LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKUL

ISOLASI DNA PLASMID

Disusun Oleh :
Kelompok :6
Nama Anggota : -Nadila Anggraini S. (171810301001)
-Muhammad Qosim A. H. (171810301018)
-R. Aj. Irma K. A (171810301026)
-Nurul Afifah F. (171810301030)
-Leyla Novita B. (171810301037)

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2019
 BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung
materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh
bentuk kehidupan secara seluler, sehingga DNA ini sangat penting dalam
kehidupan manusia. DNA mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu
generasi ke generasi selanjutnya. DNA secara keseluruhan dalam sel akan
membentuk genom (Suryo, 2004). DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan
kloroplas. DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan
protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular
(DNA plasmid) dan tidak berasosiasi dengan protein histon. DNA mitokondria
dan kloroplas hanya dapat mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. DNA
Plasmid atau plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal merupakan molekul DNA
pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan
dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri (Glick, 2005).
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA
dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. DNA memiliki beberapa
fungsi sekaligus yaitu sebagai pembawa informasi genetik, berperan dalam
menduplikasi diri dan dalam pewarisan sifat, sebagai ekspresi informasi genetik,
pengarah sintesis RNA pada sebuah proses kimia atau transkripsi, kode untuk
pengaktifan protein dan penonaktifan gen serta untuk membuat protein. Teknik
isolasi DNA ini perlu dilakukan agar DNA yang akan digunakan sebagai
penelitian dalam keadaan yang lebih murni, sehingga dapat menganalisis sifat
atau karakter dari DNA yang diisolasi. Isolasi DNA saat ini banyak digunakan
dalam medis yaitu analisis genetik dan forensik, selain itu isolasi DNA juga dapat
digunakan dalam bidang kultur tanaman dan pertanian untuk menghasilkan
varietas baru dan unggul.
 Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA. Isolasi DNA juga dapat dilakukan melalui sentrifugasi, dimana
teknik ini dilakukan berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
memiliki berat molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung, sedangkan
molekul yang berat molekul lebih besar akan berada pada bagian bawah tabung.
Hasil sentrifugasi akan menghasilkan dua macam fraksi yaitu supernatan pada
bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Glick, 2005). Metode yang dilakukan
untuk mengisolasi DNA tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA
juga harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA
(Surzycki, 2000).

1.2 Tujuan
Adapun rumusan masalah dari percobaan ini adalah:
1. Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA Plasmid
2. Memahami dan mengetahui berat molekul DNA Plasmid.

1.3 Manfaat
Adapun manfaat dari percobaan ini adalah:
1. Mahasiswa dapat melatih kemampuan untuk mengisolasi DNA plasmid.
2. Mahasiswa dapat mengetahui berat molekul DNA plasmid.
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Asam Nukleat

Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang
tersusun dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan
fosfodiester. Asam nukleat yang paling umum adalah asam deoksiribonukleat
(DNA) dan asam ribonukleat (RNA). Asam nukleat ditemukan pada semua sel
hidup serta pada virus. Asam nukleat dibedakan menjadi dua, berdasarkan jenis
gula yang terdapat pada rantai asam nukleat. Asam nukleat yang pertama yaitu
DNA yang memiliki gula deoksiribosa, sedangkan asam nukleat yang kedua yaitu
RNA yang memiliki gula ribosa. Basa nitrogen yang ditemukan pada kedua jenis
asam nukleat tersebut juga memiliki perbedaan yaitu basa nitrogen pada DNA
diantaranya adalah adenin, guanin, sitosin, dan timin, sedangkan basa nitrogen
pada RNA diantaranya adalah adenin, guanin, sitosin, dan urasil (Muladno, 2002).
Asam nukleat berfungsi sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan
informasi genetik. Informasi ini diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui
proses replikasi. Asam nukleat terdapat pada semua sel hidup dan bertugas untuk
menyimpan dan mentransfer genetik, kemudian menerjemahkan informasi ini
secara tepat untuk mensintesis protein yang spesifik bagi masing-masing sel.
Asam nukleat memiliki peranan penting, diantaranya adalah:
1. Menyimpan, mentransmisi, dan mentranslasi informasi genetik;
2. Metabolisme antara dan reaksi-reaksi informasi energi;
3. Koenzim pembawa energi;
4. Koenzim pemindah asam asetat, zat gula, senyawa amino dan biomolekul
lainnya;
5. Enzim reaksi oksidasi dan reduksi.
(Goodenough, 1988).
2.2 Deoxyribose Nucleid Acid (DNA)
DNA (deoxyribonucleic acid) merupakan tempat penyimpanan informasi
genetik. DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan
merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan pada keturunannya.
Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa
nukleotida dan menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologi suatu jasad. DNA
organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier yang terletak dalam inti sel,
sedangkan organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular dan terletak
dalam sitoplasma (Campbell.dkk, 2004). DNA disusun dari nukleotida dimana
antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan
ikatan fosfat. Ikatan fosfat tersebut sangat kuat dan biasanya dikenal sebagai
ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat (PO4-) pada
sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga dinamakan asam nukleat
(Goodenough, 1988).
DNA dalam organisme hidup, biasanya ditemukan dalam bentuk
berpasangan dan terikat kuat. Dua unting DNA saling berpilin membentuk heliks
ganda. Heliks ganda ini distabilisasi oleh dua ikatan hidrogen antar nukleotida dan
interaksi tumpukan antar nukleobasa aromatik. DNA dalam lingkungan sel yang
berair, ikatan π konjugasi antar basa nukleotida tersusun tegak lurus terhadap
sumbu pilinan DNA, hal ini meminimalisasi interaksi dengan cangkang solvasi,
dan sehingganya menurunkan energi bebas Gibbs (Jack, 1995).
DNA dapat mereplikasi diri melalui tiga cara yaitu sebagai berikut

