen dan terdapat
10. Disentrifugasi
sedikit pelet
11. Pelet diambil dan ditambah ddH2O Tidak terjadi perubahan

4.1.2 DNA Kromosom

No
Perlakuan Hasil
.
Larutan keruh dan pelet tidak
1. Penambahan larutan buffer
larut
2. Inkubasi selama 45 menit Larutan menjadi setengah beku
3. Penambahan 250 μl lisozim Tidak terjadi perubahan
Dibiarkan mencair pada suhu ruang Larutan mencair dan sedikit
4. dan di masukkan dalam ice-bath 45 keruh, lalu larutan menjadi
menit setengah beku
Penambahan larutan STEP Larut membentuk larutan
5.
homogen
Dipanasakan dalam waterbath suhu
6. Tidak terjadi perubahan
50 0C selama 60 menit
Terbentuk 2 fasa dan terdapat
7. Ditambahkan larutan fenol
emulsi
Terbentuk 2 fasa larutan, dimana
bagian bawah dan atas larutan
8. Larutan campuran disentrifugasi merupakan larutan tidak berwarna
dan ditengah terdapat emulsi tipis
berwarna putih
 Supernatan pada bagian atas
9. Larutan homogen
ditambah natrium asetat 70 μl
10. Penambahan etanol dingin Larutan homogen
Terdapat sedikit pelet didinding
11. Disentrifugasi
eppendorf
Pelet diambil dan ditambahkan Pelet terdapat pada dinding
12.
etanol lalu disentrifus tabung
Supernatan dibuang dan pelet
13. Tidak terjadi perubahan larutan
ditambah ddH2O

4.1.3. Hasil gambar elektroforesis

No Sampel Gambar
.
1. DNA kromosom
 2. DNA plasmid

4.2 Pembahasan
Percobaan yang telah dilakukan ada praktikum ini yaitu isolasi DNA
plasmid dan kromosom. Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler yang
berukuran relatif kecil dan berada pada kromosom bagian luar dalam sel
prokariot. Plasmid dalam rekayasa genetika dapat digunakan sebagai vektor untuk
mentransfer gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen ini
nantinya yang akan menghasilkan suatu produk komersial seperti insulin. Isolasi
DNA plasmid dapat dilakukan dengan sentrifugasi dan presipitasi. Proses ini
dilakukan dengan cara memecah dan mengekstraksi jaringan-jaringan hingga
membentuk ekstrak sel yang terdiri dari sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Ekstrak
sel kemudian dilakukan pemurnian (purifikasi) sehingga dihasilkan pellet sel yang
mengandung plasmid. Isolasi DNA bertujuan untuk memperoleh DNA yang murni
terbebas dari bahan-bahan lainnya seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi
DNA memiliki ketelitian yang cukup tinggi sehingga harus dilakukan secara hati-
hati. DNA yang akan diisolasi dalah DNA kromosom dan DNA plasmid untuk
kemudian dianalisis dengan elektroforesis sel agarosa.

