Teknologi dna rekombinan

(GENETIC ENGINEERING)

DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.

Teknik Rekombinan meliputi:

-Teknik untuk mengisolasi DNA

-Teknik untuk memotong DNA.
-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.
-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup
sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan
dapat diekspresikan
Organisme transgenik:
organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis
organisme lainnya.

Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika

Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan

kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk
mengkombinasikan gen-gen secara buatan.
 Apa Rekayasa Genetika?
Definisi:
Perubahan genetik suatu organisme, atau keturunan,
teknik untuk menghilangkan karakteristik bahan yang
tidak diinginkan atau untuk menghasilkan bahan
yang baru yang diinginkan.

Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal

dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang
diinginkan
Isolasi dan pemurnian DNA
Isolasi DNA bakteri
Isolasi DNA plasmid
Pemurnian secara kimiawi dan enzimatis

Berbagai jenis dan karakterisasi vektor

vektor plasmid
vektor yeast
vektor bakteriofag

Enzim restriksi dan ligase

Jenis enzim restriksi
Faktor yang berpengaruh terhadap enzim restriksi
Faktor yang berpengaruh terhadap enzim ligase
Teknik Elektroforesis dan PCR
Faktor yang berpengaruh dalam elektroforesis
Faktor yang berpengaruh terhadap PCR

DNA sekuensing dan hibridisasi

southern blot
northern blot
western blot

DNA rekombinan dan Transformasi

Isolasi
Restriksi
Sel kompeten
Transformasi
 Rekayasa genetik pada :
Rekayasa genetik pada hewan
Rekayasa genetik pada tumbuhan
Rekayasa genetika pada manusia

Produk transgenik, keamanan dan bioetika

Biosafety
bioetika
GMO dan genetically modofied foods
Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai
teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah
gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan
Genetically Modified Organism (GMO) dengan
genotipe baru
Berbagai jenis modifikasi genetik yang mungkin: memasukkan
gen asing dari satu spesies menjadi
- spesies lain,
- membentuk organisme transgenik;
- mengubah gen yang ada sehingga produknya berubah, - mengubah
ekspresi gen sehingga ditranslasikan lebih sering atau tidak sama sekali
 MENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?

Awalnya manipulasi genetik secara tradisional

seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman
terlalu lambat

Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme
dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)
Kloning gen untuk menentukan fungsinya
Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat
yang diinginkan

Rekayasa genetika dengan teknik molekuler

Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar
pada kecepatan yang jauh lebih cepat
Produksi bahan farmasi dalam jumlah besar
 Teknik Dasar Rekayasa Genetika

Selective Breeding
Tanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak digunakan untuk
pemuliaan lebih lanjut

Hybridization (Crossbreeding)
Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan karakteristik terbaik
dari keduanya.
(burung dara + perkutut = sinom)
Recombinant DNA Technologies
Transformasi
Basic steps in genetic engineering
1. Isolasi gen
2. Insersi ke dalam host menggunakan vector
3. Perbanyak copy DNA sebanyak mungkin
4. Pemisahan produk gen yang dihasilkan
5. Ekstraksi produk gen yang diinginkan
 Fluorescent proteins are a useful tool
in biotechnology
Menjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein target dalam sel-sel
hidup suatu organisme

Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein (GFP) pertama kali diisolasi
dari Victoria aequorea (ubur-ubur), dapat dilekatkan ke hampir semua protein dan yang
menarik dan masih dapat menjadi fluorescent molecule.

Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya belum di-karakterisasi

untuk memvisualisasikan dan melacak protein untuk lebih memahami peristiwa selular.

Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan

 Hewan Transgenik
Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem kekebalan tubuh dan
penyakit genetik

Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk transplantasi

Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin

 Organisme rekombinan

Tanaman tahan hama

jagung (gen toksin dari Bacillus thuringiensis
yang dapat membunuh serangga)
Tanaman tomat
Golden rice (beta-carotene)
Plant-based vaccines
 Genetically Modified Organisms

Tanaman tahan hama

Jagung Bt (mengandung gen toksin dari Bacillus
thuringiensis yang membunuh hama)
Golden rice (mengandung beta-carotene)
Tanaman sebagai vaksin
 Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn)
Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants

Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying

insecticide
Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila
memakan jagung
 Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanaman
Golden Rice mengandung gen untuk menghasilkan vitamin A

Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti

vitamin A dan precursornya (-carotene).
Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan
penurunan sistem imun tubuh.
HUMAN GENETIC ENGINEERING
Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen dalam sel manusia yang
hidup

Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang disebabkan oleh gen yang
cacat dalam sel paru-paru. Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan
akan sembuh .

Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan gen baru yang diinginkan
ke virus yang diperbolehkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang
memasukkan gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya
HUMAN GENETIC ENGINEERING
"Somatic "genetic engineering
Rekayasa genetika yang menargetkan gen di organ tertentu dan jaringan
tubuh orang yang ada tanpa mempengaruhi gen dalam telur atau sperma.
Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani uji klinis, dengan hasil
yang beragam sampai saat ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat
digunakan dengan efektif
"Germ line" genetic engineering

Rekayasa genetika yang menargetkan gen dalam telur, sperma, atau

embrio sangat awal
Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam tubuh individu yang
dihasilkan, dan diwariskan kepada semua generasi berikutnya

[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body."
The term "germline" refers to the "germ" or "germinal" cells, the eggs
and sperm.
Produk DNA Recombinant untuk terapi
pada manusia

