DNA REKOMBINAN

DNA REKOMBINAN

• SECARA GARIS BESAR MELIPUTI

 ISOLASI DNA KROMOSOM DAN DNA VEKTOR,
 PEMOTONGAN DNA MENGGUNAKAN ENZIM RESTRIKSI,
 PEMBENTUKAN MOLEKUL DNA REKOMBINAN, DAN
 TRANSFORMASI SEL INANG OLEH MOLEKUL DNA REKOMBINAN.
• DNA REKOMBINAN =
melibatkan upaya perbanyakan gen
tertentu di dalam suatu sel yang bukan
sel alaminya sehingga sering pula
dikatakan sebagai kloning gen.
Rekayasa gen
menyebutkan bahwa teknologi DNA
rekombinan adalah pembentukan
kombinasi materi genetik yang baru
Definisi
dengan cara penyisipan molekul DNA ke
representatif
dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya untuk terintegrasi dan
mengalami perbanyakan di dalam suatu
sel organisme lain yang berperan sebagai
sel inang.
 MANFAAT TEKNOLODI DNA
REKOMBINAN
Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan
diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya.

Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih
cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
 TAHAPAN-TAHAPAN TEKNOLOGI DNA
REKOMBINAN
• UPAYA UNTUK MENDAPATKAN SUATU PRODUK YANG DIINGINKAN MELALUI TEKNOLOGI DNA
REKOMBINAN MELIBATKAN BEBERAPA TAHAPAN TERTENTU
 ISOLASI DNA GENOMIK/KROMOSOM YANG AKAN DIKLON,
 PEMOTONGAN MOLEKUL DNA MENJADI SEJUMLAH FRAGMEN DENGAN BERBAGAI UKURAN,
 ISOLASI DNA VEKTOR,
 PENYISIPAN FRAGMEN DNA KE DALAM VEKTOR UNTUK MENGHASILKAN MOLEKUL DNA REKOMBINAN,
 TRANSFORMASI SEL INANG MENGGUNAKAN MOLEKUL DNA REKOMBINAN,
 REISOLASI MOLEKUL DNA REKOMBINAN DARI SEL INANG, DAN
 ANALISIS DNA REKOMBINAN.
ISOLASI DNA
ISOLASI DNA
ISOLASI DNA
TAHAP PELISINAN
LANJUTAN
TAHAPAN SENTRIFUGASI
TAHAP EKSTRAKSI
TAHAP PELISINAN
TAHAP PURIFIKASI
TAHAP SENTRIFUGASI
TAHAP PRESIPITASI
JENIS-JENIS DAN MEKANISME KERJA ENZIM
RESTRIKSI

