LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKUL

UJI KUANTITATIF PROTEIN

Kelompok 4
Anggota :
Nina Indraswati (171810301003)
Qurotul Ainiyah (171810301009)
Selma Ajeng Wulandari (171810301069)
Bambang Hidayat (171810301075)

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2019
 BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA merupakan makromolekul berupa benang yang sangat panjang yang
terbentuk dari sejumlah besar deoksiribonukleotida yang masing – masing
tersusun dari satu gula, satu basa, dan satu gugus fosfat. DNA termasuk ke dalam
persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang berfungsi
membawa informasi genetik. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria,
plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nukleus memiliki bentuk yang berbeda
dengan molekul DNA yang terdapat pada mitokondria dan plastida. Molekul
DNA pada nukleus berbentuk benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA
yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran. Molekul DNA
yang terdapat dalam inti sel atau nukleus disebut dengan DNA kromosomal yang
dimiliki oleh setiap organisme tidak terkecuali bakteri. Bakteri juga memiliki
DNA ekstrakromosomal atau DNA plasmid. Plasmid merupakan DNA
ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan bisa ditemukan
pada sel hidup (Suryo, 2004).
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai
tujuan atau kegiatan seperti menyilangkan suatu spesies tumbuhan untuk
menghasilkan tumbuhan dengan spesies baru. Isolasi DNA juga dapat digunakan
dalam rekayasa genetika. Rekayasa genetika dapat dikembangkan menjadi
artifisial plasmid dengan cara menggabungkan gen-gen plasmid alami maupun
genom tertentu. DNA yang diperoleh harus dalam keadaan yang lebih murni,
sehingga dapat menganalisis sifat atau karakter dari DNA yang telah diisolasi.
Prinsip utama dari isolasi DNA adalah penghancuran lisis, ekstraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian.
Proses isolasi DNA sendiri diawali dengan proses ekstraksi DNA yang bertujuan
untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Analisis
DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan metode elektroforesis dan
visualisasi menggunakan sinar UV (Glick et all, 2005).
 Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk melatih kemampuan mahasiwa
dalam mengisolasi DNA plasmid. Pemahaman tentang isolasi DNA perlu
ditingkatkan karena dapat digunakan untuk membantu menyelesaikan
permasalahan dalam kehidupan sehari-hari. Percobaan ini dilakukan dengan
mengisolasi DNA plasmid pET-endo. DNA plasmid diperoleh melalui bakteri
E.coli yang telah diinokulasikan menghasilkan pellet. Pellet yang diperoleh
ditambahkan dengan beberapa reagen. Pellet tersebut kemudian dipisahkan
dengan metode sentrifugasi dan presipitasi. Pellet yang diperoleh dianalisis
dengan metode elektroforesis gel agarosa untuk menguji ada tidaknya DNA
plasmid dalam pellet (Tim Biokimia, 2019).

1.2 Tujuan

Tujuan masalah pada percobaan isolasi DNA adalah melatih kemampuan

mahasiswa untuk mengisolasi DNA plasmid.

1.3 Manfaat

Manfaat dari percobaan isolasi DNA yaitu mahasiswa dapat melatih

kemampuan nya.
 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Asam Deoksiribonukleat (DNA)

Asam Deoksiribonukleat atau DNA merupakan materi genetik pada sebuah

sel dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah
keseluruhan informasi genetik yang dimiliki suatu sel atau organisme atau
khususnya keseluruhan asam nukleat yang memuat inforrmasi. DNA dapat
diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan. DNA manusia
dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus
lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen,
nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah
merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang
diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki
nukleus, dimana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat
diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang
(Musa sp.). DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparallel dengan
komponen basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanine (G) yang memiliki
struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosi (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin tunggal. Guanin apabila berikatan dengan
sitosin, maka akan terbentuk 3 ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenine
berikatan dengan timin maka akan terbentuk 2 ikatan hydrogen. Komponen
pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentose, satu gugus fosfat
dan satu pasang nukleotida (Fatih, 2009).
 Gambar 2.1 Struktur Nukelotida

(Sumber : Fatih, 2009)

Gambar 2.2 Struktur Purin dan Pirimidin (Adenin dan guanin; sitosin, timin dan
urasil)

(Sumber : Fatih, 2009)