Gambar 2.1 Replikasi DNA

(Sumber : Jack, 1995)
1. Semi konservatif
Semi konservatif yaitu apabila dua pita spiral dari “double helix”
memisahkan diri dan setiap pita tunggal dari 'double helix' parental
membentuk pita pasangan yang baru.
2. Konservatif
Konservatif yaitu rantai double helix parentalnya tetap utuh, dan semuanya
dapat mencetak double helix yang baru.
3. Dispersif
Dispersif yaitu kedua pita double helix parental terputus-putus membentuk
segmen-segmen. Segmen-segmen DNA parental dan segmen-segmen DNA
yang baru saling bersambungan dan membentuk dua double helix baru.
(Jack, 1995).
DNA yang menyusun kromosom dan plasmid pada bakteri diselimuti oleh
suatu dinding sel dan pada virus diselimuti oleh protein tertentu. Organisme
prokariot mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA
yang bentuknya sirkular dengan ukurannya jauh lebih kecil dibanding dengan
kromosom. Plasmid dapat memperbanyak diri dengan cara bereplikasi. Plasmid
pada umumnya digunakan dalam rekayasa genetik. Teknologi DNA rekombinan
menggunakan E. Coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid
sering digunakan sebagai pembawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam
suatu sel inang (Stanfield, 1996).
Plasmid bertindak sebagai DNA ekstrakromosomal, yaitu molekul DNA
pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan
dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri. Plasmid mempunyai titik ori
(origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari
DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid
tereplikasi, berbagai tipe plasmid telah ditemukan pada sel bakteri. Distribusi
plasmid pada bakteri bersifat sporadis karena ada bakteri yang mengandung
plasmid tetapi ada juga yang tidak, misalnya pada sel E.coli terdapat plasmid F
yang menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat konjugatif tertentu. Plasmid F
biasa digunakan sebagai vector untuk membawa DNA yang akan disisipkan pada
genom sel target. Plasmid juga merupakan alat yang efisien untuk
mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi yang sangat banyak per selnya
(Lehninger, 1982).
 Plasmid dibagi menjadi beberapa macam berdasarkan fungsinya,
diantaranya adalah sebagai berikut :
1. Fertility- F plasmids, merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel
ke sel bakteri lain untuk proses konjugasi. Plasmid ini juaga mempunyai
kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik yang terdapat dalam plasmid
ataupun dalam kromosom. Plasmid ditemukan antara lain pada Eschericia coli,
Pseudomonas, dan Streptomyces.
2. Resistance- R plasmids, mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik
atau racun dan inhibitor pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada
Staphylococcus.
3. Plasmid penyandi bacteriocins. Bacteriocins adalah senyawa yang
diproduksi oleh bakteri untuk menghambat pertumbuhan atau bakteri lain yang
spesises atau galurnya berbeda. Plasmid ini mengandung gen struktural
bacteriocins ataupun gen yang mengkode protein yang berperan dalam
pemrosesan dan transport bacteriocins. Penamaan plasmid ini tergantung pada
