LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKUL

ISOLASI DNA PLASMID

Oleh :
Nama : Rahajeng Abigail Fapingala
NIM : 211810301063
Kelas : Ap
Kelompok : 3A
Asisten : Risa Anggraini

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2023
 BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit
mononukleotida. Asam nukleat disebut dioksiribonukleat (DNA) apabila unit-unit
pembangunnya berupa dioksinukleotida, sedangkan jika terdiri dari unit-unit
mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA atau Deoxyribose
Nucleid Acid adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang
dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA terdapat
dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa
informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme
lain. DNA keseluruhan dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi
bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA
genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).
Isolasi DNA pada zaman sekarang ini sangat penting untuk dikatahui karena
berhubungan dengan perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang.
Isolasi DNA adalah suatu cara yang digunakan untuk memisahkan DNA plasmid
atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. DNA dibutuhkan dengan
kualitas yang baik untuk berbagai kegiatan seperti pemanfaatan marka molekuler,
pembuatan pustaka genom, hingga sekuensing. Isolasi DNA pada kehidupan
sehari-hari dapat dilakukan dengan aplikasi konsep dan prosedurnya. Isolasi DNA
dalam bidang pertanian dimanfaatkan untuk menghasilkan spesies yang lebih
baik, dan tahapan sintesis protein (Baruno, 2021).
Isolasi DNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa
genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip isolasi DNA terdiri
dari tiga tahap, yaitu pelisisan atau penghancuran sel, pemisahan DNA dengan
molekul lain atau ekstraksi, dan pengendapan atau pemurnian DNA. Pelisisan
adalah perusakan membran sel oleh protease. Ekstraksi adalah penghancuran
orgenel sel sehingga materi yang berada dalam organel sel keluar. Pengendapan
adalah pemisahan antara DNA dengan materi lain melalui perbedaan berat
(Nishiguchi et al, 2002).
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah pada percobaan isolasi DNA plasmid ini adalah sebagai
berikut:
1. Bagaimana cara melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA
plasmid?
2. Bagaimana cara memahami dan mengetahui berat molekul DNA plasmid?
3. Bagaimana cara membedakan DNA plasmid?

1.3 Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan isolasi DNA plasmid ini adalah sebagai berikut:
1. Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA plasmid.
2. Memahami dan mengetahui berat molekul DNA plasmid.
3. Membedakan DNA plasmid.

1.4 Manfaat
Manfaat dari percobaan isolasi DNA plasmid ini adalah sebagai berikut:
1. Mampu melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA plasmid.
2. Mampu memahami dan mengetahui berat molekul DNA plasmid.
3. Mampu membedakan DNA plasmid.
 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 DNA
DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok
basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. Dua
purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin, dan
pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi
beberapa ikatan ganda yang berhubungan. DNA tersusun atas 3 komponen utama
yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk
nukleotida. DNA terdiri dari 2 rantai polinukleotida yang berpilin (double helix).
Nukleotida berada pada bidang datar yang tegak lurus seolah-olah membentuk
anak tangga (pasangan basa nitrogen), sedangkan ibu tangganya terbentuk dari
gugus fosfat. Polinukleotida di antara kedua rantainya dihubungkan oleh ikatan
hidrogen pada tiap-tiap pasangan basa nitrogennya. Basa pirimidin selalu
berikatan dengan basa purin, dengan pasangan yang selalu tetap (Susanto, 2012).

Gambar 2.1 Struktur DNA (Sumber: Susanto, 2012)

DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan
penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein
dan proses metabolisme lain. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan,
baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya kromosom. Pemilihan
di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua
pendekatan. Plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat
kuat atau dikatakan mempunyai bentuk Covalently Closed Circular (CCC). DNA
kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untaiannya dan mempunyai nisbah
aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh
lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom.
Hal tersebut membuat aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA
plasmid dengan DNA kromosom (Susanto, 2012).
DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosom dan DNA
ekstrakromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. DNA
plasmid memiliki ukuran yang lebih kecil (± 2 kb) dibandingkan dengan DNA
kromosom yang memiliki ukuran yang besar (>0,5 Mb). Plasmid dan kromosom
adalah dua jenis struktur genetik yang dapat ditemukan pada sel-sel organisme.
Plasmid dan kromosom memiliki perbedaan dalam hal ukuran, fungsi, lokasi,
penyebaran, peranan dalam bioteknologi, dan kepadatan genetik. Plasmid
berukuran lebih kecil dan hanya memiliki beberapa gen atau bahkan hanya satu,
sedangkan kromosom biasanya berukuran lebih besar dan terdiri dari sejumlah
besar gen. Kromosom mengandung gen yang diperlukan untuk proses dasar
seperti metabolisme dan reproduksi. Plasmid seringkali mengandung gen yang
membantu organisme bertahan dalam kondisi lingkungan yang sulit atau resisten
terhadap antibiotik tertentu. Plasmid terletak di dalam sitoplasma sel prokariotik,
sedangkan kromosom terletak di dalam ini sel pada sel-sel eukariotik atau terletak
dalam sitoplasma pada sel-sel prokariotik. Plasmid dapat ditransfer secara
horizontal antar organisme melalui proses konjugasi, transformasi atau transduksi,
sedangkan kromosom diturunkan secara vertikal dari induk ke keturunan. Plasmid
seringkali digunakan dalam teknologi rekayasa genetika sebagai vektor untuk
memasukkan DNA asing ke dalam sel. Kromosom digunakan untuk melakukan
analisis genetik lebih lanjut. Kromosom memiliki kepadatan genetik yang lebih
besar dibandingkan dengan plasmid, artinya lebih banyak gen per satuan panjang
DNA yang terdapat pada kromosom (Nusantari, 2015).
DNA dapat ditemukan di seluruh organisme hidup dan di berbagai bagian
tubuh seperti darah, rambut, kulit, air liur, air seni, sperma, saliva, dan banyak
lagi. Menurut Murakami (2007), DNA dapat ditemukan dari beberapa sumber,
diantaranya sebagai berikut:
1. Sel-sel hidup. DNA terdapat di dalam inti sel pada seluruh jenis organisme
hidup, baik itu tumbuhan, hewan, atau mikroorganisme.
2. Darah. Sel darah putih dan sel darah merah di dalam darah manusia
mengandung DNA.
3. Rambut. Folikel rambut mengandung DNA, sehingga rambut yang tercecer
atau plucked dapat memberikan sampel DNA.
4. Kulit. Sel-sel kulit yang mati dan terkelupas mengandung DNA.
5. Air liur. Air liur mengandung sel-sel dari dalam mulut yang mengandung
DNA.
6. Air seni. Sel-sel yang terlepas dari kandung kemih saat buang air kecil dapat
memberikan sampel DNA.
7. Sperma. Sperma mengandung DNA dan dapat diambil dari cairan ejakulasi
pria atau benda yang terkena ejakulasi.
8. Jaringan tubuh. Jaringan tubuh yang diambil melalui biopsi atau operasi juga
mengandung DNA.
9. Sumber arkeologis. DNA juga dapat diekstraksi dari sisa-sisa organisme yang
sudah mati, seperti fosil tulang atau gigi, sehingga dapat memberikan
informasi tentang evolusi dan sejarah kehidupan di masa lalu.
Sumber DNA yang berbeda dalam bidang bioteknologi, digunakan untuk berbagai
aplikasi, termasuk kloning, analisis genom, dan rekayasa genetika.
Menurut Zein dan Prawiradilaga (2013), DNA atau Deoxyribonucleic Acid
memiliki berbagai manfaat dalam berbagai bidang, diantaranya sebagai berikut:
1. Identifikasi dan Diagnostik Medis
DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi penyakit genetik dan
menyediakan informasi penting untuk perawatan medis. Tes DNA yang lebih
lanjut juga dapat membantu menentukan risiko terjadinya penyakit tertentu.
2. Kriminalistik
DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi tersangka kejahatan dan
menghubungkan mereka dengan bukti yang ditemukan di tempat kejadian.
3. Rekayasa genetika
 DNA digunakan dalam rekayasa genetika untuk memodifikasi genetika
tanaman, hewan, dan mikroba untuk menciptakan varietas baru yang lebih baik
atau menghasilkan produk-produk seperti insulin, antibiotik, dan vaksin.
4. Ilmu Forensik
DNA digunakan untuk mengidentifikasi korban kejahatan, seperti korban
kecelakaan mobil, kebakaran, dan bencana alam.
5. Paleontologi
DNA dapat diekstraksi dari fosil hewan purba dan manusia, sehingga
memberikan informasi tentang sejarah kehidupan dan evolusi di masa lalu.
6. Pengujian keturunan dan garis keturunan
Tes DNA dapat digunakan untuk menentukan hubungan keturunan antara
individu atau garis keturunan suatu keluarga.
7. Kloning dan rekayasa genetika
DNA juga digunakan dalam kloning hewan dan rekayasa genetika untuk
menghasilkan tanaman dan hewan yang lebih produktif atau memiliki
karakteristik khusus.
Manfaat DNA secara keseluruhan sangatlah luas dan terus berkembang seiring
dengan kemajuan teknologi dan pengetahuan ilmiah yang lebih baik.