4.2.1 Isolasi DNA Plasmid

Isolasi pET-endo merupakan dapat diguanakan untuk memperoleh gen dari
pET-endo dari bakteri E. coli TOP10. Isolasi pet-endo dari bakteri E. coli pada
praktikum kali ini dilakukan dengan menggunakan cara alkalin lisis. Metode
alkalin lisis merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA
plasmid yang ada dalam sel bakteri E. coli. Isolasi tersebut dilakukan melalui
proses lisis pada membran sel dengan menggunakan Sodium Dedosil Sulfat pada
suasana basa. Bakteri E. coli dibiakkan dalam media LB yang sudah ditambahkan
kanamisin, kemudian diinkubasi selama ±16 jam pada 37oC dengan kecepatan 150
rpm, dimana tahap ini sudah dilakukan oleh asisten sehingga praktikan
melanjutkan tahap berikutnya. Tahap isolasi plasmid berikutnya yaitu diambil 5
ml suspensi sel dan dilakukan sentrifuse 10000 rpm pada suhu 4 oC selama 2
menit. Sentrifuse ini bertujuan untuk memisahkan material selular (DNA) dengan
cairan yang terdapat dalam sel dan juga media LB sehingga semua material
penyusun sel berada dalam pellet. Hasil dari sentrifuse yaitu supernatan dan pellet.
Supernatan merupakan substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat
jenis yang lebih kecil. Pellet adalah adalah substansi hasil sentrifugasi yang
memiliki berat jenis yang lebih besar. Posisi supernatan berada pada lapisan atas
dengan warna yang lebih jernih dan pellet berada pada bagian bawah dengan
warna yang lebih keruh berupa endapan. Sel dari bakteri Escherichia coli akan
berada pada pellet sehingga supernatan harus dipisahkan dan dibuang melalui
proses sentrifugasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah pemisahan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi
yang lebih ringan akan terletak di atas. Hasil pelletnya diambil dan supernatannya
disimpan.
Tahap pertama yang dilakukan yaitu pelet disuspensi dengan
menggunakan larutan I (campuran dari glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na-
EDTA 10 mM pH 8 sebanyak 100 mL) sebanyak 100 µL dan dihomogenkan lalu
didiamkan 5 menit. Penambahan ini berfungsi untuk melarutkan pellet.
Pendiaman ini dilakukan dengan tujuan agar reaksi berjalan dengan sempurna,
sehingga pellet benar-benar telah larut.Glukosa dapat berperan sebagai buffer
yang dapat mempertahankan pH. Larutan EDTA dapat menghambat DNAse.
Enzim DNAse merupakan enzim yang dapat mendenaturasi DNA. Larutan EDTA
dalam larutan buffer berperan sebagai agen pengkelat yang digunakan untuk
mengikat ion logam Ca2+ dan Mg2+. Logam ini merupakan kofaktor dari DNAse.
Kofaktor tersebut akan berikatan dengan EDTA membentuk kompleks. Kofaktor
yang berinteraksi dengan EDTA dalam buffer akan mengganggu kerja DNAase.
Keberadaan enzim DNAase sangat merugikan karena akan mengganggu proses
isolasi DNA pET-endo. Hal tersebut akan memberikan kemungkinan yang sangat
kecil untuk terjadinya degradasi pada DNA yang akan diisolasi pada praktikum
kali ini. Tris-HCl berfungsi untuk menjaga pH larutan.Pellet dilarutkan atau
dihomogenkan dengan cara dikocok kemudian diketuk-ketuk selanjutnya
didiamkan agar reaksi atau proses isolasi dapat berlangsung dengan sempurna.
Pellet yang telah tersuspensi kemudian ditambahkan larutan II(NaOH 0,2
M, SDS 1%, ddH2O steril) sebanyak 200 µL dan dihomogenkan dengan cara
membolak-balik tabung Eppendorf. Penambahan ini dapat digunakan untuk
melisiskan dinding sel. SDS dapat merusak membran sel bakteri. Membran sel
yang akan dilisis yaitu pada bagian fosfolipid (lemak) dan protein. Komponen
penyusun sel akan keluar dari dalam sel ketika membrane sel telah mengalami
kerusakan. Penambahan NaOH pada larutan II berfungsi untuk membuat sistem
dalam kondisi basa pada kisaran pH 12,0-12,5. Hal ini dikarenakan dengan
adanya perubahan pH akan menyebabkan proses denaturasi pada DNA kromosom
dan pET-endo dalam sel bakteri E. coli TOP10. Ikatan hidrogen yang ada pada
DNA kromosom maupun pET-endo akan terputus dalam suasan pH tersebut. Hal
tersebut akan membuat rantai double helix pada DNA akan terbuka dan
membentuk single helix. Campuran kemudian dihomogenkan dan diinkubasi
selama 15 menit. Inkubasi pada proes tersebut berfungsi untuk melihat
pertumbuhan atau perkembangbiakan pada mikroorganisme.
pET-endo yang mengalami denaturasi harus direnaturasi karena pET-endo
merupakan produk yang akan diisolasi. Proses renaturasi pET-endo dilakukan
dengan penambahan larutan III yang terdiri atas kalium asetat, asam asetat glasial,
dan ddH2O dingin lalu diinkubasi dalam es selama 10 menit. Penambahan larutan
III untuk mempertahankan agar pH DNA plasmid tidak rusak. Kondisi larutan
yang awalnya basa kemudian berubah menjadi kondisi netral. Kalium asetat dapat
membantu terjadinya renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA
karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar
garam yang tinggi, kemudian diinkubasi selama 10 menit. Proses renaturasi pada
pET-endo berlangsung secara sempurna. Hal ini dikarenakan struktur pET-endo
yang merupakan DNA plasmid adalah sirkular, sedangkan pada DNA kromosom
berbentuk linear yang menyebabkan proses renaturasinya berlangsung secara
tidak sempurna (acak dan tidak beraturan). Proses pemisahan pET-endo dapat
dilakukan dengan cara sentrifuse. Proses sentrifugasi dilakukan kembali dengan
12000 rpm setelah penambahan larutan III. Hasil yang diperoleh yaitu larutan
membentuk 2 fase dimana pada bagian atas (supernatan) dan bawah berupa
larutan tidak berwarna (pellet) dan bagian tengan berupa lapisan tipis emulsi.
Pemisahan ini dapat terjadi karena adanya perbedaan berat molekul yang
signifikan diantara keduanya. DNA kromosom berada pada bentuk pellet karena
memiliki berat molekul yang besar, sedangkan pET-endo berada dalam
supernatant dengan berat molekul yang lebih kecil. Hasil pelletnya disimpan dan
supernatannya diambil. Supernatan yang diperoleh tidak berwarna. Hal tersebut
menunjukkan bahwa telah terjadi pengendapan secara sempurna sehingga tidak
mencemari supernatan. Perlakuaan ini dilakukan pada suhu 4 °C karena pada suhu
ini proses pemisahan atau proses reaksi berlangsung dengan sempurna.
Supernatan dipindahkan secara perlahan dengan menggunakan pipet
kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol :
kloroform : isoamilalkohol (25:24:1) sebanyak 1 kali volume total. Penambahan
ini bertujuan untuk menghilangkan protein dan pengotor-pengotor lain dalam
larutan. Pelarut organik akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein
sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA. Campuran kemudian
dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit
menghasilkan 3 lapis. Lapisan fasa paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah
adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair. Bagian atas
merupakan supernatan, kemudian dipindahkan dengan cara mempipet secara hati-
hati dalam tabung eppendorf baru yang steril, kemudian dipekatkan dengan
menambahkan etanol absolut dingin. Fungsi penambahan etanol absolut yaitu
untuk untuk mengendapkan plasmid karena adanya perbedaan
polaritas.Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada keadaan dingin dengan
tujuan agar banyak DNA plasmid yang mengendap.Prinsip pengendapan dengan
menggunakan etanol absolut dingin, yaitu pada saat penambahan garam yaitu Na-
asetat yang berfungsi sebagai penetral muatan pada gula fosfat DNA, maka ion-
ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika
di dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negatif (DNA) masih
lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Air memiliki
konstanta dielektrik yang tinggi, sehingga penambahan pelarut organik seperti
etanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan
DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.
Langkah selanjutnya adalah diinkubasi selama 1 jam dan disentrifugasi
kembali menghasilkan pellet dalam jumlah yang sangat sedikit. Supernatan
dibuang dan dilakukan penambahan etanol 70% pada pellet. Fungsi penambahan
etanol adalahuntuk menghilangkanpengotor (sisa-sisa larutan yang digunakan
untuk mengendapkan plasmid sebelumnya) sehingga diperoleh plasmid yang
murni. DNA dalam alkohol akan menggumpal sedangkan DNA dalam air akan
larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Proses terakhir yang disebut
dengan tahap presipitasi. Tahap presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein
histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan
dengan protein histon, menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat
terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung. Tabung
eppendorf dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan
didiamkan selama 5 menit, kemudian pellet dilarutkan dalam 30 uL ddH2O.