organisme yang memproduksinya. Misalnya plasmid Col pada bakteri Escherichia
coli yang mengkode colicins.
4. Degradative plasmids, merupakan plasmid yang mampu mencerna substansi
yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat.
5. Virulence plasmids, merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut
patogen.
(Lehninger, 1982).
2.3 Fungsi dan Struktur DNA
Struktur DNA merupakan struktur double helix. Dua rantai nukleotida dari
DNA dihubungkan oleh pasangan basa. Helai memiliki arah yang berlawanan dan
dipelintir menjadi bentuk heliks. DNA memiliki fungsi sebagai tempat
penyimpanan informasi genetik, memberikan ciri khas dari struktur protein dan
struktur RNA pada setiap spesies organisme. DNA merupakan bahan yang bisa
diwariskan pada semua sel dan dapat bereplikasi pada setiap generasi sel. DNA
berguna untuk membuat program dengan menempatkan biosintesis sel dan
jaringan secara teratur. DNA digunakan untuk menentukan aktivitas organisme
sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan sifat spesifik dari organisme
tertentu. (Lehninger, 1982).
Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang
basa nukleotida. Tiga struktur DNA meliputi struktur primer, struktur sekunder,
dan struktur tersier. Struktur primer dari DNA disusun oleh urutan linear
nukleotida. Nukleotida dihubungkan satu sama lain dengan sambungan
fosfodiester (ikatan yg menghubungkan antara gugus hidroksil pada posisi 5 gula
pentose dg gugus hidroksil nukleotida berikutnya). Nukleotida terbentuk dari satu
gula pentose (2-deoksi-D-ribosa), satu basa nitrogen yang meliputi purin (adenin,
guanin) dan pirimidin {sitosin, timin (hadir dalam DNA saja), urasil (hadir dalam
RNA saja)} dan satu molekul fosfat. Nukleotida membentuk hubungan
fosfodiester antara 5 'dan 3' atom karbon untuk membentuk asam nukleat. Arah
rantai DNA dari ujung 5’ bebas menuju gugus hidroksil 3’ bebas (Kusuma,
2010).Struktur sekunder Salah satu sifat biokimia DNA yang menentukan
fungsinya sebagai pembawa informasi genetik adalah komposisi basa penyusun.
dari DNA berupa double helix, dimana dua untai polinukleotida secara anti
parallel berpilin ke kanan dan melingkari sumbu. Nukleotida yang merupakan
penyusun DNA terdiri atas tiga gugus molekul yaitu gula dengan 5 karbon (2-
deoksiribosa), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen penyusun DNA
adalah golongan purin dan golongan pirimidin. Basa purin dibagi menjadi dua
yaitu adenin (A) dan guanin (G) (Kusuma, 2010).

Gambar 2.2 Struktur basa nitrogen dalam DNA

(Sumber: Kusuma, 2010).
Struktur tersier dari DNA paling umum ditemukan pada virus dan
mitokondria. DNA virus dan DNA mitokondria merupakan molekul lingkar.
Struktur DNA tersier berbentuk lingkaran. Lingkaran terbentuk karena dari kedua
untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak berujung.
Konformasi ini terjadi karena kedua untai polinukleotida membentuk struktur
tertutup yang tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang diisolasi dari
bakteri, virus dan mitokondria seringkali berbentuk superkoil, selain itu DNA
dapat berbentuk molekul linier dengan ujung-ujung rantai yang bebas (Kusuma,
2010).