DNA terdapat dalam sel prokariot maupun eukariot. Aktifitas genetik dari sel
prokariot terjadi di seluruh selnya sehingga DNA tidak mempunyai tempat yang
spesifik dalam sel.Aktifitas sel eukariot terjadi di dalam inti sehingga sebagian
besar DNA sel eukariot terdapat dalam inti sel. DNA pada sel prokariot berbentuk
lingkaran dan hanya ada satu unit, oleh karena itu, prokariot bersifat monoploid
karena hanya ada satu bahan genetik utama. DNA pada sel prokariot juga tidak
dikemas dalam struktur yang jelas karena sel prokariot tidak memiliki inti sel.
DNA pada sel eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Ukuran
DNA eukariot juga lebih besar dibandingkan DNA prokariot dan DNA eukariot
lebih bervariasi (Mangunwardoyo, 2002).
 Sel prokariot juga memiliki bahan genetik tambahan yang disebut DNA
plasmid. DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen,
sehingga DNA plasmid harus dipisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid
mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Plasmid
merupakan salah satu vekktor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa
DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan
dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid
adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil
yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom
(Corkill, 2008).

Plasmid merupakan molekul DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi

(memperbanyak diri) secara mandiri dan ditemukan dalam sel prokariot dan
eukariot. Plasmid terdapat pada bakteri dan beberapa organisme eukariot seperti
Saccharomyces ceriviseae. Ukuran plasmid bervariasi antara 1 kb sampai 200 kb.
Penelitian suatu rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai kendaraan
molekuler untuk memasukkan gen dari luar ke dalam sel inang. Plasmid
mempunyai 3 komponen penting yaitu:

a. Origin of replication (ORI), sehingga plasmid dapat bereplikasi secara

mandiri.

b. Mempunyai daerah unik sebagai situs pemotongan enzim endonuclease, yang

biasa disebut multiple cloning site (MCS).

c. Membawa penanda seleksi (biasanya resistensi terhadap antibiotika) untuk

membedakan antara sel inang yang mengandung plasmid atau tidak.

(Corkill, 2008).

Menurut Corkill (2008), klasifikasi plasmid berdasarkan karakteristik gen

yang dikodenya. Terdapat 5 jenis plasmidyaitu:
a. Plasmid fertilitas atau F, membawa gen tra sehingga plasmid dapat berpindah
secara konyugasi, contoh plasmid F pada E. Coli.
b. Plasmid resisten atau R, membawa gen resistensi terhadap antibiotika,
contoh: resistensi terhadap kloramfenikol, ampisilin, dan zeocin.
c. Plasmid Col mempunyai gen pengkode protein kolisin, protein yang dapat
membunuh bakteri lain, contoh ColE1 pada E. Coli.
d. Plasmid degradatif memungkinkan sel inang memetabolisme senyawa yang
tidak umum (toluene dan asam salisilat), contoh: Tol pada Pseudomonas
putida.
e. Plasmid virulensi, memungkinkan sel inang dapat menginfeksi organisme
lain. Contoh plasmid Ti pada Agrobacterium tumefaciens.

Sel eukariot memiliki DNA di dalam kromosom, yaitu di inti sel dan ada
beberapa sel eukariot memiliki DNA di luar kromosom, yaitu DNA pada
mitokondria dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat
erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular, replikasinya berlangsung secara independen dan tidak bergantung pada
replikasi kromosom, serta tidak berasosiasi dengan protein histon. DNA
mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat
yang berasal dari garis ibu. DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari
kedua orangtua. Kromosom Escherichia coli, yang merupakan salah satu genom
prokariot yang telah ditentukan urutannya, mengandung molekul DNA sirkular
dengan ukuran 4.638.858 pasang basa dan mengkode sebanyak 4.300 gen
pengkode protein dan 115 gen pengkode mulekol RNA stabil. Manusia
mempunyai 24 kromosom yang berbeda. Genom manusia kira kira mengandung
DNA dengan ukuran 3 milyar pasang basa yang mengkode 50.000–100.000 gen
(Mangunwardoyo, 2002).

2.2 Teknik Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari molekul yang lain di
dalam inti sel. Prinsip dari teknik isolasi DNA ini adalah sentrifugasi dan
presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik yang dilakukan untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul dengan berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam
fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian
bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu
komponen dari campuran (Glick et al., 2005).
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dinding sel. Perusakan dinding sel ini
dapat dilakukan dengan cara mekanik maupun cara enzimatis. Cara mekanik dapat
dilakukan dengan sonikasi, pemberian tekanan tinggi, membekukan ataupun
melelehkan. Cara enzimatik dapat dilakukan dengan cara pemberian lisozim.
Langkah berikutnya adalah lisis sel. Proses Lisis merupakan peristiwa pecahnya
atau rusaknya integritas membran sel. Pecahnya membran sel ini membuat
organel yang ada di dalam sel keluar. Proses lisis sel ini membuat DNA lebih
mudah untuk diisolasi. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik. Bahan-bahan yang lebih kasar
perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan
sodium dodesil sulfat (SDS) (Albert et al, 2005).