2.1.1 Jenis-Jenis DNA

Jenis-jenis DNA yang ditemukan dalam sel dan organisme antara lain
sebagai berikut:
1. DNA Genomik.
DNA genomik adalah jenis DNA yang ditemukan dalam inti sel dan
mengandung semua informasi genetik yang diperlukan untuk mengatur fungsi
organisme. DNA genomik mengandung gen-gen yang mengodekan protein, RNA,
dan sejumlah elemen pengatur penting lainnya.
2. DNA Mitokondria
DNA mitokondria ditemukan dalam mitokondria, organel sel yang
bertanggung jawab untuk menghasilkan energi seluler. DNA mitokondria
biasanya lebih pendek dari DNA genomik dan hanya mengkodekan sejumlah
kecil gen.
3. DNA Kloroplas
DNA kloroplas ditemukan dalam kloroplas, organel yang terdapat pada sel
tumbuhan dan bertanggung jawab untuk fotosintesis. DNA kloroplas juga
biasanya lebih pendek dari DNA genomik dan hanya mengkodekan sejumlah
kecil gen seperti DNA mitokondria..
4. DNA Ribosom
DNA ribosom adalah jenis DNA yang ditemukan dalam ribosom, organel
yang bertanggung jawab untuk sintesis protein dalam sel. DNA ribosom biasanya
lebih pendek dari DNA genomik dan hanya mengkodekan sejumlah kecil gen.
5. DNA Plasmid
Plasmid adalah molekul DNA kecil yang ditemukan di dalam bakteri dan
beberapa jenis organisme lainnya. Plasmid biasanya mengandung beberapa gen
yang tidak diperlukan untuk fungsi organisme tetapi memberikan keuntungan
adaptif dalam kondisi lingkungan tertentu.
6. DNA Satelit
DNA satelit adalah sekuens DNA yang terdiri dari pengulangan singkat yang
diulang dalam susunan tertentu pada kromosom. DNA satelit tidak mengodekan
protein tetapi dapat digunakan untuk tujuan identifikasi individu atau penentuan
hubungan keturunan.
7. DNA Inti dan DNA Spermatozoa
DNA inti adalah DNA genomik yang terkandung dalam nukleus sel,
sementara DNA spermatozoa adalah DNA yang terkandung dalam sel sperma
pria. DNA inti dan spermatozoa dapat digunakan untuk tujuan analisis genetik
seperti identifikasi individu atau pengujian keturunan.
8. DNA Virus
DNA virus adalah virus yang mengandung DNA sebagai materi genetik.
Beberapa contoh virus DNA meliputi virus herpes, virus papiloma, dan virus
hepatitis B.
Jenis-jenis DNA di atas memiliki peran dan fungsi yang berbeda dalam sel dan
organisme (Murakami, 2007).

2.2 Isolasi DNA

DNA dapat disolasi atau dipisahkan dari zat - zat lain selain DNA. Prinsip-
prinsip yang digunakan untuk mengisolasi DNA yaitu pelisisan, ekstraksi,
pengendapan, dan pemurnian. Pelisisan yang dimaksud yaitu menghancurkan
dinding sel atau membran sel sehingga DNA di dalam sel tersebut dapat keluar
dari sel. Pelisisan tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan NLS maupun
melalui pemanasan. Ekstraksi merupakan penghancuran sel. Ekstraksi dapat
dilakukan secara mekanik yaitu dengan menumbuk sel tersebut. Prinsip
selanjutnya yaitu pengendapan. Pengendapan atau presipitasi bertujuan untuk
memisahkan supernatan dengan pellet. Pengendapan tersebut dapat menggunakan
sentrifugator (Sebayang dkk., 2020).
Isolasi DNA merupakan tahap awal dari DNA barcode. DNA barcode
merupakan teknik untuk mengidentifikasi suatu organisme melalui potongan gen
tertentu. Isolasi DNA secara tidak langsung bermanfaat untuk mengidentifikasi
semua bentuk tingkatan kehidupan mulai dari telur, larva, pupa, sampai dewasa
bahkan mampu digunakan untuk fragmen tubuh yang tidak diketahui asalnya.
Aplikasi dalam kehidupan yaitu dalam analisis forensik atau analisis penyakit
genetik (Zein dan Prawiradilaga, 2013).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain preparasi,
esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Isolasi DNA
meskipun dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau
bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda. Hal ini karena adanya
senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat
menghambat pemurnian DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka
kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang
berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang
berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Kadar air yang
semakin tinggi maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,
sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Sabrina dkk., 2022).
Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam
proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA. Metode yang digunakan juga harus efektif
dan bisa dilakukan untuk semua spesies, metode yang dilakukan tidak boleh
mengubah struktur dan fungsi molekul DNA serta harus sederhana dan cepat.