Gambar 2.3 Molekul DNA

(Sumber: Kusuma, 2010)
2.4 Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah proses untuk mendapatkan DNA murni dari makhluk
hidup yang berguna untuk keperluan bioteknologi. Isolasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak,
dan karbohidrat. Isolasi DNA secara spesifik yang mencangkup gen tertentu
dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu:
1. Isolasi DNA genom dan dilanjutkan pemotongan DNA genom
menggunakan enzim endonuklease retriksi.
2. Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil transkripsi gen yang dimaksud
kemudian dilanjut dengan membuat turunan (Complementery
DNA/cDNA),
3. Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut (membuat gen
sintetik) dengan teknik sintesis kimiawi.
4. Melakukan implifikasi DNA dengan teknik (Polimerase Chain Reaction).
(Campbell,2004)
 Isolasi Dna merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat
digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNA bisa di isolasi dari
berbagai sel yang memiliki inti sel. DNA terletak di dalam inti sel. beberapa
sumber DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA dapat menggunakan
beberapa sumber DNA yaitu urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan lainya
(Lehninger,1982)
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA. Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan
sentrifugasi, dimana metode ini didasarkan pada berat molekul komponen-
komponen yang dipisahkan. Teknik isolasi DNA yang sangat sederhana adalah
metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang
biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim)
untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah
nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur (Cooper,2000)
2.4.1 Isolasi DNA Plasmid
DNA plasmid merupakan tempat untuk kloning gen. Hal yang bharus
dilakukan pada isolasi DNA plasmid yaitu DNA plasmid harus dipisahkan dari
DNA kromosom bertujuan untuk mempermudah untuk mendapatkannya. DNA
plasmid ukurannya sangat kecil, berbeda dengan DNA kromosom yang ukurannya
besar. Pemisahan dari DNA plasmid perlakuannya berbeda dengan pemisahan
dari DNA kromosom. Membran sel dipecah dengan menambahkan detergen.
DNA kromosom akan dibebaskan dalam proses pemecahan ini, serta akan
membebaskan DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lainnya. Potasium
kemudian ditambahkan pada Hasil proses lisis yang bertujuan untuk
mengendapkan DNA kromosom dan protein. Pemisahan dari Endapan DNA,
protein, dan potasium dilakukan dengan teknik sentrifugasi. Supernatan yang
mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang diambil untuk dipisahkan dari
DNA plasmid. Degradasi RNA dan protein dilakukan dengan menambahkan
Rnase dan protese. Proses terakhir adalah menambahkan etanol untuk
mengendapkan DNA plasmid (Cooper, 2000).
 Kuantitas dari DNA dicerminkan berdasarkan berat molekul bukan oleh
volume. Kuantitas dari DNA diketahui dengan dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang 256 nm atau 260 nm. Kualitas
hasil isolasi dari DNA berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan
protein. Nilai absorbansi dapat diubah menjadi konsentrasi pada panjang
gelombang 260 nm (nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml)
(Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Prinsip dari Elektroforesis gel agrosa berdasarkan pergerakan dari molekul
bermuatan pada media penyangga matriks stabil, yaitu gel agarosa atau
poliakrilamid. Pergerakan molekul dari proses tersebut di bawah pengaruh medan
listrik. Fungsi dari proses ini untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang
ukurannya >100 pb (berjalan secara horizontal). Elektroforesis poliakrilamid
merupakan jenis lain dari elektroforesis. Jenis ini biasanya digunakan untuk
memisahkan DNA yang berukuran 1 pb (berjalan secara vertikal). Skuens DNA
ditentukan dengan elektroforesis poliakrilamid (Muladno, 2002)
2.4 Elektroforesis
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan yaitu agarosa, gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel
DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul
DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui
matriks gel menuju kutub positif (anode). Ukuran molekul semakin besar maka
menandakan semakin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui
ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromida.
Elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan
fragmen DNA (Wibowo, 2010). Contoh Pita DNA setelah elektroforesis dapat
diamati pada sinar UV :
 Gambar 2.1 Pita DNA setelah elektroforesis pada sinar UV
(Sumber : Glick dan Pasternak, 2005).
Elektroforesis terdiri dari dua jenis yaitu elektroforesis kertas dan
elektroforesis gel. Elektroforesis kertas yang terdiri dari kertas sebagai fase diam
dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion
kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang
sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau
valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi
elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas dan adsorpsivitas (penyerapan) zat terlarut.
Elektroforesis gel adalah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam
untuk memisahkan molekul-molekul. Elektroforesis gel ini awalnya dilakukan
dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) yang digunakan untuk memisahkan
biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Elektroforesis gel dapat
berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media
(Glick dan Pasternak, 2005)
 BAB III. METODELOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
- Mikropipet
- Tabung eppendorf
- Beaker glass
- Erlenmeyer
- Sentrifuse
- Shaker incubator

