1.

2 PERAN TEKNOLOGI REKAYASA GENETIKA DALAM PEMBUATAN DAN

PEMANFAATAN ANTIBIOTIKA

Kesehatan merupakan faktor fundamental dari suatu negara yang didukung oleh beberapa
faktor, diantaranya obat dan ketersediannya di masyarakat. Jenis obat yang dibutuhkan bagi
masyarakat Indonesia untuk dikembangkan saat ini adalah dari golongan antibiotik. Data
Kementrian Kesehatan RI (2012) menyebutkan hingga tahun 2011 jenis penyakit infeksi
masih mendominasi urutan teratas, namun ketersediaan obat di Indonesia masih terkendala
dengan mahalnya harga obat akibat ketergantungan impor bahan baku obat yang mencapai
95%. Hal tersebut menjadikan Indonesia belum dapat dikatakan mandiri dalam sektor bahan
baku obat. Upaya mencapai kemandirian bahan baku obat khususnya antibiotik, dapat
dilakukan dengan pembuatan obat semi sintetik yang menggunakan teknologi rekayasa
genetika. (Wiharyanti dkk, 2014).
Tujuan utama pembuatan antibiotika semisintetik dengan metode rekayasa genetika adalah
terwujudnya antibiotika yang stabil sehingga lebih mudah diasorbsi serta lebih sedikit efek
sampingnya, memiliki sifat yang lebih baik dari antibiotik alami serta mengatasi masalah
resistensi mikroba terhadap antibiotika (Muharni,1999).
Teknik pembuatan antibiotik semi sintetik yang paling sering dipakai terkait dengan
pemanfaatan teknologi rekayasa genetika adalah kloning Gen. Kloning gen adalah teknik
untuk memperbanyak gen. Teknik ini dilakukan dengan insersi fragmen DNA rekombinan
melalui suatu pembawa gen berupa plasmid, bakteriofage, dan kosmid. Setelah itu,
pembawa gen diinsersi ke dalam sel inang, kemudian DNA rekombinan diperbanyak
melalui propagasi atau pembelahan organisme inang. Kloning gen juga merupakan tahapan
pertama yang selalu dilakukan dalam penelitian molekuler yang bertujuan untuk
mempelajari karakteristik suatu gen. Kloning gen umumnya dilakukan dengan plasmid.
Plasmid memiliki sisi restriksi yang dapat digunakan untuk kloning gen. Keberhasilan
kloning gen dipengaruhi oleh kecocokan plasmid dengan gen rekombinan dan kecocokan sel
inang dengan plasmid rekombinan. (Susanti & Rento Sri, 2004).

Kloning gen merupakan proses yang digunakan untuk memanipulasi DNA dan kemudian
dikembalikan pada organisme hidup untuk diekspresikan. Teknologi ini memampukan
untuk mengisolasi DNA tertentu dari genom suatu organisme hidup, kemudian
mentransformasinya menggunakan vektor pada suatu inang seperti bakteri Escherichia coli.
Prosedur kloning menurut McLennan et al., (2014) meliputi isolasi plasmid DNA yang
mengandung sekuens yang diinginkan, digesti (cutting) plasmid dengan restriction
endonuclease, pemisahan fragmen dengan elektroforesis, pemurnian DNA target, ligasi
(penyambungan) DNA ke plasmid baru untuk membentuk rekombinan baru, transfer
plasmid yang berhasil disambung ke sel E.coli (Transformasi), seleksi bakteri yang berhasil
menerima plasmid (Transforman) serta analisis plasmid rekombinan. (Langden dkk,2017)

Dalam makalah ini akan dibahas 2 contoh penggunaan rekayasa genetika dalam pembuatan
dan pemanfaatan antibiotika yaitu terkait dengan antibiotik penisilin untuk bakteri gram
positif maupun antibiotik golongan cefalosforin untuk bakteri gram negatif.