2.3 Plasmid
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya
dengan DNA kromosomal. Plasmid berbentuk sirkuler double helix dengan
ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Plasmid pada bakteri jumlahnya bervariasi
bahkan sampai ribuan, ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja tidak
terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi
ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang
dimiliki oleh bakteri tersebut, misalnya resistensi terhadap antibiotik. Plasmid
memiliki karakteristik antara lain dapat ditransfer ke bakteri lain dan memiliki
ORI (Origin of Replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan
dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ORI hingga semua plasmid
tereplikasi. Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil
(kurang lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik
yang penting untuk pertumbuhan bakteri. Gen informasi ini di alam sering
mengkode protein yang akan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik.
Plasmid mungkin merupakan hasil dari perkembangan heterotrop yang tertutup.
Bakteri sering tumbuh pada lingkungan yang sama dengan mold dan fungi serta
berkompetisi dengan mereka untuk mendapatkan makanan (bahan organik
kompleks). Mold dan fungi menghasilkan toksin sebagai hasilnya untuk
membunuh bakteri agar supaya menang dalam memperebutkan makanannya.
Bakteri menghasilkan plasmid untuk mempertahankan hidupnya dalam
menganggapi hal tersebut (Martani, 2020).
 Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar
DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara alamiah
pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukariotik yang berada secara simbiotik
maupun parasitik pada sel inang. Menurut Calladine dkk (2004), plasmid
berdasarkan fungsinya dapat dikelompokkan menjadi:
1. Fertility- F plasmids, merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke
sel bakteri lain untuk proses konjugasi. Plasmid ini juga mempunyai
kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik yang terdapat dalam
plasmid ataupun dalam kromosom. Plasmid ini ditemukan antara lain pada
Eschericia coli, Pseudomonas, dan Streptomyces.
2. Resistance- R plasmids, mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik
atau racun dan inhibitor pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan
pada Staphylococcus.
3. Plasmid penyandi bacterioci, adalah senyawa yang diproduksi oleh bakteri
untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain yang spesises atau galurnya
berbeda. Plasmid ini mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen
yang mengkode protein yang berperan dalam pemrosesan dan transport
bacteriocins. Penamaan plasmid ini tergantung pada organisme yang
memproduksinya, misalnya plasmid Col pada bakteri Escherichia coli yang
mengkode colicins.
4. Degradative plasmids, merupakan plasmid yang mampu mencerna substansi
yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat.
5. Virulence plasmids, merupakan plasmid yang menjadikan bakeri tersebut
patogen.
Plasmid berdasarkan jumlahnya di dalam sel dapat dibedakan menjadi:
1. Low copy number plasmid dimana dalam satu sel hanya mengandung satu atau
beberapa plasmid saja.
2. High copy number dimana dalam satu sel mengandung banayak plasmid
hingga ribuan. Contohnya bakteri E-coli.
Plasmid memiliki bentuk yang beragam, antara lain:
1. Supercoiled (covalently closed-circular), DNA plasmid berbentuk sirkular
dengan bentuk rantai yang terpilin.
2. Relaxed circular, kedua ujung DNA menyatu dan berbentuk sirkuler.
3. Supercoiled denature, kedua ujung DNA menyatu tapi pasangan basanya tidak
sempurna.
4. Nicked open circular, rantai DNA yang terpotong pada salah satu sisi saja
(Campbell, 2002).
Plasmid dengan berbagai macam bentuk akan mempengaruhi kecepatan
migrasi plasmid dalam elektroforesis. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid
tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated,
relaxed circular, dan nicked open circular. Plasmid dengan bentuk yang semakin
kecil atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui pori gel agarosa sehingga
akan mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Plasmid memiliki kegunaan dalam
rekayasa genetika, yaitu digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Plasmid
juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa
mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena
plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah
gen insert masuk atau tidak, dan memiliki copy number yang besar. Plasmid juga
mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. Plasmid memiliki fungi yang
bisa dimanfaatkan keuntungannya, oleh sebab itu ada banyak cara yang digunakan
untuk mengisolasi plasmid tersebut (Campbell et al., 2002).

Gambar 2.2 Struktur plasmid (Sumber: Campbell et al., 2002)

2.4 Isolasi DNA Plasmid

 DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen,
sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid
mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. DNA
plasmid dalam pemisahannya memerlukan beberapa perlakuan, pertama membran
sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA
kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom
dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA dan protein serta
potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang
mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan, kemudian
ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. DNA
plasmid kemudian dapat dipresipitasi menggunakan etanol (Triani, 2020).
Isolasi plasmid secara garis besar terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu
tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid.
Kultivasi vaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri
sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak.
Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar
dan membran dalam. Membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein,
fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan, sedangkan membran dalam tersusun
atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya. Lisis
dinding sel secara kimia dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia
seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil
sulfat). Fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat
magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun
mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. SDS yang
merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Hal ini
menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran se yang ditimbulkan akibat perusakan
oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang
tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA
dan RNA). Protein dari larutan dapat dihilangkan dengan menggunakan phenol
(mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan kloroform (membersihkan protein
dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan
DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Triani, 2020).

2.5 Sentrifugasi
Isolasi plasmid diawali dengan kultivasi bakteri yang mengandung plasmid
yang akan diisolasi. Untuk inang E. coli, umumnya bakteri dikultur selama 16-18
jam, karena pada umur tersebut pertumbuhan bakteri berada dalam fase
eksponensial. Pemanenan sel pada jam tersebut bertujuan untuk memperoleh
jumlah sel yang memadai sebagai sumber plasmid. Pemanenan sel dilakukan
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan proses pemisahan partikel
berdasarkan berat partikel. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Mujayana dan Nurjanna, 2015).