3.1.2 Bahan
- Larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH
8) 100 µL
- Larutan II (NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O steril)200 µL
- Larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)150 µL
- Campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol (25:24:1)
- Etanol absolut
- Etanol 70%
- ddH2O
- Koloni tunggal transforman E.Coli(inokulum)
- Gel agarosa 1,5%
- Buffer TAE
- Larutan Etidium Bromida (EtBr) 250 µg/mL
 3.2 Diagram Alir
3.2.1 Isolasi DNA Plasmid
Koloni tunggal

- diinokulasi
- diinkubasi 37oC
- disentrifugasi
- Larutan I
supernatan pellet

ditambahkan Larutan II

Larutan III

- disentrifugasi

pellet Supernatan ditambahkan campuran fenol :

kloroform:isoamil
alkohol
- dikocok dan sentrifugasi

Fase bawah Fase tengah Fase atas (cair)

- dipekatkan
- dinkubasi
- disentrigugasi

Supernatan pellet
- dicuci etanol dingin 70%
- disentrifugasi

Supernatan pellet
- dilarutkan dalam 20 mL ddH2O

Hasil
3.2.2 Elektroforesis
Agarosa Buffer TAE

- didinginkan
Sampel DNA
- dituangkan
- dicampur dengan
- dipadatkan
buffer BTB dan
sukrosa
- dimasukkan
Gel Agarosa

- dielektroforesis
- direndam dalam EtBr
- direndam dalam buffer TAE
- diamati dengan sinar UV

Pita-pita DNA

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Isolasi DNA Plasmid
Koloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 mL media Luria
Bertani cair yang mengandung 2.5 L kanamisin 100mg/ml dan diinkubasi pada
shaker incubator pada suhu 37°C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam.
Inokulum disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu
4°C, pellet dilarutkan dalam larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2.5 Mm Ph 8,
Na2EDTA 10 mM Ph 8) 100 L dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit.
Ditambahkan 200 L larutan II (NaOH 0.2 M, SDS 1%, ddH2O steril) dan
dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung eppendorf. Larutan diinkubasi
di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 L larutan III (kalium
asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), diinkubasi dalam es selama 10
menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000
rpm, supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan dengan menggunakan
pipet ke dalam tabung eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran
fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai
terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm selama 2 menit.
Dihasilkan 3 lapis, fasa paling atas adalah fasa cair, fasa cair dipindah dengan
cara memipet secara hati-hati ke dalam tabung eppendorf baru yang steril, fasa
cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume
total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm
selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol dingin 70% dan disentrifugasi lagi dan
tabung eppendorf dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan
didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 20 L ddH2O.

3.3.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Gel agarosa 1,5% dibuat dengan melarutkan 0,375 gram agarosa dalam 25
mL buffer TAE (Tris-asetat EDTA) pH 8. Setelah agarosa terlarut dan
didinginkan sampai kira-kira temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada
cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur
dengan buffer yang mengandung bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40%
(b/v). Elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 Volt.
Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3
dari panjang gel. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan buffer EtBr 250
g/mL selama 30 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10
menit. Hasil elektroforesis dapat diamati dengan sinar UV.
 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
No Perlakuan Hasil Gambar
.
1 Penambahan larutan I

Larutan menjadi
kental, keruh
dan berwarna
putih

2 Didiamkan selama 5 Tidak terjadi

menit perubahan
3 Penambahan larutan II Membentuk
larutan tidak
berwarna dan
homogen

4 Inkubasi selama 15 Terdapat lendir

menit pada larutan
5 Penambahan larutan Aroma larutan
III asam dan
larutan tak
berwarna
6 Larutan
membentuk 2
fase dimana
pada bagian atas
Inkubasi selama 10 dan bawah
menit dan berupa larutan
disentrifugasi tidak berwarna
dan bagian
dinding berupa
lapisan tipis
emulsi
7

Ditambah campuran
Membentuk
fenol;kloroform;isoam
emulsi
il alkohol

Supernatan bagian
Larutan
atas dan ditambah
homogen
etanol dingin

9 Diingkubasi selama 60
Terdapat pelet
menit
10 Pelet larut
Pelet diambil dan
membentuk
ditambah etanol
larutan
 homogen
11 Larutan
homogen dan
Disentrifugasi
terdapat sedikit
pelet
12 Pelet diambil dan Tidak terjadi
ditambah ddH2O perubahan
13