4.2.2 Isolasi DNA kromosom isolat

Perlakuan yang kedua yaitu mengisolasi DNA kromosom isolat. Koloni
isolat diinokulasikan ke dalam 5 ml media cair dan diinkubasi pada shaker
incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Inokulasi
merupakan kegiatan pemindahan DNA dari tempat atau sumber asalnya ke
medium baru yang telah dibuat dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi dan
aseptis. Alat shaker incubatorberfungsi untuk mengocok suatu campuran bahan
kimia yang memerlukan temperatur dan kecepatan (rpm) konstan, biasanya
digunakan untuk maserasi dan inkubasi mikroba. Suspensi sebanyak 5 ml
disentrifuse selama dua menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 oC.
Perlakuan ini dilakukan untuk memisahkan pellet dan supernatan, dimana pellet
yang dihasilkan akan digunakan untuk bahan isolasi, sedangkan supernatannta
dibuang. Suhu yang digunakan yaitu 4oC karena DNA akan bekerja optimal pada
suhu tersebut. Kegiatan ini dilakukan oleh asisten.
Tahap pertama yang dilakukan yaitu pellet diresuspensi dengan 250 µl
buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA). Resuspensi merupakan
kegiatan yang mengesuspensi pellet kembali. Suspensi merupakan suatu
campuran fluida yang mengandung partikel padat. Buffer TE berfungsi untuk
melarutkan DNA dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Buffer TE
mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion
Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas berbagai enzim
nuclease, sedangkan Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga
pada pH nya. Larutan kemudian dibekukan pada suhu suhu -20oC selama 30
menit. Pembekuan ini dilakukan dengan tujuan agar prosesnya dapat berlangsung
dengan cepat, karena proses isolasi DNA akan optimum pada suhu tersebut.
Campuran kemudian ditambahkan 250 µL lisozim 10mg/ml ke dalam sel beku
dan dibiarkan mencair pada suhu kamar agar lisozim dapat bereaksi dengan semua
komponen yang terdapat dalam tube. Lisozim ini dapat menurunkan dinding sel
DNA. Larutan sel yang sudah mencair dimasukkan ke dalam penangas es selama
45 menit agar larutannya membeku. Larutan sel kemudian ditambahkan larutan
STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50µL ke dalam
suspensi dan dicampur rata. Penambahan SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8 memiliki
fungsiyang sama dengan tahap sebelumnya, sedangkan penambahan proteinase K
berfungsi sebagai enzim yang dapat merusak protein kemudian divortex agar
homogen. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 50oC
selama 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan dengan tujuan untuk
mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.
 Larutan kemudian ditambahkan 300µL larutan fenol jenuh lalu dikocok
sampai terbentuk emulsi. Hasil yang diperoleh yaitu terbentuk 2 fasa dan terdapat
emulsi. Fenol seringkali dapat digunakan sebagai pendenaturasi protein. Ekstraksi
dengan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami
presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi.
Proses pengocokan ini dilakukan agar larutan lebih homogen dan mempercepat
terbentuknya emulsi. Campuran kemudian dipisahkan dengan sentrifuse sehingga
membentuk dua lapisan, dimana bagian bawah dan atas larutan merupakan larutan
tidak berwarna dan ditengah terdapat emulsi tipis berwarna putih. Lapisan atas
merupakan lapisan yang mengandung DNA. Hal ini terjadi karena DNA memiliki
berat molekul yang lebih rendah sehingga terdapat pada lapisan atas. Lapisan atas
kemudian dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang steril. Selanjutnya
ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total
hasil pemipetan DNA, lalu dicampur perlahan, kemudian ditambahkan etanol
absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian tabung dibolak-balik
untuk pencampuran. Perlakuan ini dilakukan dengan tujuan memekatkan DNA.
Pemekatan DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari larutan sehingga diperoleh
konsentrasi yang lebih tinggi. Cara sederhana dan murah untuk memisahkan DNA dari
larutan dapat dilakukan dengan presipitasi etanol. Proses presipitasi etanol umumnya dapat
dibantu dengan penambahan garam, sehingga DNA akan terpresipitasi dan dapat dipeletkan
dengan sentrifugasi. Etanol berfungsi sebagai pelarut polar. Molekul air memiliki muatan
negatif parsial di sekitar atom oksigennya, dan muatan positif parsial di sekitar atom
hidrogennya. Oleh karena itu DNA yang bermuatan negatif dapat berinteraksi dengan
molekul air, dan larut di dalamnya. Garam berfungsi untuk menetralkan muatan pada
kerangka gula fosfat. Garam yang umum dipakai adalah sodium asetat.
Campiran kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama 2 jam sampai
semalam agar pemekatan DNA yang dilakukan terjadi secara sempurna.
Campuran disentifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit. Sentrifugasi dilakukan
dengan tujuan agar dapat memisahkan antara pellet dan supernatan. Hasil yang
diperoleh setelah disentrifugasi yaitu terdapat sedikit pelet didasar eppendorf.
Supernatan yaang diperoleh dibuang karena bukan merupakan bahan yang
diinginkan saat isolasi, serta jika tidak dibuang maka akan mengganggu proses
isolasi. Pellet kemudian dicuci dengan 0,6 ml etanol 70%. Hasil yang diperoleh
yaitu pelet terdapat pada dinding tabung. Pencucian ini dilakukan dengan tujuan
agar dapat memperoleh jumlah pellet yang banyak. Sentrifuge kembali campuran
pada 12000 rpm selama 5 menit agar dapat memisahkan pellet dengan supernatan.
Pelet yang diperoleh diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH2O.Larutan
ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan
diperoleh dengan konsentrasi yang cukup tinggi.