2.6 Elektroforesis
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering
dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekuler. Elektroforesis DNA secara
prinsip merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas
ukuran berat molekul dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan
antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan
sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp)
(Artati, 2013).
Elektroforesis dalam kegiatan biologi molekuler merupakan salah satu cara
untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA
dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan
migrasinya pada gel agarosa maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel
disebut sebagai elektroforesis. DNA agar dapat divisualisasikan yang terdapat
pada gel perlu diwarnai, kemudian dilihat di atas sinar ultraviolet. Pewarna yang
biasa digunakan adalah ethidium bromida (EB). EB dapat menangkap sinar
ultraviolet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat
molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar
ultraviolet. Kekurangan dari EB adalah sifatnya yang karsinogenik dan mutagenik
sehingga dapat membahayakan manusia dan lingkungan (Artati, 2013).
Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan fragmen DNA berdasarkan
ukurannya. Sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan gravitasi
sementara elektroforesis gel berarti memisahkan molekul dengan menggunakan
listrik. Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan
listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut
akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan
bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda)
(Klug dan Cummings, 1994).
 BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
Alat yang digunakan pada praktikum percobaan isolasi DNA plasmid ini
adalah beaker gelas, tabung reaksi, gelas kimia, pipet tetes, gelas ukur, mikro
pipet, microtubr, dan Tip (1000 µl, 20-200 µl, dan 0.5-10 µl).
3.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan praktikum percobaan isolasi DNA plasmid ini adalah
akuades, ddH2O, larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na2EDTA 10
mM pH 8), larutan II (NaOH 0.2 N 20 µL, SDS 1% 100 µL, aquades steril 880
µL), larutan III (Kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), fenol,
kloroform, isoamil alcohol, sampel 2 µl, dan buffer pembeban 3 µl.
3.2 Diagram Alir Percobaan
3.2.1 Isolasi Plasmid
Koloni tunggal transforman E.coli 5 mL media LB cair (kanamasin
2,5µL)
- diinokulasi
- diinkubasi pada shaker incubator bersuhu 37°C dengan
kecepatan 150 rpm selama 16 jam
Suspensi gel
- disentrifugasi sebanyak 5mL suspense gel selama 2 menit (kecepatan
1000 rpm pada suhu 4°C)
- disuspensi pellet dengan larutan I 100µL, dihomogenkan dan didiamkan
5 menit
- ditambah dengan larutan II 200µL (Fresh) dihomogenkan dengan cara
membolak-balik tabung eppendorf, lalu diinkubasi di es selama 15
menit
- ditambah dengan larutan III ( kalium asetat 5M, asam asetat glasial,
ddH2O dingin) 150µL, diinkubasi dalam es 10 menit
- disentrifugasi campuran selama 5 menit (kecepatan 12.000 rpm pada
suhu 4°C)

Supernatan Campuran fenol : kloroform :

isoamil alkohol (25:24:1)

- dipindah secara perlahan ke tabung eppendorf

- ditambah 1 kali volume total dan dikocok
Emulsi
- disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit dan
- diinkubasi dalam es selama 1 jam
- disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit
- dicuci pellet dengan etanol dingin 70% dan sentrifugasi lagi
 - dikeringkan tabung eppendorf dari etanol dilarutkan
- dilarutkan dalam 30 μL ddH2O

DNA plasmid

3.2.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

0,4gram agarosa 40 mL buffer TAE

Agarosa terlarut

- dilarutkan dengan pemanasan

- didinginkan hingga temperatur 45°C
- dituangkan dalam cetakan dan
- dibiarkan memadat

Sampel Buffer pembeban 1x

- dielektroforesis dalam bufer TAE

pada tegangan 70−100 volt
- dihentikan ketika bromofenol biru
telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari
panjang gel
- direndam gel agarosa dalam larutan
EtBr 250 μg/mL selama 3−5 menit
- direndam dalam bufer TAE selama 5−10
menit

Pita-pita DNA

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Isolasi DNA Plasmid
 Koloni tunggal transforman E-coli dinokulasi kedalam 5 mL media Lb cair
yang mengandung 2,5 µL kanamisin dan diinkubasi pada shaker inkubator pada
suhu 37°C dengan kecepatan 150 pm selama 16 jam. Suspensi sebanyak 5 mL
disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C. Pellet
disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris Cl 2,5 mM pH 8, Na EDTA 10
mM pH 8) 100 µL dan dihomogenkan lalu didiamkan selama 5 menit. Larutan II
(NaOH 0,2 N uL, SDS 1% 100 ML, aquades steril 880 L) sebanyak 200 µL
ditambahkan dan dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung eppendorf.
Larutan diinkubasi dies selama 15 menit kemudian ditambahkan 150 µL larutan
III (Kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin) dinkubasi dalam es
selama 10 menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 12.000 rpm suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh dipindah secara
perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung eppendorf baru yang steril
dan ditambahkan campuran fenol : klorofom: isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali
volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit dan dihasilkan 3 lapisan. Fasa
paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa
paling atas adalah fasa cair. Fasa cair dipindah dengan hati-hati menggunakan
pipet dan dimasukkan dalam eppendorf baru yang steril., fase cair dipekatkan
dengan ditambahkan etanol absolute dingin 2 kali volume total dan dinkubasi
dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi campuran selama 5 menit dengan
kecepatan 12.000 pm. Pellet dicuci dengan etanol dingin 70% dan disentrifugasi
kembali. Kemudian dikeringkan tabung eppendorf dengan cara membalikkan
tabung selama 5 menit. Dilarutakan pellet dalam 30 µL ddH2O.
3.3.2 Analisis DNA dengan Elektroforensis Gel Agarosa
Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 40 mL
buffer TAE (40 mM Tris-asetat dan 1 mM Na-EDTA Ph 8/ stok buffer TAE 5X :
24,2 gram, 5,72 mL asam asetat glasial dan 10 mL EDTA (pH 8) dengan
pemanasan. Agarosa setelah terlarut dan didinginkan sampai kira-kira temperatur
45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel
yang akan dielektroforesis dicampur dengan buffer pembeban 1 x (buffer
pembeban 6x: bromofenol biru 0,25% (b/v), dan sukrosa 40% (b/v)).
Elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 70-100 Volt.
Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3
dari panjang gel. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan EtBr 250 μg/mL
selama 3-5 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit
atau akuades. Pita-pita DNA yang dihasilkan dapat diamati dengan sinar UV.
 BAB 4. PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Tabel Hasil Analisis DNA Plasmid dengan Elektroforesis Gel Agarosa
No Perlakuan Hasil
1. Pembuatan gel agarosa 1 % dengan Larutan gel agarosa, tidak
berwarna
cara melarutkan 0,4 gram agarosa
dalam 40 mL
buffer TAE + dipanaskan
2. Penambahan EtBr ke dalam Gel berwarna kemerahan,
namun saat diaduk berubah
gel agarosa + diaduk
menjadi tidak berwarna
3. Gel agarosa dituangkan pada Terbentuk gel agarosa padat
cetakan
4. Sisir pada cetakan diangkat Terbentuk lubang-lubang kecil
adalah sumur