http://biogen.litbang.pertanian.go.id/c/artikel/
 ENZIM RESTRIKSI
• SUATU ENZIM YANG BISA MEMOTONG UNTAIAN DNA SECARA SPESIFIK SESUAI DENGAN
URUTAN YANG DIKENALINYA, YAITU URUTAN NUKLEOTIDA YANG BERSIFAT PALINDROMIK,
• PALINDROMIK YAITU SUATU URUTAN DNA YANG SAMA JIKA DIBACA DENGAN ARAH
BERLAWANAN PADA SETIAP UNTAINYA. OLEH KARENA ITU, POSISI PEMOTONGAN DI DALAM
MOLEKUL DNA DAPAT DIPREDIKSI SEHINGGA MEMUNGKINKAN SEGMEN DNA TERTENTU
DIPOTONG DARI MOLEKUL DNA YANG LEBIH PANJANG.
• KEMAMPUAN MEMOTONG URUTAN DNA TERTENTU INI SANGAT PENTING DALAM KLONING GEN
DAN SELURUH ASPEK LAIN TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN.
• MISALNYA ECORI YANG HANYA BISA MENGENALI URUTAN (SEKUEN) 5′-G’AATCC-3′, BAMHI YANG
HANYA MENGENALI 5′-G’GATCC-3′.
• ENZIM RESTRIKSI BIASANYA TERDAPAT DALAM KOMBINASI DENGAN ENZIM PEMODIFIKASI LAIN YANG
MELINDUNGI DNA-NYA SENDIRI DARI PEMOTONGAN, MISALNYA DNA-METIL TRANSFERASE (DNMT).
DNMT AKAN MEMETILASI BASA DNA PADA TIAP UNTAI SEHINGGA SEKUEN YANG DIKENALI OLEH
ENZIM RESTRIKSI TIDAK AKAN TERPOTONG.
 Jenis-Jenis Enzim Retriksi
Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub unit,
posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya kofaktor.
1. Enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi antara restriksi dan
pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. Enzim ini secara
biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi kurang menguntungkan untuk digunakan
dalam percobaan di laboratorium.
2. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang
dikenalnya. Enzim ini menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik
pada gel agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan
kloning gen.
3. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA
di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada
untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang
sempurna.
 Mekanisme Kerja Enzim Restriksi
Enzim restriksi memotong DNA dalam dua cara dan hasil yang berbeda, yaitu :
1. Hasil pemotongan berujung tumpul (blunt atau flush end), Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas
DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI.
2. Hasil pemotongan berujung lancip atau lengket (sticky atau cohesive ends), Pola seperti ini lebih mudah menempel
(annealing) dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung.
a. Ujung menggantung 5’, Enzim ini memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil
pemotongan memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah
BamHI
b. Ujung menggantung 3’, Enzim ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, namun
menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini
adalah KpnI
 LIGASI MOLEKUL – MOLEKUL DNA
• PEMOTONGAN DNA GENOMIK DAN DNA VEKTOR MENGGUNAKAN ENZIM RESTRIKSI HARUS
MENGHASILKAN UJUNG-UJUNG POTONGAN YANG KOMPATIBEL.
ADA TIGA CARA YANG DAPAT DIGUNAKAN UNTUK MELIGASI FRAGMEN-FRAGMEN DNA
SECARA IN VITRO.
 PERTAMA, LIGASI MENGGUNAKAN ENZIM DNA LIGASE DARI BAKTERI.
 KEDUA, LIGASI MENGGUNAKAN DNA LIGASE DARI SEL-SEL E. COLI YANG TELAH DIINFEKSI
DENGAN BAKTERIOFAG T4 ATAU LAZIM DISEBUT SEBAGAI ENZIM T4 LIGASE.
 KETIGA TELAH , YAITU PEMBERIAN ENZIM DEOKSINUKLEOTIDIL TRANSFERASE UNTUK
MENYINTESIS UNTAI TUNGGAL HOMOPOLIMERIK 3’. DENGAN UNTAI TUNGGAL SEMACAM INI
AKAN DIPEROLEH UJUNG LENGKET BUATAN, YANG SELANJUTNYA DAPAT DILIGASI
MENGGUNAKAN DNA LIGASE.
 TRANSFORMASI SEL INANG
• ADALAH ANALISIS TERHADAP HASIL PEMOTONGAN DNA GENOMIK DAN DNA VEKTOR SERTA
ANALISIS HASIL LIGASI MOLEKUL-MOLEKUL DNA TERSEBUT
• TEKNIK TRANSFORMASI PERTAMA KALI DIKEMBANGKAN PADA TAHUN 1970 OLEH M. MANDEL DAN
A. HIGA, YANG MELAKUKAN TRANSFORMASI BAKTERI E. COLI. SEBELUMNYA, TRANSFORMASI PADA
BEBERAPA SPESIES BAKTERI LAINNYA YANG MEMPUNYAI SISTEM TRANSFORMASI ALAMI
SEPERTI BACILLUS SUBTILIS TELAH DAPAT DILAKUKAN.
• KEMAMPUAN TRANSFORMASI B. SUBTILIS PADA WAKTU ITU TELAH DIMANFAATKAN UNTUK
MENGUBAH STRAIN-STRAIN AUKSOTROF (TIDAK DAPAT TUMBUH PADA MEDIUM MINIMAL) MENJADI
PROTOTROF (DAPAT TUMBUH PADA MEDIUM MINIMAL) DENGAN MENGGUNAKAN PREPARASI DNA
GENOMIK UTUH. BARU BEBERAPA WAKTU KEMUDIAN TRANSFORMASI DILAKUKAN MENGGUNAKAN
PERANTARA VEKTOR, YANG SELANJUTNYA JUGA DIKEMBANGKAN PADA TRANSFORMASI E.COLI.
 TRANSFORMASI SEL INANG