4.2.3 Analisa pET-Endo menggunakan elektroforesis gel agarosa

Keberhasilan isolasi dapat diketahui dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa. Elektroforesis gel agarosa merupakan suatu teknik pemisahan
berdasarkan muatan dan ukuran molekul dengan menggunakan medan listrik
(Holme dan Peck, 1998). Proses elektroforesis dibantu dengan adanya kekuatan
medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang berisi sampel DNA. Aliran
listrik yang diberikan pada sel agarosa akan menyebabkan aliran elektron
bergerak dari sisi negatif menuju ke sisi positif. Kecepatan molekul yang bergerak
pada medan listrik dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran molekul DNA,
konsentrasi gel, densitas muatan, pori-pori gel, dan tegangan listrik yang
diberikan. Gel agarosa digunakan karena memiliki keuntungan yaitu tekniknya
relatif sederhana dan penanganannya mudah. Gel agarosa mempunyai
kemampuan untuk memisahkan DNA dengan range ukuran 70 pb sampai 800.000
pb. Elektroforesis dengan gel agarosa dijalankan secara horisontal inilah
perbedaannya dengan elektroforesis poliakrilamid yang dijalankan secara vertikal.
Gel agarosa 1,5% dibuat dengan melarutkan 0,375 g agarosa dalam 25 ml
buffer TAE (Tris Acetat EDTA) pH 8. Fungsi buffer bukan hanya untuk menjaga
pH agar tetap stabil, tetapi juga sebagai sumber ion untuk mendukung
konduktivitas. Gel agarosa dibuat untuk mempermudah molekul fragmen DNA
bergerak karena adanya perbedaan kekuatan ionik. Elektroforesis gel agarosa
berfungsi untuk analisis protein dan fragmen kecil asam nukleat dengan ukuran
sampai 350.000 Dalton (500 bp). Gel agarosa mempunyai pori yang kecil,
sehingga tidak cocok dengan molekul asam nukleat yang berukuran besar atau
molekul DNA utuh. Agarosa yang sudah larut didinginkan sampai kira-kira
temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan
memadat. Tujuannya yaitu agar agarosa memadat dan dapat digunakan sebagai
media untuk melangsungkan elektroanalisis. Gel yang sudah terbentuk
dimasukkan ke alat elektroforesis kemudian ditambahkan running buffer. Running
buffer ditambahkan agar pergerseran gel semakin mudah saat dilakukan
elektroforesis. Sampel yang akan dielektrolisis dicampur dengan buffer yang
mengandung bromofenol biru (BPB) 0,25 (b/v) dan sukrosa 40 % (b/v).
Bromofenol biru ini dapat digunakan sebagai pewarna DNA sehingga dapat
digunakan untuk menentukan pergerakan DNA dalam agarosa. Elektrolisis
dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 volt. Pemberian voltase pada
proses elektroforesis mempengaruhi kecepatan dari pergerakan molekul DNA,
dimana semakin tinggi voltase yang diberikan maka semakin cepat dan mudah
molekul DNA beregarak. Molekul DNA terdapat gugus pospat yang bermuatan
negatif sehingga akan bergerak menuju area yang bermuatan positif. Ukuran DNA
yang kecil akan mudah bergerak sehingga migrasi lebih cepat dibandingkan
dengan DNA berukuran besar.
Proses running elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru bermigrasi
sampai ujung gel. Gel agrosa kemudian direndam dalam EtBr selama 3-5 menit.
EtBr disini berfungsi sebagai pewarna dimana zat ini nanti akan berinteraksi
dengan molekul DNA yang bersifat basa dan akan memunculkan warna orange
flouresance ketika disinari lampu UV. EtBr akan menginterkalasi diantara 2 untai-
untai DNA yang berpendar, sehingga muncul fragmen DNA yang memisah sesuai
ukurannya. Fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan adalah sebagai berikut:
 a b
Gambar 4.1. a) DNA plasmid, b) DNA kromosom
Hasil diatas menunjukkan bahwa DNA Kromosom yang dihasilkan
memiliki dua pita dan terlihat dengan jelas, sedangkan pada DNA plasmid buram
karena adanyanya insident listrik yang mati sehingga dapat mempengaruhi proses
elektroforesis. Dua pita ini menunjukkan adanya 2 DNA yang memiliki berat
molekul yang berbeda. Ukuran DNA dari hasil isolasi tidak dapat ditentukan
karena pada saat percobaan tidak menggunakan Marker. Marker merupakan
standart ukuran DNA dimana segmen-segmen DNA telah diketahui ukurannya
secara spesifik. Marker akan menjadi acuan untuk menentukan ukuran DNA hasil
isolasi.
Perbedaan DNA plasmid dan DNA kromosom adalah DNA plasmid
umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan
mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom
jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang
sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan
terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena
itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan
DNA kromosom. Selain itu, DNA plasmid berukuran lebih kecil dibanding DNA
kromosom. Dua perbedaan tersebut membuat DNA plasmid dan DNA kromosom
dapat dipisahkan (Boyer, 1993). Proses renaturasi yang terjadi pada DNA
kromosom terjadi secara acak dan tidak beraturan sedangkan renaturasi pET-Endo
terjadi secara sempurna karena struktur pET-Endo yang berupa sirkular. DNA
kromosom memiliki berat molekul yang lebih tinggi dibandingkan pET-Endo
sehingga untuk memisahkan keduanya dapat dilakukan sentrifuse. Sentrifuse
menghasilkan 2 fase yaitu supernatan dan pellet. pET-Endo yang lebih ringan
dibanding DNA kromosom berada pada supernatan sedangkan DNA kromosom
berada pada pellet.