Hanya
ditemukan RNA
Elektroforesis
saja yang
berjalan

4.2 Pembahasan
Percobaan yang telah dilakukan ada praktikum ini yaitu isolasi DNA
plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler yang berukuran relatif kecil
dan berada pada kromosom bagian luar dalam sel prokariot. Plasmid dalam
rekayasa genetika dapat digunakan sebagai vektor untuk mentransfer gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen ini nantinya yang akan
menghasilkan suatu produk komersial seperti insulin. Isolasi DNA plasmid dapat
dilakukan dengan sentrifugasi dan presipitasi. Proses ini dilakukan dengan cara
memecah dan mengekstraksi jaringan-jaringan hingga membentuk ekstrak sel
yang terdiri dari sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Ekstrak sel kemudian dilakukan
pemurnian (purifikasi) sehingga dihasilkan pellet sel yang mengandung plasmid.
Isolasi DNA bertujuan untuk memperoleh DNA yang murni terbebas dari bahan-
bahan lainnya seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi DNA memiliki
ketelitian yang cukup tinggi sehingga harus dilakukan secara hati-hati. DNA yang
akan diisolasi adalah DNA plasmid untuk kemudian dianalisis dengan
elektroforesis sel agarosa.
 Isolasi dari bakteri E. coli pada praktikum kali ini dilakukan dengan
menggunakan cara alkalin lisis. Metode alkalin lisis merupakan suatu metode
yang digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid yang ada dalam sel bakteri E.
coli. Isolasi tersebut dilakukan melalui proses lisis pada membran sel dengan
menggunakan Sodium Dedosil Sulfat pada suasana basa. Bakteri E. coli dibiakkan
dalam media LB yang sudah ditambahkan kanamisin, kemudian diinkubasi
selama ±16 jam pada 37oC dengan kecepatan 150 rpm, dimana tahap ini sudah
dilakukan oleh asisten sehingga praktikan melanjutkan tahap berikutnya. Tahap
isolasi plasmid berikutnya yaitu diambil 5 ml suspensi sel dan dilakukan
sentrifuse 10000 rpm pada suhu 4oC selama 2 menit. Sentrifuse ini bertujuan
untuk memisahkan material selular (DNA) dengan cairan yang terdapat dalam sel
dan juga media LB sehingga semua material penyusun sel berada dalam pellet.
Hasil dari sentrifuse yaitu supernatan dan pellet.
Supernatan merupakan substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis
yang lebih kecil. Pellet adalah adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki
berat jenis yang lebih besar. Posisi supernatan berada pada lapisan atas dengan
warna yang lebih jernih dan pellet berada pada bagian bawah dengan warna yang
lebih keruh berupa endapan. Sel dari bakteri Escherichia coli akan berada pada
pellet sehingga supernatan harus dipisahkan dan dibuang melalui proses
sentrifugasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah pemisahan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Hasil pelletnya diambil dan supernatannya disimpan.
Tahap pertama yang dilakukan yaitu pelet disuspensi dengan menggunakan
larutan I (campuran dari glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na-EDTA 10
mM pH 8 sebanyak 100 mL) sebanyak 100 µL dan dihomogenkan lalu didiamkan
5 menit. Penambahan ini berfungsi untuk melarutkan pellet. Pendiaman ini
dilakukan dengan tujuan agar reaksi berjalan dengan sempurna, sehingga pellet
benar-benar telah larut.Glukosa dapat berperan sebagai buffer yang dapat
mempertahankan pH. Larutan EDTA dapat menghambat DNAse. Enzim DNAse
merupakan enzim yang dapat mendenaturasi DNA. Larutan EDTA dalam larutan
buffer berperan sebagai agen pengkelat yang digunakan untuk mengikat ion
logam Ca2+ dan Mg2+. Logam ini merupakan kofaktor dari DNAse. Kofaktor
tersebut akan berikatan dengan EDTA membentuk kompleks. Kofaktor yang
berinteraksi dengan EDTA dalam buffer akan mengganggu kerja DNAase.
Keberadaan enzim DNAase sangat merugikan karena akan mengganggu proses
isolasi DNA pET-endo. Hal tersebut akan memberikan kemungkinan yang sangat
kecil untuk terjadinya degradasi pada DNA yang akan diisolasi pada praktikum
kali ini. Tris-HCl berfungsi untuk menjaga pH larutan.Pellet dilarutkan atau
dihomogenkan dengan cara dikocok kemudian diketuk-ketuk selanjutnya
didiamkan agar reaksi atau proses isolasi dapat berlangsung dengan sempurna.
Pellet yang telah tersuspensi kemudian ditambahkan larutan II(NaOH 0,2
M, SDS 1%, ddH2O steril) sebanyak 200 µL dan dihomogenkan dengan cara
membolak-balik tabung Eppendorf. Penambahan ini dapat digunakan untuk
melisiskan dinding sel. SDS dapat merusak membran sel bakteri. Membran sel
yang akan dilisis yaitu pada bagian fosfolipid (lemak) dan protein. Komponen
penyusun sel akan keluar dari dalam sel ketika membrane sel telah mengalami
kerusakan. Penambahan NaOH pada larutan II berfungsi untuk membuat sistem
dalam kondisi basa pada kisaran pH 12,0-12,5. Hal ini dikarenakan dengan
adanya perubahan pH akan menyebabkan proses denaturasi pada DNA kromosom
dan pET-endo dalam sel bakteri E. coli TOP10. Ikatan hidrogen yang ada pada
DNA kromosom maupun pET-endo akan terputus dalam suasan pH tersebut. Hal
tersebut akan membuat rantai double helix pada DNA akan terbuka dan
membentuk single helix. Campuran kemudian dihomogenkan dan diinkubasi