Perusakan sel eukariot harus diikuti dengan perusakan membran nukleus.

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Pembuangan
remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi
menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform. Protein yang telah
dipresipitasi kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan
proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih
tercampur dengan RNA. DNA yang masih tercampur dengan RNA perlu
dibersihkan agar didapatkan DNA murni dengan menambahkan RNAse. RNAse
yang diberikan berfungsi untuk memisahkan RNA dari DNA yang ingin diisolasi.
Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan
penambahan amonium asetat dan alkohol (Giacomazzi et al, 2005).

2.3 Fungsi dan Struktur DNA

 DNA atau asam deoksibonukleat meiliki fungsi yaitu untuk tempat
menyimpan informasi genetik yang dibutuhkan dan untuk memberikan ciri khas
dari struktur protein serta RNA pada setiap spesies pada organisme. DNA
mebawa informasi genetik yang disebut dengan gen. DNA dapat meriplikasi atau
memperbanyak diri dari DNA tersebut, jadi DNA sifatnya dapat diwariskan pada
semua sel. DNA juga berperan dalam aktivitas sel untuk menentukan sintesis
enzim serta protein lainnya (Lehninger, 2008).

DNA memiliki tiga jenis struktur yaitu struktur primer, struktur sekunder, dan
struktur tersier.

a. Struktur primer

Struktur primer merupakan struktur utama asam nukleat yang terdiri dari
urutan linier nukleotida yang dihubungkan satu sama lain dengan sambungan
fosfodiester. Nukleotida terdiri dari tiga komponen yaitu basa nitrogen, gugus
fosfat, dan gula dioksiribonukleat. Nukleotida membentuk hubungan
fosfodiester antara 5’ dan 3’ atom karbon, urutan nukleotida ini saling
melengkapi sehingga membentuk asam nukleat.

b. Struktur sekunder

Struktur DNA pada struktur sekunder ini berentuk double helix. Double helix
pada DNA ditandai dengan adanya dua unati polinukleotida secara anti
paralel yang berpilin ke kanan dan melingkari sumbu. Nukleotida merupakan
penyusun DNA yang tersusun atas tiga gugus molekul yaitu gula dengan 5
karbon (2-deoksiribosa), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen
penyusun DNA adalah golongan purin dan golongan pirimidin. Basa purin
tersusun atas dua basa yaitu adenin (A) dan guanin (G). Basa pirimidin
tersusun atas dua basa yaitu Timin (T) dan Sitosin (C). struktur DNA
sekunder didominasi dengan pasangan dasar dua helai polinukleotida
sehingga membentuk Double helix.
c. Struktur tersier

DNA pada struktur tersiernya memiliki bentuk lingkaran. Lingkaran

terbentuk karena dari kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup
yang tidak berujung. DNA yang memiliki struktur tersier dapat diisolasi dari
bakteri, virus, dan mitokondria yang berbentuk superkoil.

d. Struktur Kuarter

Struktur kuarter merupakan struktur yang memiliki tingkat lebih tinggi dari
organisasi asam nukleat. Struktur kuarter ini berdasatkan pada interaksi sam
nukleat dengan molekul lain. Organisasi yeng memiliki struktur seperti ini
contohnya seperti kromatin yang menunjukkan interaksi dengan protein
histon kecil.

(Kusuma, 2010).

Gambar 2.3 Struktur Double Helix DNA

(Sumber: Kusuma, 2010)

DNA prokariot dan eukariot memiliki beberapa perbedaan yaitu letak dari
DNA tresebut. DNA pada eukariot berada pada inti sel sedangkan prokariot
berada pada sitoplasma. DNA pada eukariot bentuknya yaitu linier sedangkan
pada prokariot bentuknya melingkar. Organisme yang tidak memiliki inti sel atau
membran plasma disebut dengan prokariot sedangkan pada eukariot memiliki inti
sel yang sejati.DNA eukariot memiliki protein histon sementara pada DNA
prokariot tidak memilik sel tersebut. Sel prokariot memiliki bahan genetik
tambahan yaitu DNA plasmid, DNA plasmid ini merupakan wadah yang
digunakan untuk kloning gen sehingga DNA plasmid harus dipisahkan dengan
DNA kromosom. Ukuran DNA plasmid jauh lebih kecil jika dibandingkan dengan
DNA kromosom. Plasmid merupakan DNA utas yang tidak memiliki ujung yang
berukuran kecil di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara
autonom. Sel prokariot terdapat gen penting yang disimpan dalam DNA satelit
disebut dengan plasmid, sedangkan pada eukariot yang memiliki plasmid hanya
beberapa saja (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

2.4 Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan atau pemurnian suatu makromolekul

khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara
rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada
berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang
menggunakan prinsip elektroforesis zona. Molekul protein akanbermigrasi pada
medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah
pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik
isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Sudjadi, 1998).