5. Gel agarosa direndam dengan Gel tidak berwarna

buffer TAE
6. 10 µl sampel DNA plasmid+ 5 µl Muncul warna biru pada sumur
buffer pembeban

7. Proses elektroforesis di dalam Warna biru dari bromfenol

biru bermigrasi 2/3 bagian dari
buffer TAE pada tegangan 40 V
panjang gel

8. Disinari UV Pita plasmid tidak terlihat

4.2 Pembahasan
DNA dapat disolasi atau dipisahkan dari zat - zat lain selain DNA. Prinsip-
prinsip yang digunakan untuk mengisolasi DNA yaitu pelisisan, ekstraksi,
pengendapan, dan pemurnian. Pelisisan yang dimaksud yaitu menghancurkan
dinding sel atau membran sel sehingga DNA di dalam sel tersebut dapat keluar
dari sel. Pelisisan tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan NLS maupun
melalui pemanasan. Ekstraksi merupakan penghancuran sel. Ekstraksi dapat
dilakukan secara mekanik yaitu dengan menumbuk sel tersebut. Prinsip
selanjutnya yaitu pengendapan. Pengendapan atau presipitasi bertujuan untuk
memisahkan supernatan dengan pellet. Pengendapan tersebut dapat menggunakan
sentrifugator (Sebayang dkk., 2020).
Percobaan kali ini akan melakukan isolasi DNA untuk mendapatkan
plasmid, metode yang digunakan pada proses analisisnya yaitu metode
sentrifugasi. Metode lain yang digunakan yaitu metode elektroforesis untuk
memurnikan hasil isolasi DNA plasmid, dengan medianya gel agarosa. Sampel
yang digunakan dalam percobaan ini yaitu sampel DNA Trans dan sampel DNA
Ladder. Tujuan dari percobaan ini yaitu untuk mengisolasi DNA plasmid,
mengetahui berat molekul DNA plasmid dan membedakan DNA plasmid.
Percobaan ini terdiri dari 2 perlakuan yaitu isolasi DNA plasmid pada sampel dan
analisis DNA dengan elektroforensis gel agarosa (Tim Penyusun, 2023).
Perlakuan pertama yang dilakukan yaitu penanaman bakteri pada suatu
media LB cair. Koloni tunggal transforman E.coli diinokulasikan ke dalam 5 ml
media LB cair yang mengandung 2.5 µL kanamisin. Bakteri E.Coli digunakan
untuk menghasilkan DNA plasmid karena mudah didapatkan dan dapat
menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu singkat. Bakteri E.Coli dipilih
yang terpenting karena memiliki komponen plasmid yang banyak sebagai
komponen dari DNA pada bakteri E.Coli tersebut. Fungsi dari inokulasi yaitu
untuk memperbanyak bakteri dengan cara menumbuhkannya atau
pengembangbiakan. Langkah selanjutnya diinkubasi pada shaker incubator pada
suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam. Hal ini berfungsi untuk
membantu proses replikasi dari bakteri E.Coli, sehingga jumlah DNA plasmid
dalam bakteri E.Coli akan semakin banyak. Fungsi shaker incubator yaitu untuk
menumbuhkan bakteri dan mencegah agregasi bakteri sehingga bakteri dengan
memiliki plasmid yang baik dan dapat diisolasi.
Perlakuan selanjutnya yaitu sebanyak 5 ml suspensi sel di sentrifugasi
selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 0C. Perlakuan ini
dilakukan pada suhu 4 0C atau suhu rendah untuk menjaga terjadinya denaturasi
dan didedgradasi protein rekombinan yang telah dieksperikan. Perlakuan ini juga
dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm untuk menjaga kestabilan selam proses
pemisahan, sehingga pelet dan supernatan dapat terpisah. Supernatan merupakan
cairan diatas endapan bakteri yang mengandung enzim, protein dan produk
metabolik yang dihasilkan bakteri selama proses pertumbuhan. Pellet merupakan
endapan padat yang terbentuk dari sel-sel bakteri yang telah tumbuh. Pellet
kemudian disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na
2EDTA 10 mM pH 8) 100 µL dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit.
Larutan I berfungsi untuk melarutkan pellet karena mengandung EDTA dan
berfungsi untuk meresuspensi sel. Glukosa yang terkandung didalam larutan I
berfungsi untuk meningkatan tekanan osmotik diluar sel yang mampu membantu
proses perlisisan. Larutan Tris-Cl pada pH 8 berfungsi untuk membantu proses
isolasi DNA dengan menjaga pH, yaitu saat pH diatas 5 dan dibawah pH 12
setelah sel dirusak. EDTA dalam larutan I berfungsi untuk menghancurkan sel
secara kimiwawi dan menghelat logam Mg2+ yang menjadi pusat aktif dari enzim
nuklease sehingga mencegah terdenaturasinya DNA oleh aktivitas DNase. Ion-ion
tersebut akan berikatan dengan EDTA membentuk kompleks. Kofaktor yang
berinteraksi dnegan EDTA akan menggangu kerja enzim DNase, karena ion
pengkelat yang terdapat didalam EDTa merupakan activator dari DNase, sehingga
DNase tidak dapat mendegradasi DNA. Hal ini merupakan alasan diperlukan
larutan EDTA karena untuk menghilangkan enzim DNase yang menggangu
proses isolasi DNA. Penambahan larutan 1 juga berfungsi untuk memecah
dinding sel dan melarutkan pellet. Larutan didiamkan sebentar selama 5 menit
untuk menunggu selama proses resuspensi sel berlangsung sehingga dihasilkan
pelet yang homogen, dengan larutan berwarna putih keruh. Fungsi pendiaman
yaitu untuk melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan bakteri.
Perlakuan selanjutnya yaitu ditambahkan 200 µL larutan II (Fresh) (NaOH
0.2 N 20 µL, SDS 1% 100 µL, aquades steril 880 µL) dan dihomogenkan dengan
cara membolak balik tabung Eppendorf, larutan di inkubasi di es selama 15 menit.
Fungsi penambahan larutan II yaitu untuk mengendapkan dinding sel bakteri.
Larutan NaOH befungsi untuk memberikan suasana basa pada medium sehingga
molekul DNA akan terdenaturasi dan basa komplementernya tidak akan saling
berikatan lagi. Keadaan tersebut akan memisahkan DNA kromosom dan DNA
plasmid. DNA plasmid yang terdenaturasi tidak akan mengalami pemisahan basa
komplementer karena strukturnya berbentuk sirkuler, sehingga dapat kembali
ternaturasi ketika larutan basa dinetralisasi. SDS yang terkandung dalam larutan II
akan berfungsi untuk merusak membran sel bakteri dan mendenaturasi protein
atau melisikan dinding sel. Membran sel akan dilisis atau dirusak pada bagian
fosfolipid (lemak) dan protein. Komponen- komponen sel akan keluar dari dalam
sel ketika membran sel telah mengalami kerusakan akibat proses lisis oleh SDS.
Pellet yang telah ditambahkan larutan II, kemudian diinkubasi sebentar selama 15
menit didalam es. Fungsi inkubasi yaitu untuk melihat pertumbuhan atau
perkembangbiakan bakteri.
Perlakuan selanjutnya yaitu ditambahkan 150 µL larutan III (Kalium
asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), di inkubasi dalam es selama 10
menit. Penambahan larutan III berfungsi untuk mempertahankan pH DNA
