(GENETIC ENGINEERING)
Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme
dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)
• Kloning gen untuk menentukan fungsinya
• Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat
yang diinginkan
Ditunjang Oleh
Teknologi
melalui
Bioteknologi
Selective Breeding
Tanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak
digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut
Hybridization (Crossbreeding)
Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan
karakteristik terbaik dari keduanya.
(burung dara + perkutut = sinom)
Recombinant DNA Technologies
Transformasi
Apa Rekayasa Genetika?
Definisi:
Teknik perubahan genetik suatu organisme, atau
keturunan, untuk menghilangkan karakteristik bahan
yang tidak diinginkan atau untuk menghasilkan
bahan yang baru yang diinginkan.
Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal
dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang
diinginkan
Teknologi DNA rekombinan meliputi:
Teknik pemotongan DNA (donor dan
vektor)
Teknik pembentukan DNA rekombinan
Teknik Kloning DNA rekombinan
Teknik penapisan hasil kloning DNA
Teknologi DNA Rekombinan
kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk
mengkombinasikan gen-gen secara buatan.
• Insulin (diabetics)
• Factor VIII (males w/hemophilia A)
• Factor IX (hemophilia B)
• Human growth hormone
• Erythropoietin (anemia)
• Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs)
• leptin
Kesulitan pada Rekayasa Genetika
Manusia
Inserting gene in correct cells
Inserting gene so it is expressed correctly
– Orientation
– Regulation
Controlling virus vector
Ethical issues
Teknik KLONING GEN
Kloning - definisi
Penamaan enzim
EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli)
R = strain
I = # of enzyme
Penyambungan (pasting) DNA
Pembentukan ikatan-
H pada ujung-ujung
yang komplemen
(sticky ends)
Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA
Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle)
untuk memasukkan suatu potongan
DNA ke dalam sel agar DNA tersebut
dapat disimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut
Vektor untuk Mengklon
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
3. Vektor Cosmid
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:
Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50
kbp)
Vektor Cosmid
4a. Vektor BAC
Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
parA and parB
mengendalikan agar
hanya terdapat satu
vektor dalam sel
Menggunakan penanda
ketahanan terhadap
KhloramfenikolR
4b. Vecktor YAC
large
inserts
Keunggulan:
Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran
sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida
total genom
Kelemahan:
Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat
besar
Memilih Vektor
Ukuran DNA yang
disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim restriksi
yang tersedia
Jumlah salinan (copy
number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan
Rencana penelitian
selanjutnya
Cara Mengklon DNA (1)
Isolasi vektor kloning (plasmid
bacterial) & DNA sumber gen
Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning menggunakan
enzim restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase
Cara Mengklon DNA (2)
Vektor kloning yang telah
tersisipi potongan DNA
dimasukkan ke dalam sel
inang (transformasi sel
inang)
Penapisan sel pengklon
(dan gen yang
dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon
pembawa gen yang
dikehendaki
Transformasi Sel Inang
PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan
kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2).
Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri
yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel
bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap
plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli
menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .
Transformasi
INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi
sel E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang
tidak ditambah plasmid digunakan sebagai
kontrol.
Transformasi
PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi
untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah
mengalami cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu
generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45
menit)
Transformasi
PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan
ditapis pada medium padat yang mengandung
senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa
oleh plasmid.
Koloni E. coli yang membawa
plasmid dengan penanda gen pendar
fluor (pGLO)
E. coli yang Membawa Plasmid pGlo
Penapisan Klon
Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang digunakan
sebagai penanda, misalnya
Kanamisin
Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid dengan
penanda ketahanan
terhadap Kanamisin(Kanr),
yang di sebelah kiri tidak
memilikinya
Manfaat
Contoh:
Bidang Kesehatan:
Insulin manusia
telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetis.
Merekdagang: HumulinR
Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk
mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).
Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi
secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri
Urutan sintesis protein dimulai dari DNA menjadi RNA dan
protein. Namun demikian kemajuan bidang rekayasa genetika
dapat membuat DNA dari RNA yaitu complementary DNA
(cDNA) dengan pemberian enzim transkriptase. Berikut
manakah sifat yang benar terkait cDNA ? .