Insulin (diabetics)
Factor VIII (males w/hemophilia A)
Factor IX (hemophilia B)
Human growth hormone
Erythropoietin (anemia)
Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs)
leptin
DESIGNER
BABY
 Kesulitan pada Rekayasa Genetika
Manusia

Inserting gene in correct cells

Inserting gene so it is expressed correctly
Orientation
Regulation
Controlling virus vector
Ethical issues
KLONING GEN
Kloning - definisi
Dari Bahasa Yunani - klon, ranting
Kumpulan turunan suatu individu yang
dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan
replika sebagian atau seluruh makromolekul
(contoh, DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel
somatik induknya serta memiliki identitas
genetik yang sama dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua
identitasnya sama dengan molekul atau sel
penurunnya
Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan
memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan
DNA yang kompleks.
Kloning Gen
Ketika keseluruhan
DNA dari suatu
organisme diekstraksi,
akan diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
Pada kloning gen,
hanya gen (DNA)
tertentu yang diisolasi,
dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)
Tujuan mengklon Gen
Menentukan urutan basa nukleotida penyusun
gen tersebut
Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pengendali gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang
disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada
kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit
bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu,
misalnya memproduksi insulin, ketahanan
terhadap hama, dll.
Sumber DNA untuk diklon
DNA kromosom
cDNA (complementary DNA) yang disintesis
menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR
 Bahan / Alat untuk Mengklon
Enzim endonuklease restriksi
Enzim ligase
Vektors
Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
 Memotong DNA
Menggunakan enzim
endonuklease restriksi
Ujung lengket (sticky ends)
Ujung tumpul (blunt ends)

Penamaan enzim
EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli)
R = strain
I = # of enzyme
Penyambungan (pasting) DNA
Pembentukan ikatan-
H pada ujung-ujung
yang komplemen
(sticky ends)

Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA
Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle)
untuk memasukkan suatu potongan
DNA ke dalam sel agar DNA tersebut
dapat disimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut
 Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang
secara alami dimiliki suatu jasad
Bentuknya benang ganda (double strands DNA,
dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat

dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
Vektor untuk Mengklon
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu
membawa potongan DNA lain ke dalam sel
bila memiliki:
Replikator (origin of replication)
Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi
sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di
dalam daerah replikator atau penanda
Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan
tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk
binatang lain
Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu
enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki
ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA
asing disambung, akan dihasilkan "plasmid
rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel
inang yang sesuai
 Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan
DNA asing dengan orientasi tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA vektor
maupun DNA sumber gen yang dikehendaki
menggunakan dua enzim restriksi yang
berbeda
Vektor untuk Mengklon

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
& YAC (Yeast Artificial Chromosome)
Vektor berupa Plasmid
1. Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
Multiple Cloning Site (MCS)
Vektor berupa Plasmid
 Vektor berupa Plasmid
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran
kecil (< 10kbp)
Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (> 10kbp)
Bakteriofaga (l phage)
Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)
Lengan kiri:
Protein penyusun kepala
& ekor
Lengan kanan:
Sintesis DNA
Pengendalian
Lisis inang
Daerah yang dihilangkan:
integrasi & eksisi
Pengendalian
Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)
 Vektor berupa Bakteriofaga

Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
 Vektor Cosmid
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna
dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)

Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:
Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50
kbp)
Vektor Cosmid
Vektor BAC
Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
parA and parB
mengendalikan agar
hanya terdapat satu
vektor dalam sel
Menggunakan penanda
ketahanan terhadap
KhloramfenikolR
Vecktor YAC
large
inserts

ARS URA3 HIS3

telomere centromere markers telomere
replication
origin

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp

dan dimasukkan ke dalam yeast
 BACs dan YACs
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
Keunggulan:
Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan
ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa
nukleotida total genom
Kelemahan:
Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran
sangat besar
Shuttle Vector
Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang
(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)
Memilih Vektor
Ukuran DNA yang
disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim restriksi
yang tersedia
Jumlah salinan (copy
number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan
Rencana penelitian
selanjutnya
 Cara Mengklon
Isolasi vektor kloning (plasmid
DNA (1)
bacterial) & DNA sumber gen
Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning menggunakan
enzim restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase
 Cara Mengklon DNA (2)
Vektor kloning yang telah
tersisipi potongan DNA
dimasukkan ke dalam sel
inang (transformasi sel
inang)
Penapisan sel pengklon
(dan gen yang
dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon
pembawa gen yang
dikehendaki
Transformasi Sel Inang
Memasukkan plasmid (yang
merupakan vektor yang telah disisipi
gen) ke dalam sel inang
Transformasi
PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan
kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2).
Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri
yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel
bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap
plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli
menjadi kompeten" untuk menerima plasmid .
Transformasi
INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel
E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang
tidak ditambah plasmid digunakan sebagai
kontrol.
Transformasi
KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu
42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya
plasmid menembus membran dan dinding sel.
Transformasi
PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi
untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah
mengalami cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu
generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45
menit)
Transformasi
PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan
ditapis pada medium padat yang mengandung
senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa
oleh plasmid.
Koloni E. coli yang membawa plasmid
dengan penanda gen pendar fluor (pGLO)
E. coli yang Membawa Plasmid pGlo
 Penapisan Klon
Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang digunakan
sebagai penanda, misalnya
Kanamisin
Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid dengan
penanda ketahanan
terhadap Kanamisin(Kanr),
yang di sebelah kiri tidak
memilikinya
Manfaat

Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu

pengetahuan maupun dibidang terapan.

Contoh:
Bidang Kesehatan:

Insulin manusia
telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetis.
Merekdagang: HumulinR

Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk
mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).

Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi
secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri