Oleh :

NANDA AKBARIL (1410421025)

RAHAYU PERTIWI (1410422005)

“Penanda Genetika”
1 4
PENGERTIAN RFLP METODE RFLP

2 5
PRINSIP DASAR RFLP APLIKASI RFLP

3 6
KELEBIHAN DAN BEDAH JURNAL
KEKURANGAN RFLP TERKAIT RFLP
 RFLP merupakan Marka molekuler yang RFLP dapat berfungsi sebagai
menggunakan enzim restriksi dalam penduga variasi DNA. RFLP
mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA bersifat kodominan sehingga
dapat mendeteksi adanya
heterozigositas dan tidak
diperlukan informasi sekuens
Analisis RFLP adalah salah satu teknik
target
pertama yang secara luas digunakan untuk
mendeteksi variasi pada tingkat sekuens
DNA.

Deteksi RFLP didasarkan pada adanya kemungkinan untuk

membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan
pemotongan oleh enzim restriksi terhadap DNA target
(Fatchiyah, Arumingtyas, Widyarti dan Rahayu, 2011)
 enzim restriksi akan
memotong DNA pada
sekuens yang spesifik
dimana hasil pemotongan
tersebut kemudian dianalisa
dengan elektoforesis gel
agarosa (Fatchiyah dkk, 2011).
 Kelebihan
• Menduga hubungan kekerabatan dari beberapa
individu yang dianalisis,
• Menduga ada tidaknya variasi genetik dari
koleksi plama nutfah
• Memonitor proses seleksi (melalui linkage)
berbagai karakter
• Memilah-milah komponen genetik dari karakter
kuantitatif
• Menganalisis gen yang berasal dari proses
transformasi genetik
• Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi
adanya heterozigositas
• Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi
pada tingkat spesies, populasi.
Kekurangan
• Dibutuhkannya DNA dengan kemurnian yang
tinggi dalam jumlah banyak;
• Tidak mungkin dilakukan otomatisasi
• Pada beberapa spesies mempunyai level
polimorfisme yang rendah
• Sedikit lokus yang terdeteksi
• Memerlukan pustaka probe yang sesuai
• Membutuhkan waktu yang banyak
• Membutuhkan biaya yang besar
(Fatchiyah, Arumingtyas, Widyarti dan Rahayu, 2011)
Isolasi DNA

Pemotongan dengan Enzim

Restriksi dan Elektroforensis Gel

Transfer DNA

Hibridisasi
 Isolasi DNA
Metode untuk mendapatkan asam Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA
deoksiribonukleat dari suatu makhluk untuk dianalisa atau dimanipulasi yang
hidup. harus diisolasi terlebih dahulu dan murni
kandungannya.

dengan memecah, menghancurkan dan

Prinsip dasar isolasi DNA
mengekstraksi jaringan atau sel sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel
jaringan, DNA, dan RNA.

(Wilson dan John, 2010)

Tahap Isolasi DNA
1. Pelisisan Proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel (Holme dan Hazel,
1998).
Cara fisik seperti menggerus sampel dengan Cara kimiawi seperti penggunaan detergen
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel
cair (Giacomazzi et al., 2005). sehingga terjadi destabilisasi membran sel
(Surzycki, 2000).

Cara enzimatik menggunakan proteinase K untuk

melisiskan membran pada sel darah serta
mendegradasi protein globular maupun rantai
polipeptida dalam komponen sel (Khosravinia et al.,
2007).
Tahap Isolasi DNA
2. Sentrifugasi Memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas
(Fatchiyah dkk, 2011).

3. Ekstraksi Didapat ekstrak nukleus sel.

• Digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang

berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi.

• EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan
kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse dengan cara dikocok
berulang kali (Corkill dan Rapley, 2008).
Tahap Isolasi DNA
4. Purifikasi Bertujuan untuk membersihkan nukleus sel dari kontaminan seperti
senyawa sekunder (fenol) dan polisakarida, RNA dan juga protein
(Fatchiyah dkk, 2011).
• Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA dilakukan menggunakan senyawa
kloroform isoamilalkohol, asam asetat, dan enzim RNAse.

• Senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi mendenaturasi protein

sedangkan enzim RNAse berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut
(Fatchiyah dkk, 2011).
5. Sentrifugasi Berfungsi untuk memisahkan senyawa DNA dari campuran material
dan komponen intraceluler yang mengandung larutan kompleks
berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat (Fatchiyah dkk, 2011).
Tahap Isolasi DNA
6. Presipitasi Bertujuan untuk mengendapkan protein, sehingga untai-untai
DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang menyebabkan DNA
menjadi terlihat (Fatchiyah dkk, 2011).

• Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan menggunakan isopropanol dingin yang

bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul sekaligus memisahkannya dari
garam-garam mineral sisa (Fatchiyah dkk, 2011).
 Pemotongan dengan Enzim Restriksi

DNA murni DNA akan dipotong dengan enzim restriksi

hasil isolasi endonuclease yang akan membentuk
potongan DNA spesifik.

Enzim Restriksi Endonuklease Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong

memotong DNA tepat pada ikatan DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang mampu
fosfodiester mengenali urutan nukleotida.

Enzim restriksi diisolasi dari bakteri. Enzim restriksi biasanya terdapat

dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-
nya sendiri dari pemotongan, yaitu DNA-metil transferase (dnmt).
(Fatchiyah dkk, 2011).
Enzim Restriksi dengan Sekuens Pengenalnya
 Hasil Pemotongan
Pemotongan enzim restriksi akan
menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif
(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Sticky end : bersifat Blunt end : bersifat

lengket mudah untuk tumpul dan sulit
disambung untuk disambung
(Fatchiyah dkk, 2011)
 Faktor yang mempengaruhi kerja enzim restriksi

1. Suhu
2. pH
3. Kekuatan ionik
4. Pengaruh kation
5. Waktu reaksi
6. Komposisi Buffer
7. Lama Inkubasi
(Fatchiyah dkk, 2011)
 Elektroforensis Gel
Suatu proses migrasi molekul bermuatan di
dalam suatu media yang bermuatan listrik,
dimana kecepatan migrasinya tergantung
pada muatan, ukuran dan bentuk setiap
molekul yang terlibat (Sambrook et al.,1989).

Prinsip dasar
Saat elektroforesis berlangsung, protein akan
bergerak dari elektroda negatif menuju
elektroda positif sampai pada jarak tertentu
pada gel tergantung pada berat molekulnya
(Fatchiyah dkk, 2011).
 Elektroforensis Gel

Hasil
• Akan membentuk pola khusus untuk setiap
sampel.
• Pola dapat dilihat dengan pewarnaan
etidium bromide

(Sambrook et al.,1989).
 Transfer DNA

DNA yang telah diperoleh kemudian

ditransfer ke membran nitroseluloasa,
tahap inilah yang disebut dengan
blotting.

Salah satu metode tahapan transfer DNA

ke membran nitroselulosa yang
berdasarkan pada Prinsip Kapilaritas

Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat Proses transfer DNA dengan prinsip
cair pada pembuluh, celah atau pori-pori kapilaritas
kecil
(Fatchiyah dkk, 2011).
Fragmen-fragmen DNA hasil pemisahan pada gel
elekrtoforesis kemudian didenaturasi dengan larutan
bufer denaturan. Biarkan pada kondisi suhu ruang

Siapkan wadah dan baki, penyangga, pembatas, batangan kaca,

beberapa lembar membran filter seperti membran 3M dengan ukuran
yang telah ditentukan, membran nilon, setumpuk kertas tisu yang
punya daya serap rendah, untuk memaksimalkan hasil transfer dari
larutan bufer, dan larutan bufer transfer.

Proses DNA transfer akan berlangsung dari bawah

ke atas, bufer akan diserap secara perlahan
sehingga DNA akan berpindah ke membran secara
sempurna.

Setelah proses transfer DNA berlangsung semalaman, maka buang

kertas tisu dan untuk melekatkan DNA secara kuat lakukan cross-link
dengan UV linker atau sinar UV panjang gelombang 240 nm sekitar 2
menit. Setelah langkah ini, membran siap untuk dilakukan
prehibridisasi dan hibridisasi.
(Fatchiyah dkk, 2011).
Proses transfer kapiler DNA dari gel agarosa ke membran
 Hibridisasi
Proses identifikasi gen-gen hasil analisis
RFLP dengan restriksi enzim yang sesuai Proses hibridisasi dan visualisasi
dan diidentifikasi dengan fragmen gen diawali dengan transfer DNA dari gel
target yang spefisifik yang telah diberi label agarosa ke nilon berpori atau
baik dengan radioaktif maupun non membran nitroselulosa.
radioaktif.

Proses denaturasi atau pemisahan dua rantai

asam nukleat yang komplementer.
2 proses
Proses denaturasi atau perpaduan kembali
dua rantai asam nukleat.
(Fatchiyah dkk, 2011).
Langkah Kerja Hibridisasi

Prinsip metode hibridisasi DNA sederhana.