selama 15 menit. Inkubasi pada proes tersebut berfungsi untuk melihat
pertumbuhan atau perkembangbiakan pada mikroorganisme.
pET-endo yang mengalami denaturasi harus direnaturasi karena pET-endo
merupakan produk yang akan diisolasi. Proses renaturasi pET-endo dilakukan
dengan penambahan larutan III yang terdiri atas kalium asetat, asam asetat glasial,
dan ddH2O dingin lalu diinkubasi dalam es selama 10 menit. Penambahan larutan
III untuk mempertahankan agar pH DNA plasmid tidak rusak. Kondisi larutan
yang awalnya basa kemudian berubah menjadi kondisi netral. Kalium asetat dapat
membantu terjadinya renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA
karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar
garam yang tinggi, kemudian diinkubasi selama 10 menit. Proses renaturasi pada
pET-endo berlangsung secara sempurna. Hal ini dikarenakan struktur pET-endo
yang merupakan DNA plasmid adalah sirkular. Proses pemisahan pET-endo dapat
dilakukan dengan cara sentrifuse. Proses sentrifugasi dilakukan kembali dengan
12000 rpm setelah penambahan larutan III. Hasil yang diperoleh yaitu larutan
membentuk 2 fase dimana pada bagian atas (supernatan) dan bawah berupa
larutan tidak berwarna (pellet) dan bagian tengan berupa lapisan tipis emulsi.
Pemisahan ini dapat terjadi karena adanya perbedaan berat molekul yang
signifikan diantara keduanya. Hasil pelletnya disimpan dan supernatannya
diambil. Supernatan yang diperoleh tidak berwarna. Hal tersebut menunjukkan
bahwa telah terjadi pengendapan secara sempurna sehingga tidak mencemari
supernatan. Perlakuaan ini dilakukan pada suhu 4°C karena pada suhu ini proses
pemisahan atau proses reaksi berlangsung dengan sempurna.
Supernatan dipindahkan secara perlahan dengan menggunakan pipet
kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol :
kloroform : isoamilalkohol (25:24:1) sebanyak 1 kali volume total. Penambahan
ini bertujuan untuk menghilangkan protein dan pengotor-pengotor lain dalam
larutan. Pelarut organik akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein
sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA. Campuran kemudian
dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit
menghasilkan 3 lapis. Lapisan fasa paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah
adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair. Bagian atas
merupakan supernatan, kemudian dipindahkan dengan cara mempipet secara hati-
hati dalam tabung eppendorf baru yang steril, kemudian dipekatkan dengan
menambahkan etanol absolut dingin. Fungsi penambahan etanol absolut yaitu
untuk untuk mengendapkan plasmid karena adanya perbedaan polaritas.
Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada keadaan dingin dengan tujuan
agar banyak DNA plasmid yang mengendap.Prinsip pengendapan dengan
menggunakan etanol absolut dingin, yaitu pada saat penambahan garam yaitu Na-
asetat yang berfungsi sebagai penetral muatan pada gula fosfat DNA, maka ion-
ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika
di dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negatif (DNA) masih
lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Air memiliki
konstanta dielektrik yang tinggi, sehingga penambahan pelarut organik seperti
etanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan
DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.
Langkah yang terakhir adalah proses elektroforesis. Proses elektroforesis
merupakan suatu meode yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi
dan memurnikan fragmen DNA. Agarosa adalah fraksi yang berasal dari agar-agar
dan merupakan polimer yang netral serta mengandung sedikit sulfat.
Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA
yang didasarkan pada muatan, ukuran dan bentuk juga fungsi dari gel agarosa
untuk memisahkan molekul yang berukuran lebih dari 100 bp (sebagai
penyaring). Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi akan menyebabkan ruang
antar molekul pada gel lebih kecil sehingga mempersulit pergerakan molekul yang
melewatinya. Penambahan EtBr berfungsi untuk mengikat molekul DNA dan
dapat mengangkat sinar UV. Keberhasilan percobaan isolasi DNA ditunjukkan
dari pendaran pita yang cukup jelas, namun pada percobaan yang kami lakukan
tidak ditunjukkan adanya pendaran tersebut. Hasil yang terlihat adalah warna
pendaran yang berwarna oranye yang menandakan terdapat RNA. Kesalahn ini
terjadi karena kurang lamanya gel agarosa saat direndam dengan larutan buffer
TAE.
 BAB V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dalam praktikum isolasi DNA plasmid yaitu :
1. Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan penambahan beberapa reagen
larutan. Larutan ini dapat digunakan untuk merusak (lisis) sel dan
mengekstrak DNA dari dalam sel. DNA yang telah diisolasi kemudian diuji
dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa dan selanjutnya
diamati dengan sinar UV, dimana menunjukkan DNA plasmid yang
dihasilkan buram atau tidak terlihat jelas.
2. Berat molekul DNA plasmid yang diisolasi tidak dapat diuji karena proses
isolasi tidak berhasil mendapatkan DNA plasmid.