• HAL TERPENTING YANG DITEMUKAN OLEH MANDEL DAN HIGA ADALAH PERLAKUAN KALSIUM KLORID (CACL2)
YANG MEMUNGKINKAN SEL-SEL E. COLI UNTUK MENGAMBIL DNA DARI BAKTERIOFAG L.
• PADA TAHUN 1972 S.N. COHEN DAN KAWAN-KAWANNYA MENEMUKAN BAHWA SEL-SEL YANG DIPERLAKUKAN
DENGAN CACL2 DAPAT JUGA MENGAMBIL DNA PLASMID.
• FREKUENSI TRANSFORMASI TERTINGGI AKAN DIPEROLEH JIKA SEL BAKTERI DAN DNA DICAMPUR DI DALAM
LARUTAN CACL2 PADA SUHU 0 HINGGA 5ºC. PERLAKUAN KEJUT PANAS ANTARA 37 DAN 45ºC SELAMA LEBIH
KURANG SATU MENIT YANG DIBERIKAN SETELAH PENCAMPURAN DNA DENGAN LARUTAN CACL2 TERSEBUT
DAPAT MENINGKATKAN FREKUENSI TRANSFORMASI TETAPI TIDAK TERLALU ESENSIAL. MOLEKUL DNA
BERUKURAN BESAR LEBIH RENDAH EFISIENSI TRANSFORMASINYA DARIPADA MOLEKUL DNA KECIL
 SELEKSI TRANSFORMAN DAN SELEKSI REKOMBINAN

• SELEKSI UNTUK MEMILIH SEL INANG TRANSFORMAN YANG MEMBAWA DNA REKOMBINAN
DILAKUKAN KARENA DNA YANG DIMASUKKAN KE DALAM SEL INANG BUKAN HANYA DNA
REKOMBINAN .
• SELANJUTNYA, DI ANTARA SEL-SEL TRANSFORMAN YANG MEMBAWA DNA REKOMBINAN
MASIH HARUS DILAKUKAN SELEKSI UNTUK MENDAPATKAN SEL YANG DNA REKOMBINANNYA
MEMBAWA FRAGMEN SISIPAN ATAU GEN YANG DIINGINKAN.
 SELEKSI TRANSFORMAN DAN SELEKSI REKOMBINAN

• ADA TIGA KEMUNGKINAN YANG DAPAT TERJADI SETELAH TRANSFORMASI DILAKUKAN, YAITU
• (1) SEL INANG TIDAK DIMASUKI DNA APA PUN ATAU BERARTI TRANSFORMASI GAGAL,
• (2) SEL INANG DIMASUKI VEKTOR RELIGASI ATAU BERARTI LIGASI GAGAL, DAN
• (3) SEL INANG DIMASUKI VEKTOR REKOMBINAN DENGAN/TANPA FRAGMEN SISIPAN ATAU GEN
YANG DIINGINKAN.

• SELEKSI SEL REKOMBINAN YANG MEMBAWA FRAGMEN YANG DIINGINKAN DILAKUKAN DENGAN
MENCARI FRAGMEN TERSEBUT MENGGUNAKAN FRAGMEN PELACAK (PROBE), YANG
PEMBUATANNYA DILAKUKAN SECARA IN VITRO MENGGUNAKAN TEKNIK REAKSI POLIMERISASI
BERANTAI ATAU POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).
SEKIAN
MONOMER DNA