1. Kloning Gen pcbC dari Penicillium chrysogenum ke dalam Plasmid pPICZA untuk
Pengembangan Produksi Penisilin G. (Wiharyanti dkk, 2014)
Wiharyanti dkk pada tahun 2014 telah melakukan penelitian tentang pemanfaatan
teknologi rekayasa genetik dalam pembuatan antibiotic penilisin G dengan mebuat
cloning gen pcbC dari Penicillium chrysogenum yang disisipkan ke dalam Plasmid
pPICZA vektor. Gen pcbC adalah salah satu gen yang berperan mengkode produksi
enzim Isopenisilin N Sintase (IPNS) yang berperan dalam proses biosintesis penisilin G.
Gen rekombinan pcbC yang telah terbentuk ini akan ditransformasikan ke dalam bakteri
kompeten E.Coli.
Kloning gen pcbC dari P. chrysogenum dilakukan secara bertahap yaitu ligasi pada
plasmid vektor, transformasi pada E. coli dan seleksi rekombinan yang membawa
plasmid dengan sisipan (insert). Ligasi fragmen gen pcbC ke dalam vektor plasmid
pPICZA dilakukan menggunakan enzim T4 DNA ligase dengan rasio molar 3:1.
Inkubasi dilakukan pada suhu 4oC selama semalam. Hasil ligasi ditransformasi pada
bakteri E. coli TOP 10 F' kompeten. Transformasi menggunakan teknik kejut panas
(heat shock), yaitu dengan perubahan suhu secara mendadak dari inkubasi ice bath ke
waterbath (37oC) selama 2 menit. Bakteri E. coli TOP 10 F' yang telah ditransformasi
dikultur dalam LB (Luria Bertani medium) dan diinkubasi selama 30 menit pada 37oC
dengan kecepatan 150 rpm. Seleksi koloni dilakukan dengan menumbuhkan bakteri
 transforman pada media yang mengandung zeocin. Koloni yang tumbuh merupakan
koloni yang diduga mengandung plasmid rekombinan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa rekombinan berupa fragmen gen pcbC dari P.
chrysogenum yang disisipkan ke dalam plasmid pPICZA telah diperoleh. Analisis
sekuen DNA menggunakan program BLAST menunjukkan bahwa fragmen gen pcbC
tersebut memiliki tingkat homologi yang tinggi (99%) dengan gen pcbC P. chrysogenum
Wisconsin 54-1255 dan P. chrysogenum AS-P-78 yang merupakan pengkode IPNS.
Dengan hasil ini diharapkan gen pcbC P. chrysogenum rekombinan dapat di
kembangkan dalam pembuatan enzim IPNS yang massif dan stabil dalam mendukung
pembuatan antibiotic penisilin G semisintetik.

Gambar Proses cloning gen dari plasmid rekombinan yang ditransformasi lewat
perkembanganbiakan bakteri e coli
2. Peran Mutasi Gen ACYII terhadap Produksi Antibiotik Turunan Sefalosporin Puti
(Mustika Indria & Wibisana Ahmad, 2017).
Antibiotik sefalosporin semisintetik banyak digunakan untuk mengatasi penyakit
infeksi, khususnya yang ditimbulkan oleh bakteri gram negatif. Berbagai jenis antibiotik
semisintetk dapat disintesis menggunakan senyawa asam 7-aminosefalosporanat (7-
ACA) sebagai bahan baku utamanya. Senyawa 7-ACA diperoleh melalui konversi
sefalosporin C, baik yang dilakukan secara kimiawi maupun enzimatis. Konversi
sefalosporin C menjadi 7-ACA secara enzimatis dalam satu langkah melibatkan enzim
sefalosporin asilase. Hingga saat ini, seluruh enzim sefalosporin asilase yang dihasilkan
oleh mikroba wild type hanya mempunyai aktifitas yang tinggi terhadap glutaryl-7-
ACA. Rekayasa genetik terhadap gen pengkode enzim sefalosporin asilase diperlukan
untuk memperoleh enzim rekombinan yang mempunyai aktifitas tinggi terhadap substrat
sefalosporin C.
Produksi 7-ACA yang tinggi melalui rute kimiawi memiliki pengaruh negatif, di
antaranya adalah kebutuhan pelarut organik dan produksi limbah toksik relatif tinggi.
Oleh karena itu, konversi sefalosporin C menjadi 7-ACA secara kimiawi perlahan mulai
digantikan dengan cara enzimatis. Konversi sefalosporin C menjadi 7-ACA secara
enzimatis memiliki beberapa keuntungan, di antaranya ramah lingkungan, konsumsi
energi relatif rendah, dan peralatan yang digunakan lebih sederhana. Konversi
sefalosporin C menjadi 7-ACA secara enzimatis dalam perkembangannya menemukan
banyak hambatan baik dua tahap maupun satu tahap yang menyebabkan keterbatasan
produksi dalam skala industri.
Untuk mengatasi masalah tersebut maka perlu diproduksi enzim sefalosporin C asilase
yang dalam jumlah masif dan stabil dengan melakukan teknik rekayasa genetika. Telah
diterapkan pada upaya peningkatan aktivitas enzim sefalosporin C asilase terhadap
substrat sefalosporin C. Salah satu di antaranya adalah kloning gen pengkode
sefalosporin C asilase dari strain Pseudomonas ke dalam Escherichia coli. Upaya lainnya
adalah melakukan rekayasa gen pengkode sefalosporin C asilase melalui mutasi
kemudian dilakukan kloning ke bakteri E. coli. Gen acyII merupakan gen pengkode
sefalosporin C asilase yang berasal dari spesies Pseudomonas sp. SE83.
Upaya rekayasa gen acyII melalui proses mutasi telah dilakukan untuk mengembangkan
mutan sefalosporin C asilase yang memiliki reaktivitas lebih tinggi terhadap substrat
sefalosporin C dibandingkan gen acyII wild type.