5.2 Saran
Saran untuk praktikum isolasi DNA plasmid adalah praktikan harus lebih
disiplin selama melakukan percobaan di laboratorium dan pada saat proses
elektroforesis jangan menggerak-gerakkan alat karena dapat mempengaruhi
proses elekroforesis. Proses elektroforesis sebaiknya dilakukan dengan terus
menerus tanpa adanya jeda. Praktikan juga harus memastikan proses pemisahan
saat tiga fase terbentuk terpisah secara maksimal agar sampel yang dihasilkan
lebih murni dan dapat dilakukan elektroforesis secara maksimal sehingga DNA
dapat terlihat sehingga dapat menentukan berat molekulnya. Praktikan harus
mengusai materi dan prosedur kerja dengan baik untuk mendapatkan hasil
praktikum yang sesuai dan baik serta dapat meminimalisir terjadinya keasalah.
Praktikan harus menggunakan lab safety use dan memperhatikan SOP untuk
menghindari kesalahan dan kecelakaan kerja serta untuk mendapatkan data yang
benar.
 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, Jane B. Reece & Lawrence G. Mitchell. 2004. Biology- 10th

I'd. USA:Pearson Eduaction Inc.
Cooper. 2000. The Tools of Biochemistry. USA: John Wiley and Sons.
Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 2005. Molekuler Biotechnology, Principles and
applications of Recombinan DNA. Washinton D.C : ASM Press.
Goodenough.1988. Understanding DNA. Amsterdam: Academic Press.
Jack, R.C. 1995. Basic Biochemical Laboratory and Computing. New York:
Oxford University Press.
Kusuma, S.R.F. 2010. PCR. Makalah Fak. Farmasi. Bandung: Universitas
Padjadjaran.
Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Edisi pertama. Jakarta: Erlangga.
Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.
Sambrook J., E. F. Fritcs and Manicitis, T. 1989. Molecular Kloning: A
Laboratory Manual. 2nd Edition. Old spring Harbor Laboratory Press. USA.
Standfield W.D., Jaime S.C., Raul J.C. 2006. Schaum’s Easy Outline Biologi
Molekuler dan sel. Penerjemah: Varian Fahmi, terjemahan dari: Schaum’s
Easy Outline Molecular and Cell Biology. Jakarta: Erlangga.
Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik
Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi,
IPB.
Suryo, 2004. Genetika Manusia.Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag
Publisher ISBN 3-540-66678-8.
Wibowo, M. S. 2010. Elektroforesis. Bandung: Institut Teknologi Bandung.