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan

listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut
akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan
bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda).
Elektroforesis juga menggunakan bahan-bahan seperti Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Etidium Bromida digunakan karena
dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas,
sedangkan BromoFenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau
kecepatan molekul DNA pada gel (Magdeldin, 2012).

Menurut Magdeldin (2012), faktor yang mempengaruhi pergerakan DNA

pada elektroforesis adalah sebagai berikut:

1. Ukuran molekul DNA yaitu molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih
cepat karena ruang gerak yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.
2. Konsentrasi gel agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul
DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA
berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah
mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.
3. Bentuk molekul supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel.
4. Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan
molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan
per unit volume molekul.
5. Pori-pori gel yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati
gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul
DNA.
6. Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal
tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
7. Larutan buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik
sehingga migrasi DNA akan lebih cepat

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen

DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda
ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.
Elektroforesis dapat diaplikasikan pada berbagai macam kegiatan sebagai berikut:

1. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui

susunan sekuens berbagai genom.
2. DNA fingerprinting.
3. Mendeteksi kelainan genetik.
4. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.
5. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme
atau percobaan perlakuan gen.
6. Mempelajari evolusi tingkat molecular.
7. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.
8. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein
tertentu.
9. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.
10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA
plasmid.
11. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR

(Magdeldin, 2012).

2.5 Agarosa

Agarosa merupakan polisakarida netraldengan struktur linear dari ulamgan

unit agarobiosayaitu disakarida yang terdiri dari D-galaktosa dan 3,6-anhidro-L-
galaktosa.Agarosa dijual secara komersial dengan kontaminasi polisakarida,
garam dan protein. Agarosa dikenal sebagai fraksi pembentuk gel dari agar karena
sifat yang dihasilkannya mendekati sifat gel ideal yaitu mengandung kadar sulfat
yang rendah (>0,7 %) serta memiliki kekuatan gel yang tinggi pada konsentrasi
rendah. Jumlah kontaminasi di dalam gel dan kemampuan mengambil DNA dari
dalam gel digunakan untuk substrat dalam reaksi enzimatis. Gel agarosa dapat
dicetak dengan memanaskan agarosa dalam larutan buffer sampai didapatkan
larutan jernih. Larutan yang masih cair (dengan temperatur sekitar 60°C)
dituangkan ke dalam pencetak sisir kemudian ditempatkan di dekat tepian gel
dibiarkan mengeras. Presentase agarosa dalam larutan menentukan kepadatan gel
yang terbentuk. Sisir pada gel yang telah mengeras kemudian dicabut sehingga
akan terbentuk sumur-sumur yang digunakan untuk menempatkan larutan DNA.
Gel ditempatkan ke dalam tangki elektroforesis yang mengandung larutan bufer
dan telah dialiri dengan arus listrik dimana molekul DNA yang bermuatan negatif
pada pH netral akan bergerak (migrasi) ke elektroda positif (anoda)

(Pratiwi, 2010).

Gel agarosa biasanya digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih
besar (lebih dari 100 bp), sedangkan untuk fragmen kecil (kurang dari 100 bp)
menggunakan gel poliakrilamida. Konsentrasi matriks agarose menentukan jarak
antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran. Mobilitas/pergerakan DNA relatif
dipengaruhi oleh beberapa faktor-faktor terutama pada konsentrasi agarosa dalam
gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan
konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori
kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Molekul yang lebih kecil secara
umum bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul besar karena
memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif.
Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik
untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band
yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi
juga dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang dan disamping itu juga
dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil

(Lee & Bahaman, 2010).

 BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
- Eppendrof
- Pipet
- Waterbath
- Icebath
- Sentrifugal
- Shaker
- Set elektroforesis
- Sinar UV
3.1.2 Bahan
- Koloni tunggal
- 5 mL Media Luria Bertani cair
- 2,5 μl kanamisin 100 mg/ml
- Larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2.5 mM pH 8, Na2-EDTA 10 mM
pH 8)
- Larutan II (NaOH 0.2 M 20 μl, SDS 1% 100 μl, ddH2O steril)
- Larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)
- Fenol
- Klorofom
- Isoamil alkohol
- larutan natrium asetat 0,3 M
- etanol absolut dingin, 0.6 ml etanol 70%, Bromofenol
- ddH2O.
- Buffer TAE
- Etidium Bromida
3.2 Diagram Alir

Koloni tunggal

- diinokulasi
- diinkubasi 37oC
- disentrifugasi
-
Pellet

Disuspensi :
Larutan I, II, III

- dihomogenkan
- diekstraksi

Lapisan atas
- dipekatkan
- dinkubasi
- disentrigugasi

Pellet
- dilarutkan dalam ddH2O
- dielektroforesis dalam gel
agarosa

Analisis Data

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Isolasi DNA Plasmid
Koloni tunggal transforman E.coli diinokulasikan ke dalam 5 ml media
Luria Bertani cair yang mengandung 2.5 μl kanamisin dan diinkubasi pada shaker
inkubator pada 37oC dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Suspensi sel
sebanyak 5 ml disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10000 rpm pada
4oC. Pellet disuspensi dalam larutan I, dihomogenkan kemudian didiamkan 5
menit. Ditambahkan 200 μl larutan II dan dihomogenkan dengan cara membolak
balik tabung eppendrof. Larutan diinkubasi dalam es selama 15 menit,
ditambahkan 150μl larutan III, diinkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran
tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm suhu 4oC .
Supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan menggunakan pipet ke dalam
eppendrof baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil
alkohol (25 : 24 : 1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi
kemudian disentrifugasi lagi 12000 rpm selama 2 menit dan akan dihasilkan 3
lapis. Fasa paling bawah adalah fasa organik, sementara fasa paling atas fasa cair.
Fasa cair dipindah dengan dipipet secara hati-hati ke dalam eppendrof baru yang
steril. Fasa cair dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali
volume total dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi
12000 rpm selama 5 menit. Pellet dicuci dengan etanol dingin 70% sentrifugasi
lagi. Eppendrof dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung. Pellet
dilarutkan dalam 20 μl ddH2Odandilakukananalisis DNA.
3.3.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,375 g agarosa dalam 25 ml
buffer TAE (Tris Acetat EDTA) pH 8. Agarosa yang sudah larut didinginkan
sampai kira-kira temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan
dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektrolisis dicampur dengan buffer yang
mengandung bromofenolbiru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40 % (b/v). Elektrofolisis
dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 volt. Elektroforesis dihentikan
ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel
agarosa kemudian direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) 250 µg/mL
selama 30 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit.
Pita-pita DNA diamatidengansinar UV.
 DAFTAR PUSTAKA
Albert, B.D et al. 2015. Biologi Molekular 2nd Ed. Jakarta: PT. Gramedia Utama.
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools
andTechniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. USA:
Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press
Der Lee. 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image
Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering .4: 523-528.
Fatih, M. 2009. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi.10(1): 61 – 67.
Giacomazzi, S., Lerol, F., Joffraud, J.J. 2005. Comparison of Three Methods of
DN Aextraction from Cold-Smoked Salmon and Impact of Physical
Treatments. Journal of Applied Microbiology. 98: 1230-1238.
Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 2005. Molekuler Biotechnology, Principles and
applications of Recombinan DNA. Washinton D.C : ASM Press.
Jusuf M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bogor: Sagung Seto.
Kusuma, S.R.F. 2010. PCR.Makalah Fak. Farmasi. Bandung: Universitas
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified Gel Preparation for Distinct DNA
Fragment Analysis in Agarose Gel Electrophoresis. Tropical Biomedicine.
27(2): 351-354.
Lehninger. 2008. Dasar-Dasar Biokimia Edisi Ketiga. Jakarta: Erlangga.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. Rijeka:
InTech Publisher.
Mangunwardoyo, W. 2002. Transformasi Fragmen DNA Kromosom
Xanthhomona campestris KE dalam Escherichia coli. Jurnal Makara, Sains.
6(1): 56-62.Padjadjaran.
Pratiwi, R. 2001. Oseane: Mengenal Metode Elektroforesis. Jakarta: Balitbang
Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI.

Sudjadi. 1988. Metode Pemisahan. Yogyakarta: Kasinius

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik
Pengklonan Gen. Bandung: Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi, IPB.

Suryo, 2004. Genetika Manusia.Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag
Publisher ISBN 3-540-66678-8.
Tim Biokimia. 2019. Petunjuk Praktikum Biomolekul. Jember: Universitas
Jember.