plasmid agar tidak rusak. Kalium asetat yang digunakan dalam larutan III
berfungsi untuk mengendapkan plasmid dan komponen seluler bakteri, serta
mengikat SDS dan merubah menjadi KDS (Kalium Desosil Sulfat), sehingga
kontaminan protein lebih mudah dibuang. Asam glasial berfungsi untuk
menetralkan pH, sehingga DNA plasmid dapat terenaturasi. Penambahan ddH2O
berfungsi untuk melarutkan kembali DNA plasmid yang telah menggumpal
karena proses sebelumnya. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C. Fungsi sentrifugasi yaitu untuk
memisahkan supernatan dan pellet.
Perlakuan selanjutnya yaitu supernatan yang diperoleh dipindah secara
perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril
dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali
volume total. Proses pemindahan ini bertujuan untuk mencegah terjadinya
kontaminasi sehingga diperoleh DNA plasmid yang lebih murni. Penambahan
larutan campuran tersebut berfungsi untuk melakukan tahap purifikasi yang
bertujuan untuk membersihkan sel dari zat-zat lainnya. Fenol yang terdapat dalam
larutan campuran berfungsi untuk mendegradasi protein. Kloroform yang terdapat
dalam larutan campuran berfungsi untuk mendegradasi lemak. Isomil alcohol
yang terdapat dalam larutan campuran berfungsi untuk memurnikan DNA plasmid
yang masih tercampur dnegan zat pengotornya. Zat pengotor yang dimaksud
dalam hal ini adalah protein yang mungkin masaih tercampur dengan
supernatannya. Fenol-kloroform dan air tidak dapat bersatu sehingga akan
terbentuk dua fase yakni fase air (fase aqueous) dan fase fenol-kloroform. Fenol-
kloroform lebih berat daripada air sehingga fasenya berada di bawah fase air.
Kedua fase kemudian dicampur dengan cara sentrifugasi. Pencampuran akan
membuat fenol merangsek ke dalam lapisan air dan membentuk emulsi turun.
Protein akan terdenaturasi dan terperangkap dalam fase fenol-kloroform,
sedangkan DNA tetap berada di air. Langkah selanjutnya yaitu dikocok sampai
terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit. Fungsi
sentrfifugasi yaitu untuk memisahkan supernatan dan pellet. Hasil yang diperoleh
yaitu larutan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah adalah
suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair. Fasa cair dipindah
dengan cara mempipet secara hati-hati kedalam tabung eppendorf baru yang steril.
Fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali
volume total. Fungsi penambahan etanol absolut yaitu untuk mengendapkan DNA
plasmid yang larut dalam fase cair. Etanol absolut yang ditambahkan harus
dalam keadaan dingin bertujuan agar plasmid yang terendap mejadi lebih
banyak. Hal ini dikarenakan etanol merupakan senyawa organik yang dapat
membatu proses pengendapan tanpa mempengaruhi produk dihasilkan.
Perlakuan selanjutnya fasa cair diinkubasi dalam es selama 1 jam. Fungsi
inkubasi yaitu melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan bakteri. Inkubasi
dilakukan dalam es berfungsi untuk menonaktifkan enzim-enzim yang mungkin
masih ada dan mengoptimalkan proses pengendapan pada suhu rendah yang
membantu proses pengendapannya. Hasil yang diperoleh setelah proses inkubasi
didalam es selama 1 jam adalah adanya pellet dibagian bawah eppendrof.
Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol
dingin 70% sentrifugasi lagi dan tabung eppendorf di keringkan dari etanol
dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Fungsi sentrifugasi
yaitu untuk memisahkan supernatan dan pellet. DNA plamid yang terbentuk
dalam bentuk pelet dipisahkan dari supernatannya yang mengandung NaOAc dan
etanol absolut. Pencucian dengan etanol dingin bertujuan untuk menghilangkan
pengotor sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya.
Pellet kemudian dikeringkan dengan membalik tabung eppendorf dan didiamkan
selama 5 menit untuk memastikan pelarutnya benar-benar hilang. Pellet
selanjutnya dilarutkan dalam 30 µL ddH2O. Fungsi penambahan ddH2O yaitu
untuk menjaga kondisi DNA agar tidak kering dan rusak.
Perlakuan selanjutnya yaitu analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa.
Hasil isolasi DNA plasmid selanjutnya dianalisis dengan elektroforesis gel
agarosa untuk mendeteksi apakah isolasi DNA ini berhasil atau tidak. Klug dan
Cummings (1994), menyebutkan bahwa elektroforesis gel agarosa merupakan
suatu teknik pemisahan berdasarkan muatan dan ukuran molekul dengan
menggunakan medan listrik. Proses elektroforesis dibantu dengan adanya
kekuatan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang berisi sampel
DNA.
Perlakuan pertama yang dilakukan adalah membuat gel agarosa 2% yang
dilakukan dengan menggunakan agarosa 0,8 gram dan dilarutkan dengan 40ml
buffer TAE (40 mM Tris-asetat dan 1 mM Na 2EDTA pH 8). Larutan kemudian
dipanaskan. Buffer TAE ini berfungsi untuk menambah aktivitas ionik dan juga
sebagai sumber ion yang mendukung konduktivitas, sehingga gel agarosa yang
dibuat bisa mempermudah fragmen DNA bergerak karena adanya kekuatan ionik.
Proses pemanasan bertujuan untuk mempercepat agarosa larut dalam larutan
buffer TAE. Hasil pelarutan dan pemanasan menunjukan bahwa agarosa larut dan
tidak berwarna.
Gel agarosa didinginkan terlebih dahulu sampai suhunya sekitar 450C sebelum
dituang ke dalam cetakan. Pendinginan bertujuan untuk memadatkan gel agarosa
sehingga dapat digunakan sebagai media untuk proses elektroforesis. Larutan
EtBr sebanyak 10 µL ditambahkan ke dalam cetakan gel agarosa sambil dilakukan
pengadukan secara perlahan. Larutan EtBr berfungsi untuk mengikat sampel dan
memunculkan warna flourecance ketika disinari sinar UV. Hasil yang diperoleh
setelah gel agarosa memadat dan sisir pada cetakan diangkat yaitu terbentuk
lubang-lubang yang disebut sebagai sumur pada gel agarosa. Perlakuan disisir
perlahan ketika cetakan diangkat bertujuan untuk membentuk lubang-lubang atau
yang biasa disebut sumur. Sumur digunakan untuk meloading DNA hasil isolasi.
Gel yang dihasilkan kemudian direndam dengan buffer TAE. Buffer TAE
berfungsi sebagai buffer running pada proses elektroforesis. Buffer TAE juga
berfungsi dalam menjaga kestabilan pH agar tetap memiliki pH 8 dan untuk
menambah aktivitas inonik serta sebagai sumber ion yang mendukung
konduktivitas. Hasil pencetakan agarosa adalah agarosa mulai memadat. Hasil
perubahan setelah ditambahkan EtBr menunjukkan adanya warna kemerahan.