Gambar proses mutasi buatan dari gen pengkode enzim sefalosporin C asilase
Perkembangan rekayasa yang telah dilakukan oleh para peneliti terhadap enzim
sefalosporin C asilase yang melibatkan pemodelan secara in silico, mutasi terarah, error
prone PCR telah memberikan hasil yang menggembirakan. Enzim sefalosporin C asilase
rekombinan yang dihasilkan mempunyai spesifisitas yang meningkat hingga lebih dari
20 kali (spesifik aktifitas yang diperoleh 10 U/mg protein) dengan menggunakan SE83
acyI sebagai gen cetakan dan 4 U/mg protein dengan menggunakan N176 sebagai gen
cetakannya. Meskipun demikian hasil ini masih belum memenuhi persyaratan untuk
aplikasi di industri. Untuk memperoleh enzim sefalosporin C asilase yang sesuai untuk
aplikasi di industri maka diperlukan pendekatan menyeluruh yang meliputi pendekatan
mikrobiologi, bioinformatik (untuk meningkatkan produksi dan memperoleh enzim
sefalosporin C asilase baru menggunakan analisis kemiripan sekuen), rekayasa protein
(untuk meningkatkan karakteristik enzim sefalosporin C asilase dan menghilangkan
inhibisi substrat maupun produk), imobilisasi (untuk memperoleh enzim sefalosporin C
asilase yang dapat digunakan secara berulang dan stabil), dan desain reaktor enzim
(untuk memfasilitasi terjadinya reaksi enzimatis yang sekaligus berfungsi untuk
pemisahan produk).
 DAFTAR PUSTAKA

Wiharyanti dkk, 2014. Kloning Gen pcbC dari Penicillium chrysogenum ke dalam
Plasmid pPICZA untuk Pengembangan Produksi Penisilin G. BIOMA. 16 (1): pp
33-38.
Langden dkk, 2017. TRANSFORMASI DAN KLONING PLASMID PJ804:77539
PADA E.coli TOP’10. Jurnal Biologi. 6 (1): pp 65-70.
Muharni, 1999. Seleksi klon gen Penisilin G Asilase dengan Menggunakan Bakteri
Serratia marcescens. Jurnal Penelitian Sains. 6: pp 26-31.
Susanti elfi & Rento sri, 2004. Kloning Gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp BAC4
Melalui Pembuatan Pustaka Genom ( Gene Cloning of Penicillin V Acylase from
Bacillus sp BAC4 by Genomic Library). B I O D I V E R S I T A S. 5 (1): pp 1-6
Puti Mustika Indria & Wibisana Ahmad, 2017. Peran Mutasi Gen ACYII terhadap
Produksi Antibiotik Turunan Sefalosporin. (The Roles of AcyII Gene Mutations
for Production of Antibiotics Derived From Cephalosporin). Jurnal Bioteknologi
& Biosains Indonesia.4(2): 96-105.