Sebelum hibridisasi, dilakukan prehibridisasi
dengan larutan denaturan.

Membran didenaturasi di bufer denaturasi, sehingga kita mempunyai membran dengan pita
tunggal DNA dan proses prehibridisasi.

1. Lakukan inkubasi pada suhu 60°C semalaman,

2. kemudian masukkan ke kantong plastik yang sesuai ukuran membran dan berisi cairan
probe spesifik yang juga merupakan pita tunggal DNA.
3. Plastik ditutup rapat, hindari adanya gelembung di dalamnya karena akan
menghambat kerja probe. Bila ada gelembung, keluarkan hati-hati secara vakum.
4. Untuk penggunaan probe radioaktif, gunakan wadah khusus untuk proses hibridisasi
ini, letakkan membran di wadah tersebut dan masukkan larutan probe sesedikit
mungkin. (Fatchiyah dkk, 2011)
Langkah Kerja Hibridisasi

5. Inkubasi pada suhu 60°C sampai waktu yang telah ditetapkan.

6. DNA probe akan menghibridisasi urutan basa nukleotida yang komplemen saja,
sedangkan urutan basa lainnya tidak.
7. Kemudian, cuci membran sampai bersih dari sisa larutan probe. Bila menggunakan
probe radioaktif, perhatikan pembuangan sisa larutan probe maupun larutan pencuci
yang harus dibuang di tempat khusus yang terlabel rdioaktif, karena pembuangan
akhir akan ditangani oleh lembaga khusus yang bertanggung jawab terhadap
keamanan zat-zat radioaktif.
8. Visualisasi hasil hibridisasi dilakukan di ruang gelap.
9. Membran diekspos dengan sinar-X pada film khusus, kemudian, film dicuci seperti
mencuci film pada umumnya. Setelah film dicuci, kemudian dikeringanginkan. Hasil
bisa diidentifikasi di atas boks lampu.
(Fatchiyah dkk, 2011).
 DNA terikat di membran

Hibridisasi
dengan probe
spesifik

Probe berikatan
dengan fragmen DNA
target

Visualisasi pada
Prose sisanya film hasil sinar-
dicuci dari X
membran
Visualisasi potongan DNA yang telah dipotong dengan
enzim restriksi dan dilabel dengan marker spesifik
Deteksi DNA
Merupakan tahap lanjutan dari proses
hibridisasi DNA yang menggunakan
pelacak/probe.

Pada tahap deteksi DNA digunakan

Autoradiogram untuk melihat lokasi sinyal
DNA.
Probe biasanya merupakan DNA yang
dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas
spesifik radionukletida.

(Fatchiyah dkk, 2011).

 Mendeteksi diversitas genetik, hubungan kekerabatan,
sejarah domestifikasi, asal dan evolusi suatu spesies, aliran
gen dan seleksi,
Membuat linkage map yaitu peta untuk mengidentifikasi lokus
gen yang spesifik dan mempunyai kemampuan yang tinggi
untuk
Mengidentifikasi perbedaan pada tingkat populasi, spesies,
atau individu A

Pengamanan gen-gen target yang akan diekspresikan

Alat untuk mengetahui varialibitas genetik pada tanaman

pangan
(Fatchiyah dkk, 2011)
Corkill, G dan Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques in Molecular Biomethods Handbook
Second Edition. Humana Press. New Jersey, USA.
Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S., Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular, Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta.
Giacomazzi, S., Lerol, F., dan Joffraud, J. J. 2005. Comparison of Three Methods of DNA Extraction from Cold-Smoked Salmon
and Impact of Physical Treatments. Journal of Applied Microbiology. 98: 1230-1238
Holme, D. J dan Hazel, P. 1998. Analytical Biochemistry. Pearson Education Limited. Inggris.
Khosravinia, H dan Ramesha, K. P. 2007. Influence od EDTA and Magnesium On DNA Extraction From Blood Samples and
Specificity of Polymerase Chain Reaction. African Journal and Biotechnology. 6(3): 184-187
Sambrook, J., Fritsch, E. F dan Maniati, T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab Press. USA.
Surzcki, S. 2000. BasicTechniques in Molecular Biology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Jerman.
Switzer. 1999. Experimental Biochemistry. Blackwell Scientific Pub. Oxford.
Wilson, K dan John, M. W. 1994. Principles and Techniques od Practical Biochemistry. Cambridge University Press. United
Kingdom.