Gambar 4.1 Pembuatan Gel Agarosa

Sampel DNA (plasmid) masing-masing dipipet sebanyak 10 µL kemudian
dicampur dengan 5 µL buffer pembeban (bromofenol biru 0,25% (b/v) dan
sukrosa 40% (b/v)). Bromofenol biru yang terdapa dalam buffer pembeban
berfungsi sebagai perwarna DNA yang akan dianalisis elektroforesis supaya dapat
dilihat visualisasi pemisahannya. Bromofenol blue akan mengindikasikan adanya
suatu pergerakan dari molekul DNA. Pewarna diperlukan karena DNA dan gel
agarosa sama-sama berwarna putih sehingga perlu ditambahkan pewarna pada
DNA untuk mempermudah pengamatan pergerakan DNA. Sukrosa 40% yang
terdapat dalam buffer pembeban berfungsi untuk membuat sampel menjadi lebih
berat sehingga sampel tidak akan keluar dari sumur. Buffer pembeban berfungsi
sebagai loading dye dalam menambah densitas, pewarna sekaligus sebagai tanda
proses migrasi molekul DNA. Percampuran sampel DNA dengan buffer
pembeban dilakukan pada media plastik dengan cara dipipet kemudian
dikeluarkan kemudian dipipet kembali. Hal tersebut dilakukan hingga tercampur
secara merata atau homogen. Hasil yang diperolah yaitu sampel berwarna biru
pada lubang atau sumur. Sampel kemudian dipipet dan dimasukkan ke dalam
sumur pada gel agarosa.
Proses elektroforesis dimulai ketika alat elektroforesis dihubungkan dengan
power supply dan disetting dengan tegangan 60-70 volt dalam waktu 3 jam.
Pemberian voltase pada proses elektroforesis mempengaruhi kecepatan dari
pergerakan molekul DNA, dimana semakin tinggi voltase yang diberikan maka
semakin cepat dan mudah molekul DNA bergerak. Molekul DNA mengandung
gugus fosfat yang bermuatan negatif sehingga akan bergerak menuju area yang
bermuatan positif. Ukuran DNA yang kecil akan mudah bergerak sehingga
migrasi lebih cepat dibandingkan dengan DNA berukuran besar, proses
elektroforesis dihentikan ketika pewarna bromofenol biru telah bermigrasi 2/3
bagian dari panjang sel.
Gel agarosa yang telah dilakukan proses elektroforesis kemudian direndam
dalam larutan EtBr 25 µg/mL selama 5 menit dan kemudian direndam dalam
buffer TAE selama 10 menit. EtBr disini berfungsi sebagai pengkelat atau
pengikat sinar UV, sehingga dapat memperjelas jejak-jejak DNA. Zat ini nanti
akan berinteraksi dengan molekul DNA yang bersifat basa dan akan
memunculkan warna orange flouresance ketika disinari UV. Flouresance molekul
DNA akan terlihat di transiluminator, EtBr pada DNA melekat pada ikatan basa-
basa DNA yang membentuk double helix. Etbr akan menginterkalasi diantara 2
untai-untai DNA berpencar ketika disinari sinar UV, sehinga muncul fragmen
DNA yang memisah sesuai ukurannya. Hasil yang diperoleh dalam percobaan
adalah sebagai berikut.
 Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis DNA Plasmid
Hasil elektroforesis plasmid tidak berhasil hal tersebut ditunjukan pada
gambar 4.2 yang mana pada gambar tersrebut pita DNA plasmid tidak tampak.
Hal tersebut disebabkan karena kemungkinan DNA masih tercampur dengan
bahan-bahan lain seperti protein, karbohidrat dan lain-lain. Hal terseut
menunjukan DNA berhasil terbentuk namun belum murni. Faktor penyebab
kebagalan elektroforesis yaitu suhu lingkungan yang tidak stabil serta konsentrasi
gel yang tidak akurat. Hal tersebut menyebabkan gel yang sudah dilakukan inject
dengan sampel mudah rusak dan tidak dapat dilakukan penyinaran menggunakan
sinar UV. Sampel pada sumur 1 berperan sebagai kontrol positif dimana hasil
yang diperoleh adalah tidak nampak pita. Percobaan tersebut menunjukan bahwa
pergerakan DNA plasmid berjalan lambat. Hal tersebut disebabkan DNA plasmid
mempunyai berat yang lebih besar, sehingga pergerakan DNA plasmid menjadi
lambat dan pita DNA tidak muncul. Ketidaksesuaian ini terjadi ini terjadi karena
sampel bisa saja tidak mengandung DNA karena DNA telah rusak atau terdapat
pengaruh lain seperti agen pengkelat tidak bekerja dengan baik pada sampel. Hasil
dari analisis ini seharusnya memungkinkan kita untuk melihat pita yang terbentuk,
namun tidak dapat mengukur panjang serta ukuran DNA itu sendiri. Percobaan ini
tidak sesuai literatur Artati (2013), yang menyatakan bahwa DNA hasil
elektroforesis dengan menggunakan pewarnaan pada larutan gel agarosa dapat
divisualisasikan dengan baik.
 BAB 5. KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan kali ini yaitu sebagai berikut:
1. Proses isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan beberapa cara salah
satunya dengan metode alkalis lisis dalam suasana basa. Metode ini dapat
dilakukan dengan beberapa tahap yaitu lisis, denaturasi, renaturasi/netralisasi
dan purifikasi. Proses pemisahan dari hasil lisis dapat menggunakan metode
sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi yaitu pemisahan berdasarkan perbedaan berat
molekulnya. Berat molekul yang lebih kecil akan menjadi supernatan yang
terletak dilapisan atas dan apabila berat molekulnya lebih besar akan menjadi
pellet yang letaknya dilapisan bawah. Pemurnian dari hasil isolasi DNA bisa
menggunakan metode analisis elektroforesis dengan media pergerakan
fragmen molekul DNA pada gel agarosa.
2. Penentuan berat molekul DNA plasmid dapat dilakukan dengan cara
elektroforesis. Elektroforesis DNA secara prinsip merupakan teknik untuk
memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran berat molekul dan struktur
fisik molekulnya. Elektroforesis dapat digunakan untuk memperkirakan berat
molekul DNA plasmid.
3. DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosom dan DNA ekstrakromosomal
seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. DNA plasmid (± 2 kb)
memiliki ukuran yang lebih kecil dibandingkan dengan DNA kromosom (>0,5
Mb). Plasmid dan kromosom memiliki perbedaan dalam hal ukuran, fungsi,
lokasi, penyebaran, peranan dalam bioteknologi, dan kepadatan genetik.