BAB V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dalam praktikum isolasi DNA kromosom dan plasmid yaitu,
1. Isolasi DNA kromosom dan plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan
beberapa reagen larutan. Larutan ini dapat digunakan untuk merusak (lisis)
sel. DNA yang telah diisolasi kemudian diuji dengan menggunakan teknik
elektroforesis dimana akan menghasilkan DNA yang memiliki 2 pita (DNA
kromosom), sedangkan DNA plasmid yang dihasilkan buram.
2. DNA kromosom dan plasmid memiliki bentuk yang berbeda dan berat
molekul yang berbeda cukup siginifikan. DNA palsmid memiliki struktur
 tersieryang kaku, sedangkan DNA kromosom berbentuk longgar. DNA ini
dapat dipisahkan dari proses renaturasi dan sentrifugasi.

5.2 Saran
Saran untuk praktikum isolasi DNA kromosom dan plasmid adalah
praktikan harus lebih disiplin selama melakukan percobaan di laboratorium.
Praktikan harus mengusai materi dan prosedur kerja dengan baik untuk
mendapatkan hasil praktikum yang sesuai dan baik serta dapat meminimalisir
terjadinya keasalah. Praktikan harus menggunakan lab safety use dan
memperatikan SOP untuk menghindari kesalahan dan kecelakaan kerja serta
untuk mendapatkan data yang benar.

DAFTAR PUSTAKA

Campbell, Jane B. Reece & Lawrence G. Mitchell. 2004. Biology- 10th

I'd. USA:Pearson Eduaction Inc.
Cooper. 2000. The Tools of Biochemistry. USA: John Wiley and Sons.
Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 2005. Molekuler Biotechnology, Principles and
applications of Recombinan DNA. Washinton D.C : ASM Press.
Goodenough.1988. Understanding DNA. Amsterdam: Academic Press.
Jack, R.C. 1995. Basic Biochemical Laboratory and Computing. New York:
Oxford University Press.
Kusuma, S.R.F. 2010. PCR. Makalah Fak. Farmasi. Bandung: Universitas
Padjadjaran.
Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Edisi pertama. Jakarta: Erlangga.
Mader, S. S. 1993. Biologi. Lowa : WM. C Brown Publisher.
Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.
Sambrook J., E. F. Fritcs and Manicitis, T. 1989. Molecular Kloning: A
Laboratory Manual. 2nd Edition. Old spring Harbor Laboratory Press.
USA.
Standfield W.D., Jaime S.C., Raul J.C. 2006. Schaum’s Easy Outline Biologi
Molekuler dan sel. Penerjemah: Varian Fahmi, terjemahan dari: Schaum’s
Easy Outline Molecular and Cell Biology. Jakarta: Erlangga.
Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik
Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi,
IPB.
Suryo, 2004. Genetika Manusia.Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag
Publisher ISBN 3-540-66678-8.