5.2 Saran
Saran yang dapat diberikan pada praktikum percobaan kali ini yaitu praktikan
sebaiknya memahami prosedur dengan baik dan melakukan praktikum sesuai
dengan petunjuk praktikum serta dilakukan dengan teliti. Hal tersebut bertujuan
agar tidak terjadi kesalahan dan hasil yang diperoleh sesuai dengan literatur.
 DAFTAR PUSTAKA

Artati, D. 2013. Sensitivitas Gel Red Sebagai Pewarna DNA pada Gel
Elektrolisis. Buletin teknik Litkayasa Akuakultur. 11(1): 11-14.
Baruno, A. 2021. Peningkatan Kemampuan Berpikir Analisis pada Materi Genetik
Melalui Model Pembelajaran Guided Inquiry Terintregasi Virtual Lab.
Jurnal Karya Ilmiah Guru. 6(2): 176-182.
Calladine, C.R., R.D Horace., F.L Ben., and A.T Andrew. 2004. Understanding
DNA. Amsterdam: Academic Press.
Campbell, N.A., J.B Reece., and L.G Mitchell. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta:
Erlangga.
Klug, W.S., and M.R Cummings. 1994. Concepts pf Genetics. Colombus: Charles
E.Merrill Publishing.
Martani, N.S. 2020. merA Echerichia Coli. Bandung: Media Sains Indonesia.
Mujayana., dan Nurjanna. 2015. Teknik Isolasi DNA Plasmid dari Bankteri
Terkonstruksi Gen Antivirus PMAV. Buletin Teknik Litkayasa
Akuakultur. 13(1): 67-71.
Murakami, K. 2007. The Divine Message Of The DNA. Bandung: Mizan Pustaka.
Nishiguchi, M.K., P. Daukakis., and M. Egan. 2002. DNA Isolation Procedures.
Berkauser: Bassel (SWZ).
Nusantari, E. 2015. Genetika. Yogyakarta: Deepublish.
Sabrina., Z. Suhaemi., dan S.G Hidayati. 2022. Intensitas dan Presentase
Keberhasilan Isolasi DNA Darah Itik Lokal Sumatera Barat pada Lama
Inkubasi Lysis Sel yang Berbeda. Jurnal Inspirasi Peternakan. 2(2): 293-
298.
Sebayang, R., Y. Idawati., dan H. Sinaga. 2020. Analisis Lactat Dehydrogenase
dalam Serum Darah Menggunakan Sentrifugasi. Jurnal Keperawatan
Silampari. 4(1): 274-280.
Suryo. 2004. Genetika Strata 1. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.
Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer: Verlag
Publisher
Susanto, A.H. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Purwokerto: Universitas
Jenderal Sudirman.
Tim Penyusun. 2023. Petunjuk Praktikum Biomolekul. Jember: Universitas
Jember.
Triani, N. 2020. Isolasi DNA Tanaman Jeruk dengan Menggunakan Metode
CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). Jurnal Teknologi Terapan.
3(2): 221-226.
Zein, S.A., dan D.M. Prawiradilaga. 2013. DNA Barcode Fauna Indonesia.
Jakarta: Kencana.

RENCANA HASIL/LEMBAR PENGAMATAN

NAMA : RAHAJENG ABIGAIL FAPINGALA

KELOMPOK/KELAS : 3A/Ap
ASISTEN : RISA ANGGRAINI

No Perlakuan Hasil
1. Pembuatan gel agarosa 1 % dengan
cara melarutkan 0,4 gram agarosa
dalam 40 mL
buffer TAE + dipanaskan
2. Penambahan EtBr ke dalam
gel agarosa + diaduk
3. Gel agarosa dituangkan pada
cetakan
4. Sisir pada cetakan diangkat
Larutan gel agarosa, tidak
berwarna
Gel berwarna kemerahan,
namun saat diaduk berubah
menjadi tidak berwarna
Terbentuk gel agarosa padat
Terbentuk lubang-lubang kecil
adalah sumur

5. Gel agarosa direndam dengan Gel tidak berwarna

buffer TAE
6. 10 µl sampel DNA plasmid+ 5 µl Muncul warna biru pada sumur
buffer pembeban

7. Proses elektroforesis di dalam Warna biru dari bromfenol

biru bermigrasi 2/3 bagian dari
buffer TAE pada tegangan 40 V
panjang gel

8. Disinari UV Pita plasmid tidak terlihat